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方法文章

检测叶蝉媒介及其植物寄主中的病毒与唾液蛋白

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DOI：

10.3791/63020

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2021年9月14日

 ,  ,  , 
1Vector-borne Virus Research Center, Fujian Province Key Laboratory of Plant Virology, Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University

本文内容

摘要

本方案展示了如何利用植物寄主来检测叶蝉唾液蛋白以及由叶蝉传播媒介释放的植物病毒蛋白。

摘要

昆虫媒介以水平传播方式传播许多具有重要农业意义的植物病毒。超过一半的植物病毒由具有刺吸式口器的半翅目昆虫传播。在病毒传播过程中，昆虫唾液在病毒-媒介-寄主之间起到桥梁作用，因为唾液可携带病毒，并且昆虫唾液中的蛋白质能够触发或抑制植物寄主的免疫反应。唾液蛋白的鉴定与功能分析正成为虫媒病毒-寄主互作研究领域的新焦点。本实验方案提供了一种利用植物寄主检测叶蝉唾液中蛋白质的系统。该叶蝉媒介 Nephotettettix cincticeps 感染水稻矮缩病毒（RDV）作为示例。由唾液传播的RDV的卵黄原蛋白和主要外层衣壳蛋白P8 N. cincticeps 可在水稻植株中同时被检测到 N. cincticeps 以该方法可检测昆虫取食后暂时保留在植物寄主中的唾液蛋白。该检测体系有望促进半翅目昆虫-病毒-植物或半翅目昆虫-植物互作关系的研究。

引言

节肢动物病毒的媒介-宿主传播模式是生物学研究前沿的一个基本问题。许多具有重要农业意义的植物病毒通过昆虫媒介进行水平传播1。超过一半的植物病毒由半翅目昆虫传播，包括蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱和蓟马。这些昆虫具有独特的特征，使其能够高效传播植物病毒1。它们具有刺吸式口器，以韧皮部和木质部的汁液为食，并分泌唾液1,2,3,4。随着技术的发展与改进，唾液成分的鉴定及其功能分析正成为研究热点。已知的唾液蛋白包含多种酶类，如果胶酯酶、纤维素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、多酚氧化酶和蔗糖酶等5,6,7,8,9,10,11,12,13。唾液中的蛋白质还包括可触发宿主防御反应的激发子，从而影响昆虫的表现；以及抑制宿主防御的效应子，可增强昆虫的适应性，还有诱导宿主产生病理反应的组分14,15,16,17。因此，唾液蛋白是昆虫与宿主之间交流的重要物质。在病毒传播过程中，带毒的刺吸式口器昆虫的唾液腺所分泌的唾液也含有病毒蛋白。病毒组分借助唾液流动从昆虫传播至植物宿主。因此，昆虫唾液构成了病毒-媒介-宿主三者间三营养级相互作用的桥梁。研究带毒昆虫分泌的唾液蛋白的生物学功能，有助于深入理解病毒-媒介-宿主之间的关系。

据报道，蚊子的唾液可介导西尼罗病毒（WNV）和登革病毒（DENV）的传播与致病性。唾液蛋白AaSG34可促进2型登革病毒的复制与传播，而唾液蛋白AaVA-1可通过激活自噬促进DENV和寨卡病毒（ZIKV）的传播。18,19蚊子的唾液蛋白D7可抑制登革病毒（DENV）感染 体外 和 体内通过 与DENV病毒颗粒及重组DENV包膜蛋白的直接相互作用20在植物病毒中，菜豆金色花叶病毒属的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）可诱导烟粉虱唾液蛋白Bsp9的表达，该蛋白通过抑制植物宿主WRKY33介导的免疫反应，增强烟粉虱的偏好性和适应性，从而促进病毒的传播。21由于关于昆虫唾液蛋白在植物寄主中作用的研究滞后于在动物寄主中的研究，因此迫切需要建立一种稳定且可靠的系统，以检测植物寄主中的唾液蛋白。

