检测叶蝉媒介及其植物寄主中的病毒与唾液蛋白

摘要

本方案展示了如何利用植物寄主来检测叶蝉唾液蛋白以及由叶蝉传播媒介释放的植物病毒蛋白。

摘要

昆虫媒介以水平传播方式传播许多具有重要农业意义的植物病毒。超过一半的植物病毒由具有刺吸式口器的半翅目昆虫传播。在病毒传播过程中，昆虫唾液在病毒-媒介-寄主之间起到桥梁作用，因为唾液可携带病毒，并且昆虫唾液中的蛋白质能够触发或抑制植物寄主的免疫反应。唾液蛋白的鉴定与功能分析正成为虫媒病毒-寄主互作研究领域的新焦点。本实验方案提供了一种利用植物寄主检测叶蝉唾液中蛋白质的系统。该叶蝉媒介 Nephotettettix cincticeps 感染水稻矮缩病毒（RDV）作为示例。由唾液传播的RDV的卵黄原蛋白和主要外层衣壳蛋白P8 N. cincticeps 可在水稻植株中同时被检测到 N. cincticeps 以该方法可检测昆虫取食后暂时保留在植物寄主中的唾液蛋白。该检测体系有望促进半翅目昆虫-病毒-植物或半翅目昆虫-植物互作关系的研究。

引言

节肢动物病毒的媒介-宿主传播模式是生物学研究前沿的一个基本问题。许多具有重要农业意义的植物病毒通过昆虫媒介进行水平传播¹。超过一半的植物病毒由半翅目昆虫传播，包括蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱和蓟马。这些昆虫具有独特的特征，使其能够高效传播植物病毒¹。它们具有刺吸式口器，以韧皮部和木质部的汁液为食，并分泌唾液^1,2,3,4。随着技术的发展与改进，唾液成分的鉴定及其功能分析正成为研究热点。已知的唾液蛋白包含多种酶类，如果胶酯酶、纤维素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、多酚氧化酶和蔗糖酶等^{5,6,7,8,9,10,11,}....

方案

非带毒成虫叶蝉在中国福建农林大学的虫媒病毒研究中心进行繁殖。

1. 非传毒昆虫的饲养

1. 在尺寸为 40 cm × 35 cm × 20 cm（长 × 宽 × 高）的立方体笼中，用稻苗饲养成虫。笼子的一侧需覆盖防虫网以保证通风。
   1. 将带有叶蝉的笼子置于具有内置湿度控制器的培养箱中，温度保持在 26 °C，相对湿度为 60–75%，光照周期为 16 小时光照和 8 小时黑暗。
2. 每周使用吸虫器将所有成虫从原笼中轻柔转移至含有新鲜稻苗的新笼中。
   1. 让超过 200 头成虫在稻苗中交配并产卵。
   2. 保留原来的稻苗，以便若虫孵化。将这些新孵化的非带毒若虫饲养至二龄阶段。

2. 病毒获取与带毒昆虫的采集

1. 使用吸虫器将2龄非带毒若虫小心转移至玻璃培养管（直径2.5 cm，高15 cm）中，饥饿处理1–2小时。
   1. 将若虫释放到一个笼子中，笼内放置一株种植在花盆中的RDV感染水稻植株。
   2. 让若虫在感染的水稻植株上取食2天。
      注意：小心浇水，避免冲走若虫。2龄若虫体长约1.6–2 mm。
2. 将这些若虫小心转移至另一个新笼子中，笼内含有新鲜的无病毒水....

结果

图1 展示了本方案中的所有步骤：昆虫饲养、病毒获取以及唾液蛋白的收集 通过 水稻取食及蛋白质印迹实验。蛋白质印迹结果显示，在用抗Vg抗体孵育的膜上，取食水稻的昆虫样品及其唾液腺中均观察到特异且预期大小约为220 kDa的条带；相比之下，未取食水稻的样品中未观察到条带。该结果表明 图2 表明Vg作为唾液蛋白被释放到植物寄主中。在用抗RDV P8抗体孵育的膜上，也在经取食处理的水稻样品及带毒昆虫体内观察到一条大小约46 kDa的特异且预期的条带。相比之下，未取食的水稻样品和非带毒叶蝉体内均未观察到条带，如图所示 图3该结果证明，病毒蛋白也可在饲喂植物中被检测到。

讨论

刺吸式昆虫的唾液腺直接分泌的唾液具有关键作用，因为它可对寄主组织进行预消化和解毒，并将跨越生物界别的生物学因子传递至寄主体内^1,3,4。这些跨界的生物学因子包括激发子、效应子以及小分子RNA，在昆虫与寄主之间的通讯过程中至关重要^14,15,16。因此，揭示更多种类及功能的唾液成分将有助于深入理解昆虫与寄主之间的相互关系。本文提供了一种在植物寄主中检测唾液蛋白的系统，可为进一步研究唾液蛋白在植物寄主中的功能提供支持。

