片上结晶与室温大规模连续衍射

摘要

本文介绍了如何在晶上晶装置上设置蛋白质结晶，以及如何利用芯片结晶平台在室温下进行自动化的序列数据收集。

摘要

通过展示蛋白质在不同功能状态之间的转变，可以更好地理解生化反应和生物过程。由于低温条件不符合生理状态，可能会阻碍、抑制甚至改变蛋白质的结构动态，因此迫切需要一种能够在室温下进行常规X射线衍射实验的可靠方法。本实验方案中使用的晶体-晶体装置及其配套硬件和软件旨在实现无需任何样品操作即可对不同尺寸的蛋白质晶体进行原位（in situ）室温X射线衍射。本文介绍了从装置组装、芯片上结晶、光学扫描、晶体识别到X射线曝光规划及自动化数据采集等关键步骤的实验流程。由于该平台无需晶体 harvesting 或其他任何形式的样品操作，因此可在程序化和高通量模式下将芯片上生长的数百至数千个蛋白质晶体依次引入X射线束中。

引言

由于X射线辐射具有电离效应，在过去三十年中，蛋白质晶体学在很大程度上局限于低温条件下的研究。因此，目前对蛋白质在发挥功能过程中分子运动的认识，主要来源于在低温条件下观测到的不同状态的静态结构之间的比较。然而，低温不可避免地会阻碍生化反应的进行或不同构象状态之间的相互转换，而这些过程正是蛋白质分子发挥功能时所必需的。为了通过晶体学手段在原子分辨率上直接观察蛋白质的结构动态变化，亟需建立稳定且常规的室温衍射实验方法，这要求在样品输送、数据采集以及后续数据分析等方面实现技术革新。为此，近年来发展的序列晶体学（serial crystallography）为在室温下捕捉中间态及短寿命结构物种的分子图像提供了新的途径。^1,2,3与……相比，截然不同 "单晶单数据集" 串行晶体学采用了一种与单颗粒冷冻电镜类似的数据收集策略，该策略在传统冷冻晶体学中被广泛应用。具体而言，串行晶体学的实验数据来自大量独立样品的微小数据片段，随后通过密集的数据处理，对这些数据片段进行评估并整合为完整的数据集，用于三维结构的解析。⁴。这一点 "一次一晶体" 通过“衍射先于破坏”策略，有效缓解室温下X射线辐射对蛋白质晶体的损伤⁵.

由于序列晶体学需要大量蛋白质晶体才能完成一个数据集，因此对于蛋白质样品有限和/或涉及精细晶体操作的许多生物系统而言，这构成了重大的技术挑战。另一个重要考虑因素是在序列衍射实验中如何最佳地保持晶体完整性。 原位 衍射方法通过让蛋白质晶体在其生长位置直接发生衍射，且不破坏结晶腔室的密封性，从而解决了上述问题^6,7,8,9这些无需手动操作的方法天然适用于大规模序列衍射。我们近期报道了一种用于结晶的装置的设计与实现 原位 基于晶体-晶体概念的衍射——蛋白质晶体直接生长在单晶石英上¹¹。这一点 "晶对晶" 该装置具有多项优势。首先，其采用单晶石英基底制成X射线和可见光透明窗口，背景散射极低，因而可获得蛋白质晶体衍射图像的优异信噪比。其次，单晶石英具有与玻璃相当的优异阻隔水汽性能，可为蛋白质结晶提供稳定的环境。相比之下，采用聚合物基底的其他结晶装置由于聚合物材料具有透汽性，容易发生干燥，除非使用较厚的聚合物材料，但后者会显著增加背景散射¹⁰第三，该装置能够在无需任何晶体操作或挑取的情况下，将大量蛋白质晶体递送至X射线束中，这对于保持晶体完整性至关重要。¹¹.