已知水稻矮缩病毒（rice dwarf virus, RDV）由叶蝉传播 Nephotettix cincticeps （半翅目：叶蝉科）高效且以持续增殖方式22,23RDV 首次被报道由昆虫媒介传播，并在亚洲引起水稻严重病害24,25病毒颗粒呈二十面体、双层球形结构，外层含有P8外衣壳蛋白。22RDV 在介体中的循回传播期 N. cincticeps 是14天26,27,28,29,30当水稻矮缩病毒（RDV）到达唾液腺时，病毒粒子被释放到唾液腺内的唾液储存腔中 通过 类似胞吐作用的机制23卵黄原蛋白（Vg）是雌性昆虫卵母细胞发育所必需的卵黄蛋白前体31,32,33大多数昆虫物种至少有一种6-7 kb的Vg转录本，编码一种分子量约为220 kDa的前体蛋白。Vg的蛋白前体通常可被切割为一个大亚基（140至190 kDa）和一个小亚基（<50 kDa）片段进入卵巢之前18,19先前的蛋白质组学分析揭示了叶蝉分泌的唾液中存在源自Vg的肽段 Recilia dorsalis，尽管其功能尚不明确（未发表数据）。最新报道指出，褐飞虱通过口部分泌的Vg可作为效应子，破坏植物的防御机制34。目前尚不清楚Vg是否 N. cincticeps 也可能随着唾液流动释放到植物寄主体内，从而在植物体内干扰植物的防御反应。为了探究是否 N. cincticeps 利用唾液蛋白（如Vg）来抑制或激活植物防御反应，第一步是鉴定在取食过程中释放到植物体内的蛋白质。了解鉴定植物体内唾液蛋白的方法，对于阐明唾液蛋白的功能以及半翅目昆虫与植物之间的相互作用具有重要意义。

在本方案中，以N. cincticeps为例，介绍了一种通过昆虫取食过程检测植物寄主中是否存在唾液蛋白的方法。该方案主要详细描述了唾液蛋白的收集与检测步骤，对大多数半翅目昆虫的进一步研究具有参考价值。

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方案

非带毒成虫叶蝉在中国福建农林大学的虫媒病毒研究中心进行繁殖。

1. 非传毒昆虫的饲养

  1. 在尺寸为 40 cm × 35 cm × 20 cm（长 × 宽 × 高）的立方体笼中，用稻苗饲养成虫。笼子的一侧需覆盖防虫网以保证通风。
    1. 将带有叶蝉的笼子置于具有内置湿度控制器的培养箱中，温度保持在 26 °C，相对湿度为 60–75%，光照周期为 16 小时光照和 8 小时黑暗。
  2. 每周使用吸虫器将所有成虫从原笼中轻柔转移至含有新鲜稻苗的新笼中。
    1. 让超过 200 头成虫在稻苗中交配并产卵。
    2. 保留原来的稻苗，以便若虫孵化。将这些新孵化的非带毒若虫饲养至二龄阶段。

2. 病毒获取与带毒昆虫的采集

  1. 使用吸虫器将2龄非带毒若虫小心转移至玻璃培养管（直径2.5 cm，高15 cm）中，饥饿处理1–2小时。
    1. 将若虫释放到一个笼子中，笼内放置一株种植在花盆中的RDV感染水稻植株。
    2. 让若虫在感染的水稻植株上取食2天。
      注意：小心浇水，避免冲走若虫。2龄若虫体长约1.6–2 mm。
  2. 将这些若虫小心转移至另一个新笼子中，笼内含有新鲜的无病毒水稻幼苗，环境相对湿度为60–75%，光照周期为16小时光照、8小时黑暗。让若虫在感染的水稻植株上取食12天，以完成RDV的循环传播期。

3. 使用饲喂笼收集唾液蛋白

  1. 准备五个小型管状饲喂笼（直径2.5 cm，高4 cm），其中一端用防虫网覆盖。
  2. 将15–20只叶蝉 confinement 于每个饲喂笼中，然后用一块薄泡沫垫覆盖笼子的另一端。
    1. 用胶带将一株水稻幼苗（高5–6 cm）固定在笼子末端与泡沫垫之间。确保饲喂笼内的叶蝉能够取食暴露在笼内空间的水稻幼苗。
  3. 将幼苗根部浸入水中，以维持水稻植株存活。让叶蝉取食2天。
  4. 从饲喂笼中移除叶蝉，并采集其取食过的水稻幼苗。剪去幼苗位于笼外的部分，收集幼苗的取食区域。
    ​注意：若不立即用于检测，该样品最多可在-80 °C保存3个月。