本方案提供了通过采集取食植物来检测具刺吸式口器叶蝉唾液蛋白的技术。为获得最佳且可靠的结果，需注意以下几个关键点：（1）感染水稻植株中的病毒载量至关重要。水稻植株中的病毒滴度直接影响昆虫对病毒的获毒效率.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Tris 碱	罗氏	D609K69032	5对于×Tris-甘氨酸缓冲液和10×TBS 缓冲液配制
甘氨酸	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	5对于×Tris-甘氨酸缓冲液的配制
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	SLCB4394	5对于×Tris-甘氨酸缓冲液的配制
NaCl	国药集团化学试剂有限公司	10019318	对于10×TBS 缓冲液配制
KCl	国药集团化学试剂有限公司	10016318	对于10×TBS 缓冲液配制
ß-巯基乙醇	Xiya Reagent	B14492	对于4× 蛋白样品缓冲液制备
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	SHBL3668	4 对于× 蛋白样品缓冲液制备
甘油	国药集团化学试剂有限公司	10010618	对于4× 蛋白样品缓冲液制备
甲醇	国药集团化学试剂有限公司	10014118	用于转移缓冲液的制备
Tween 20	Coolaber SCIENCE&技术	CT30111220	用于TBST溶液的配制
脱脂奶粉	Becton.Dickinso and company	252038	用于膜封闭和抗体稀释
山羊抗兔IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	一抗的识别
ECL Western试剂盒	赛默飞世尔科技	32209	化学发光底物
硝酸纤维素膜	Pall Corporation	25312915	用于蛋白质转移
缓冲液与溶液
缓冲液	成分		评论/描述
5×Tris-甘氨酸缓冲液	15.1 g Tris 碱 94 g 甘氨酸  5 g SDS 溶于 1 L 无菌水中		储备液
1×Tris-甘氨酸缓冲液	200 mL 的 5×Tris-甘氨酸缓冲液 800 mL 无菌水		SDS-PAGE工作液
10×Tris缓冲盐水（TBS）缓冲液	80 g NaCl 30 g Tris 碱 2 g KCl 在 1 L 无菌水中		储备液
含吐温20的TBS（TBST）溶液	100 mL 10×TBS 溶液 3 mL Tween 20 900 mL 无菌水		工作溶液
4× 蛋白样品缓冲液	8 g SDS 4 mL ß-巯基乙醇 0.02 g 溴酚蓝 40 mL 甘油 在40 mL 0.1 M Tris-HCl（pH 6.8）中		用于蛋白质提取
转移缓冲液	800 mL Tris-甘氨酸缓冲液 200 mL 甲醇		用于蛋白质转移
仪器
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	SHBL3668	用于4倍蛋白上样缓冲液的制备
恒温培养箱	宁波赛夫实验仪器有限公司	PRX-1200B	用于饲养叶蝉
电泳	塔农科学 & Technology Co., Ltd.	Tanon EP300	用于 SDS-PAGE
电泳转印核心模块	BIO-RAD	1703935	用于 SDS-PAGE
甘油	国药集团化学试剂有限公司	10010618	用于4倍蛋白上样缓冲液的制备
甘氨酸	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	用于5倍Tris-甘氨酸缓冲液的配制
山羊抗兔 IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	一抗的识别
高通量组织研磨仪	上海精欣工业发展有限公司	JXFSIPRP-24	用于研磨植物组织
KCl	国药集团化学试剂有限公司	10016318	用于10倍TBS缓冲液的配制
甲醇	国药集团化学试剂有限公司	10014118	用于转移缓冲液的配制
微型湿热转移槽	BIO-RAD	1703930	用于 SDS-PAGE
NaCl	国药集团化学试剂有限公司	10019318	用于10倍TBS缓冲液的配制
硝酸纤维素膜	Pall Corporation	25312915	用于蛋白质转移
脱脂奶粉	Becton.Dickinso and company	252038	用于膜封闭和抗体稀释
Pierce ECL Western 试剂盒	ThermoFisher Scientific	32209	化学发光底物
蛋白质显色仪	GE Healthcare bio-sciences AB	Amersham lmager 600	用于检测蛋白质
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	SLCB4394	用于5×Tris-甘氨酸缓冲液的配制
Tris 碱	罗氏	D609K69032	5× Tris-甘氨酸缓冲液和10×TBS 缓冲液配制
Tween 20	Coolaber SCIENCE&技术	CT30111220	用于 TBST 溶液的配制
垂直板电泳槽	BIO-RAD	1658001	用于 SDS-PAGE
水浴	上海晶宏实验设备有限公司	XMTD-8222	煮沸蛋白质样品
β-巯基乙醇	Xiya Reagent	B14492	用于4倍蛋白上样缓冲液的制备