为简化使用晶体-晶体装置的连续X射线衍射实验，我们开发了一种衍射仪原型，可方便地在光学扫描和X射线衍射模式之间切换¹²该衍射仪体积小巧，已在中国台湾阿贡国家实验室先进光子源（APS）的两条光束线站上用于序列数据采集。具体而言，我们使用BioCARS 14-ID-B进行劳厄衍射，使用LS-CAT 21-ID-D进行单色振荡衍射。如果同步辐射或X射线自由电子激光光束线具备以下两项关键功能，则无需使用该衍射仪硬件：（1）配备电动样品定位系统，可在所有方向上围绕X射线束在±12 mm范围内移动；（2）配备轴上数字相机，可在对所研究的蛋白质晶体安全的光照条件下观察晶体。单晶石英装置连同便携式衍射仪，以及用于光学扫描、晶体识别和自动化的控制软件 原位 数据采集共同构成了用于序列晶体学的inSituX平台。尽管该技术的开发主要受其使用多色X射线源进行动态晶体学应用的推动，但我们已展示了该技术在支持单色振荡方法方面的潜力^10,12通过自动化，该平台可在室温下以较低的蛋白质消耗实现高通量的连续数据采集。

本文详细介绍了如何在湿实验室内建立芯片上结晶系统，以及如何利用inSituX平台在同步辐射光束线上进行连续X射线数据采集。

批量法可用于在与相同蛋白质样品的悬滴气相扩散法相似的条件下，在芯片上进行结晶（表1）。作为起始条件，我们建议使用沉淀剂的浓度为气相扩散法所用浓度的1.2–1.5倍。如有必要，可通过精细网格筛选进一步优化批量结晶条件。优化实验无需使用石英晶片，可改用玻璃盖玻片（见下文）。建议使用部分加载的结晶装置，以缩小优化实验的规模。已有多种蛋白质样品利用该装置通过批量法成功实现结晶¹⁰（表1）。

该装置本身由以下部分组成：1）一个外环；2）两片石英晶片；3）一个垫圈状的塑料或不锈钢垫片；4）一个固定环；5）显微镜浸油作为密封剂（图1）。加载到一个芯片上的结晶溶液体积总量取决于实验目的。通过选择不同厚度和/或内径的垫片，可调节结晶室的容量。我们通常使用厚度为50–100 μm的垫片，组装成容量为10–20 µL的结晶装置。一种典型的装置可产生数十至数千颗适合进行序列数据收集的蛋白质晶体（图2）。

若操作成功，芯片上的结晶过程将在每个石英装置上生成数十至数百甚至数千个可用于X射线衍射的蛋白质晶体。在同步辐射光束线上，该装置通过运动学机制安装在衍射仪的三轴平移台上。对已安装装置的结晶窗口进行光学扫描，获得数十至数百张显微图像。这些显微图像随后被拼接成一幅高分辨率的全景图像。对于光敏性晶体，可在红外光（IR）下进行光学扫描，以避免意外的光激活。我们已开发出一种计算机视觉软件，用于识别并定位随机分布在装置上的蛋白质晶体。这些晶体将根据其尺寸、形状和位置进行排序，以指导或优化串行晶体学中的数据采集策略。例如，可在每个目标晶体上设定单次或多次照射。用户可规划对目标晶体的一次性扫描或多次路径采集。我们已实现多种行进路径的计算软件。例如，采用解决旅行商问题的算法来计算最短路径¹³。对于泵浦-探测动态晶体学应用，可选择激光（泵浦）与X射线（探测）脉冲的时序和持续时间。自动化的串行数据采集程序可依次将每个目标晶体移入X射线束中。

原位X射线衍射仪的关键组件包括：1）样品装置支架；2）三轴平移台；3）用于光学扫描的光源；4）X射线光束挡板；5）若研究光敏蛋白，则配备泵浦激光器；6）配备对红外敏感相机的树莓派微型计算机；7）控制软件，用于同步电机、相机、光源、泵浦激光器，并与光束线控制系统进行交互。