4. 试剂准备

  1. 将 15.1 g Tris 碱、94 g 甘氨酸和 5 g SDS 溶解于 1 L 无菌水中，配制 5×Tris-甘氨酸缓冲液。取 200 mL 5×Tris-甘氨酸缓冲液与 800 mL 无菌水混合，配制 1×Tris-甘氨酸缓冲液（缓冲液成分见表 1）。
  2. 将 80 g NaCl、30 g Tris 碱和 2 g KCl 溶解于 1 L 无菌水中，配制 10×Tris 缓冲盐水（TBS）缓冲液。在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。
  3. 将 8 g SDS、4 mL ß-巯基乙醇、0.02 g 溴酚蓝和 40 mL 甘油溶解于 40 mL 0.1 M Tris-HCl（pH 6.8）中，配制 4×蛋白样品缓冲液。
  4. 将 800 mL Tris-甘氨酸缓冲液与 200 mL 甲醇混合，配制转膜缓冲液。
  5. 将 100 mL 10×TBS 溶液和 3 mL Tween 20 加入 900 mL 无菌水中，配制含 Tween 20 的 TBS 缓冲液（TBST）。

5. 检测唾液和病毒蛋白的蛋白质印迹法

  1. 取0.1 g水稻样品，加入液氮研磨至组织成为粉末。向样品中加入200 µL 4x蛋白上样缓冲液，煮沸10分钟。在室温下以12,000 × g 离心10分钟。
    1. 移除上清液并转移至新的离心管中。取10 µL样品加入SDS-PAGE凝胶中，在Tris-甘氨酸缓冲液中以150 V电泳45–60分钟。
      注意：离心后的残渣可丢弃。
  2. 将0.45 µm硝酸纤维素膜及其他转膜夹层材料放入转膜缓冲液中浸泡30分钟。
    注意：此步骤可在凝胶电泳完成前进行。
  3. 将凝胶夹入转膜夹心中，在转膜缓冲液中以100 V转膜90–120分钟。
  4. 取出膜后置于含7%脱脂奶粉的TBST封闭液中，室温封闭20分钟。将针对RDV P8或Vg的特异性一抗按适当比例加入7%脱脂奶粉的TBST溶液中，与膜在室温孵育2小时或4℃过夜。
  5. 用TBST缓冲液洗涤膜三次，每次5分钟。
  6. 将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗加入含7%脱脂奶粉的TBST溶液中，室温孵育60–90分钟。
  7. 用TBST缓冲液洗涤膜三次，每次5分钟。
  8. 使用ECL Western检测试剂盒进行化学发光检测。取试剂盒中的检测试剂1和试剂2按1:1比例在离心管中混合均匀，将混合液加至膜上，室温孵育5分钟。
  9. 去除多余试剂，拍摄化学发光信号图像，并进行叠加分析，以观察蛋白条带形成的蛋白分子量标准曲线（蛋白ladder）。

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结果

图1 展示了本方案中的所有步骤：昆虫饲养、病毒获取以及唾液蛋白的收集 通过 水稻取食及蛋白质印迹检测。蛋白质印迹结果显示，在用抗Vg抗体孵育的膜上，取食水稻的昆虫样品及其唾液腺中均观察到特异且预期大小约为220 kDa的条带；相比之下，未取食水稻的样品中未观察到条带。该结果表明 图2 表明Vg作为唾液蛋白被释放到植物寄主中。在用抗RDV P8抗体孵育的膜上，也在经带毒昆虫取食的水稻样品及带毒叶蝉虫体样品中观察到一条大小约46 kDa的特异且预期的条带。相比之下，未取食的水稻样品和非带毒叶蝉虫体中均未观察到条带，如图所示 图3该结果证明病毒蛋白也可在饲喂植物中被检测到。

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讨论

刺吸式昆虫的唾液腺直接分泌的唾液具有关键作用，因为它可对寄主组织进行预消化和解毒，并将跨越生物界别的生物学因子传递至寄主体内1,3,4。这些跨界的生物学因子包括激发子、效应子以及小分子RNA，在昆虫与寄主之间的通讯过程中至关重要14,15,16。因此，揭示更多种类及功能的唾液成分将有助于深入理解昆虫与寄主之间的相互关系。本文提供了一种在植物寄主中检测唾液蛋白的系统，可为进一步研究唾液蛋白在植物寄主中的功能提供支持。