方案

1. 设备预组装

1. 在外部环（直径 30 mm）上标记样品编号。如有需要，可包括项目名称、设备编号、结晶条件和日期（图 1A）。将外部环倒置放在洁净的表面上（图 1B），然后小心地将一片石英晶片放入环内（图 1C）。此第一片石英晶片作为入射X射线的入口窗口。
2. 取少量显微镜浸油（黏度为 150 cSt）倒入培养皿中。将垫片浸入油中，确保其两面均均匀涂覆浸油（图 1D）。通过将垫片轻触洁净表面以去除多余油分。
3. 将涂油的垫片放置在第一片石英晶片上方（图 1E）。
   ​注意：浸油是一种优良的密封剂，可防止结晶腔室发生潜在的溶剂挥发。正确组装的芯片通常可保持数周而不出现明显干燥。此预组装步骤在普通光照条件下进行。对于光敏感样品，所有后续步骤（包括样品加载、设备储存和观察）均须在安全光照条件下进行。

2. 样品加载与装置组装

1. 使用移液器在第一片石英晶片上充分混合蛋白质溶液和结晶缓冲液。蛋白质样品与缓冲液的体积比通常在 2:1 至 1:2 之间（图 1F）。确保结晶溶液的总体积不超过由垫片尺寸和厚度决定的结晶腔室的最大容量。混合过程中避免产生气泡。
   注意：结晶缓冲液的组成因实验而异。结晶条件请参见 Table 1。
2. 当混合溶液开始铺展时，将第二片石英晶片覆盖在溶液上（图 1G）。该第二片石英晶片作为衍射 X 射线的 出射窗口。
3. 轻轻敲击第二片石英晶片的边缘，以帮助油层铺展并排出空气。通过将固定环旋入外环来固定装置（图 1H）。必要时可使用紧固工具（图 1I）。注意过度拧紧可能导致脆弱的石英晶片变形甚至破裂。

3. 设备储存与结晶优化

1. 将组装好的装置（图1J）存放于室温下的盒子中，或置于具有温度控制的培养箱内。
   注意：蛋白质晶体可能在组装结晶装置后的数小时至数天内出现。图2（图2）展示了数个代表性蛋白质样品在芯片上结晶的典型结果。
2. 通过显微镜观察结晶装置，监测晶体生长情况。如有必要，可通过重复第1-3节的操作迭代优化结晶条件。

4. 校准

注意：下文各节中提到的程序和命令均在 inSituX 软件中运行。

1. 将一块掺杂的钇铝石榴石薄晶体安装在芯片支架上（图3）。安装光束挡板。通过运行以下程序获取直射X射线的X射线荧光图像：
   burnmark.py <device>.param
   其中 <device> 是用户为结晶装置选定的名称。<device>.param 是一个包含装置特定控制参数的文件名。默认值将在本实验方案中逐步被具体值替代。一个示例 <device>.param 文件见于补充文件1。
2. 通过运行光束轮廓拟合程序，确定直射X射线束的精确位置：
   beam.py <burn image> -d <device>
   其中 <burn image> 是X射线荧光图像的文件名（图4）。
   注：该程序可计算出精确的直射光束位置以及光束尺寸。光束位置将作为来自同一装置的所有晶体的平移目标位置。光束尺寸也用于靶区规划。

5. 光学扫描

1. 将结晶装置放入芯片架中，并使用拇指螺丝固定装置（图3A）。
2. 通过运动学机构将芯片架安装到衍射仪的平移台上（图3B）。
3. 为从装置的光学窗口拍摄显微图像，安装合适的光源。可根据蛋白质样品的光敏感性及实验目的，选择使用白光、红外光或其他光源。
4. 运行扫描程序：
   scan.py <device>.param
   该程序会采集一组显微图像，并自动传输至指定的用户计算机。
5. 在用户计算机上运行拼接程序：
   tile.py <device> -x <x> -y <y>
   其中 <x> 和 <y> 分别为显微图像列位移和行位移的初始值。该程序将所有显微图像拼接成一幅分辨率为1–3 μm/像素的全景图（图5）。
   注意：步骤5.4和5.5通常需要几分钟。显微图像的总数根据扫描区域和放大倍数的不同，范围从几十到数百张不等。
6. 运行晶体识别程序：
   findX.py <montage> -c <length> <width> -w <wedge> -x <beam size>
   其中 <montage> 为拼接后的图像。该程序执行晶体识别与打靶规划。<length> 和 <width> 表示待识别晶体的尺寸。若用户希望排除较小的晶体，可将 <width> 设为截断值，即设定一个大于不希望检测的小晶体尺寸的数值。<wedge> 为角度值，用于设定不规则形状晶体的容差范围。<beam size> 指的是通过前述轮廓拟合获得的直射光束尺寸（步骤4.2；图4）。此外，用户也可设置一个标称值，以进一步增大目标打靶点之间的间距。这些关键参数可实现特定晶体的选择与靶点规划（图6）。

6. X射线衍射

1. 移除光源并安装光束挡板。设置合适的探测器距离。遵循光束线安全规程进入X射线屏蔽室。打开X射线快门，如有需要，同时打开激光快门。
2. 运行用于序列衍射数据采集的程序：
   collect.py <device>.param -l <light duration>
   该命令将启动数据采集，按照预设程序依次访问所有计划的照射点。每个目标晶体将被移至光束位置（步骤4.2）。在每个停留点，按预定的时间延迟进行X射线曝光，可选择是否同时进行激光激发。视频1展示了以1 Hz频率运行的自动化数据采集序列。通常情况下，单个结晶化装置可采集数十至数百张衍射图像（视频2）。
   注意：第4节的校准和第5节的光学扫描在inSituX平台中是独立完整的模块，因此可完全迁移至其他光束线。第6节X射线衍射部分则需结合具体光束线的操作细节。

结果

过去几年中已发表多个代表性数据集^10,12 以及来自多种蛋白质样品（包括光感受器蛋白和酶）的晶体学结果和科学发现，例如植物紫外光-B光感受器UVR8、光驱动DNA修复光解酶PhrB¹⁰一种来自多结构域感受组氨酸激酶的新型远红光感应蛋白¹⁴配体/光双传感器结构域以及细菌光敏色素的光感受核心模块¹²作为代表性结果，我们列出了这些蛋白质在芯片上的结晶条件 表1， 并与用于蒸汽扩散法的条件直接比较。本文展示了芯片上结晶的另外四个案例研究（图2）以及一系列 原位 电影中的衍射图样（视频 2）。代表性 原位 使用本方案收集的数据集汇总于 表 2.

讨论

在早期，室温下的蛋白质晶体学研究因难以克服X射线辐射损伤而面临巨大困难。因此，随着同步辐射X射线源的广泛应用，更为稳定的低温晶体学方法逐渐取代了室温方法²⁰。近年来，随着X射线自由电子激光技术的出现，室温蛋白质晶体学重新受到关注，许多新进展均源于在生理相关温度下观测蛋白质结构动态变化的需求^2,21。基于“晶体对晶体”装置开发的inSituX平台正是出于同样的目标，即建立常规且稳健的室温动态晶体学研究数据收集方法。这种自动化的序列X射线衍射方法同样适用于那些难以冷冻的蛋白质晶体的静态结构测定¹⁴。在本实验方案中，我们介绍了使用该平台进行室温数据收集所需的关键技术考量及关键操作步骤。该方法特别适用于对机械操作、X射线辐射损伤或空气暴露敏感的脆弱蛋白质晶体。

该平台原型已在美国阿贡国家实验室先进光子源（APS）的两条蛋白质晶体学光束线上进行了广泛测试。尽管按照本方案建立芯片上结...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分析软件	自主开发
铈掺杂钇铝石榴石	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12，YAG单晶衬底
芯片夹具	自主开发
控制软件	自主开发
浸油	Cargille Laboratories	16482	A型低粘度 150 cSt
inSituX平台	自主开发
红外光源	Thorlabs Incorporated	LED1085L	带玻璃透镜的LED，1085 nm，5 mW，TO-18
显微镜	Zeiss		SteREO Discovery V8
外环	自主开发
培养皿	Fisher Scientific	FB0875713
移液器	Pipetman	F167380	P10
泵浦激光器	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm，400 mW，Ø9 mm，E针编码，激光二极管
Raspberry Pi	Raspberry Pi Foundation
固定环	Thorlabs Incorporated	SM1RR	用于Ø1"透镜管和安装座的SM1固定环
无籽石英晶体	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	直径25.4 mm，Z切，厚度0.05 mm，双面抛光，-X轴方向偏移8 mm
垫片	自主开发
X射线光束挡板	自主开发