本方案提供了通过采集取食植物来检测具刺吸式口器叶蝉唾液蛋白的技术。为获得最佳且可靠的结果，需注意以下几个关键点：（1）感染水稻植株中的病毒载量至关重要。水稻植株中的病毒滴度直接影响昆虫对病毒的获毒效率...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（31772124 和 31972239）以及福建农林大学（资助号 KSYLX014）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
Tris 碱罗氏D609K690325对于×Tris-甘氨酸缓冲液和10×TBS 缓冲液配制
甘氨酸Sigma-AldrichWXBD0677V5对于×Tris-甘氨酸缓冲液的配制
十二烷基硫酸钠Sigma-AldrichSLCB43945对于×Tris-甘氨酸缓冲液的配制
NaCl国药集团化学试剂有限公司10019318对于10×TBS 缓冲液配制
KCl国药集团化学试剂有限公司10016318对于10×TBS 缓冲液配制
ß-巯基乙醇Xiya ReagentB14492对于4× 蛋白样品缓冲液制备
溴酚蓝Sigma-AldrichSHBL36684 对于× 蛋白样品缓冲液制备
甘油国药集团化学试剂有限公司10010618对于4× 蛋白样品缓冲液制备
甲醇国药集团化学试剂有限公司10014118用于转移缓冲液的制备
Tween 20Coolaber SCIENCE&技术CT30111220用于TBST溶液的配制
脱脂奶粉Becton.Dickinso and company252038用于膜封闭和抗体稀释
山羊抗兔IgGSangon BiotechD110058-0001一抗的识别
ECL Western试剂盒赛默飞世尔科技32209化学发光底物
硝酸纤维素膜Pall Corporation25312915用于蛋白质转移
缓冲液与溶液
缓冲液成分评论/描述
 5×Tris-甘氨酸缓冲液15.1 g Tris 碱
94 g 甘氨酸
 5 g SDS 溶于 1 L 无菌水中		 储备液
1×Tris-甘氨酸缓冲液200 mL 的 5×Tris-甘氨酸缓冲液
800 mL 无菌水		SDS-PAGE工作液
10×Tris缓冲盐水（TBS）缓冲液80 g NaCl
30 g Tris 碱
2 g KCl
在 1 L 无菌水中		储备液
含吐温20的TBS（TBST）溶液100 mL 10×TBS 溶液
3 mL Tween 20
900 mL 无菌水		工作溶液
4× 蛋白样品缓冲液8 g SDS
4 mL ß-巯基乙醇
0.02 g 溴酚蓝
40 mL 甘油
在40 mL 0.1 M Tris-HCl（pH 6.8）中		用于蛋白质提取
转移缓冲液800 mL Tris-甘氨酸缓冲液
200 mL 甲醇		用于蛋白质转移
仪器
溴酚蓝Sigma-AldrichSHBL3668用于4倍蛋白上样缓冲液的制备
恒温培养箱宁波赛夫实验仪器有限公司PRX-1200B用于饲养叶蝉
电泳塔农科学 & Technology Co., Ltd.Tanon EP300用于 SDS-PAGE
电泳转印核心模块BIO-RAD1703935用于 SDS-PAGE
甘油国药集团化学试剂有限公司10010618用于4倍蛋白上样缓冲液的制备
甘氨酸Sigma-AldrichWXBD0677V用于5倍Tris-甘氨酸缓冲液的配制
山羊抗兔 IgGSangon BiotechD110058-0001一抗的识别
高通量组织研磨仪上海精欣工业发展有限公司JXFSIPRP-24用于研磨植物组织
KCl国药集团化学试剂有限公司10016318用于10倍TBS缓冲液的配制
甲醇国药集团化学试剂有限公司10014118用于转移缓冲液的配制
微型湿热转移槽BIO-RAD1703930用于 SDS-PAGE
NaCl国药集团化学试剂有限公司10019318用于10倍TBS缓冲液的配制
硝酸纤维素膜Pall Corporation25312915用于蛋白质转移
脱脂奶粉Becton.Dickinso and company252038用于膜封闭和抗体稀释
Pierce ECL Western 试剂盒ThermoFisher Scientific32209化学发光底物
蛋白质显色仪GE Healthcare bio-sciences ABAmersham lmager 600用于检测蛋白质
十二烷基硫酸钠Sigma-AldrichSLCB4394用于5×Tris-甘氨酸缓冲液的配制
Tris 碱罗氏D609K690325× Tris-甘氨酸缓冲液和10×TBS 缓冲液配制
Tween 20Coolaber SCIENCE&技术CT30111220用于 TBST 溶液的配制
垂直板电泳槽BIO-RAD1658001用于 SDS-PAGE
水浴上海晶宏实验设备有限公司XMTD-8222煮沸蛋白质样品
β-巯基乙醇Xiya ReagentB14492用于4倍蛋白上样缓冲液的制备

参考文献

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