针对寄生性线虫粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）和鼠类圆线虫（Strongyloides ratti）的功能基因组学工具包包括转基因技术、CRISPR/Cas9介导的诱变以及RNA干扰技术。本实验方案将演示如何通过性腺内显微注射法，将转基因元件和CRISPR组分导入粪类圆线虫（S. stercoralis）和鼠类圆线虫（S. ratti）中。
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摘要
摘要
钩口线虫属（Strongyloides）包含多种可穿透皮肤的线虫，其宿主范围各异，其中包括粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）和鼠类圆线虫（Strongyloides ratti）。S. stercoralis 是一种感染人类的寄生性皮肤穿透线虫，全球约有6.1亿人受其感染；而鼠类寄生虫 S. ratti 与 S. stercoralis 亲缘关系密切，常被用作研究 S. stercoralis 的实验室模型。通过性腺内显微注射外源核酸的技术，S. stercoralis 和 S. ratti 均易于实现转基因和基因敲除，因此已成为其他尚无法应用该技术的寄生性蠕虫的研究模型体系。
寄生性Strongyloides成虫栖居于宿主的小肠内，并通过粪便将子代释放到环境中。进入环境后，幼虫发育为自由生活的成虫，这些成虫生活在粪便中，并产生必须寻找并侵入新宿主的子代。这种环境世代为Strongyloides物种所特有，其形态与模式自由生活线虫Caenorhabditis elegans高度相似，因此针对C. elegans开发的技术可被改造后用于这些寄生性线虫，包括性腺内显微注射技术。通过性腺内显微注射，可将多种外源转基因导入Strongyloides。此外，也可通过显微注射CRISPR/Cas9组分来创制突变型Strongyloides幼虫。本文详细描述了对Strongyloides进行性腺内显微注射的技术，包括自由生活成虫的准备、注射操作步骤以及转基因子代的筛选方法。文中还展示了利用CRISPR/Cas9诱变技术获得的转基因Strongyloides幼虫图像。本论文的目的是帮助其他研究人员利用显微注射技术创制转基因和突变型Strongyloides。
引言
Strongyloides stercoralis 与更广为人知的钩虫和蛔虫 Ascaris lumbricoides 相比，长期以来一直被忽视，未被视为重要的人类病原体1。 以往对蠕虫负荷的研究常常严重低估了 S. stercoralis 的流行率，原因是常用诊断方法对 S. stercoralis 的敏感性较低2。近年来，基于改进诊断工具的流行病学研究估计，S. stercoralis 感染的真实流行率远高于以往报道，全球约有 6.1 亿人感染2。
S. stercoralis 和其他 Strongyloides 物种（包括亲缘关系相近的大鼠寄生虫及常用的实验室模式生物 S. ratti）具有独特的生命周期，这一特性有利于开展实验性基因组学研究，因其生命周期中包含寄生世代和自由生活（环境）世代3（图1）。具体而言，S. stercoralis 和 S. ratti 均可经历一个单代的自由生活阶段。该自由生活世代由宿主排出后的寄生后....
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方案
注意：使用沙鼠传代粪类圆线虫（S. stercoralis），使用大鼠传代类鼠圆线虫（S. ratti）。所有实验操作均经加州大学洛杉矶分校动物研究监督办公室批准（方案编号：2011-060-21A），该机构遵循AAALAC标准及《实验动物护理与使用指南》。以下操作必须在显微注射前至少一天完成：线虫培养、制备显微注射垫、构建显微注射用质粒、在6 cm线虫生长培养基（NGM）平板上涂布大肠杆菌（E. coli HB101）8。自由生活的雌虫自粪便中收集后，需在25 °C条件下培养至少24小时，发育为年轻成虫后方可进行显微注射。显微注射垫必须完全干燥。细菌平板需充分干燥并形成较小的菌苔。
1. 显微注射载玻片的准备：注射前至少一天进行
注意：线虫被放置在带有干燥琼脂垫的显微注射盖玻片上进行注射。
- 将加热块预热至 90 °C。
- 向一个硼硅酸盐玻璃管中加入 5 mL 去离子水（ddH2O），然后加入 100 mg 琼脂糖。
- 将玻璃管置于火焰上加热，直至琼脂糖完全溶解。
- 将玻璃管放入设定为 90 °C 的加热块中，以保持琼脂糖处于液态。
- 使用玻璃巴斯德吸管或带塑料吸头的移液器，吸取约 180 µL 琼脂糖溶....
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结果
如果实验成功，F1 幼虫将表达目标转基因和/或突变表型（图4）。然而，转化率具有高度变异性，取决于所用构建体、线虫的健康状况、注射后的培养条件以及实验人员的技术水平。通常情况下，一次成功的实验将获得 >15 F1 每只注射雌虫的幼虫数及转化率 >3%用于荧光标记。如果每只雌虫产生的存活后代平均少于10条幼虫，则可能表明该构建体具有毒性，导致转基因幼虫无法存活。观察到大量荧光卵但无荧光幼虫是注射混合物可能存在毒性的另一迹象。初次学习该技术时，建议使用表达效果良好的构建体，例如 act-2::mRFPmars, 在体壁肌中驱动强烈表达13 (图4).
在通过CRISPR/Cas9介导的靶向诱变产生突变体时，建议使用包含act-2::mRFPmars或act-2::GFP转基因的修复模板
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讨论
本显微注射方案详细介绍了将转基因构建体以及CRISPR/Cas9介导的诱变构建体导入粪类圆线虫（S. stercoralis）和鼠类圆线虫（S. ratti）的方法。对于粪类圆线虫（S. stercoralis）和鼠类圆线虫（S. ratti）而言，注射后的存活率以及转基因或诱变效率均受多种可优化调节的因素影响。
成功进行转基因的首要关键因素是质粒转基因的构建方式。先前的研究发现，外源转基因在 粪类圆线虫 需要使用 粪类圆线虫 5' 启动子和 3' 非翻译区元件3,13,19. 与……类似 秀丽隐杆线虫 构建体， 粪类圆线虫 构建体通常使用基因特异性启动子和一个常见的3'非翻译区（UTR），例如来自 Ss-e.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
pPV540 和 pPV402 是由宾夕法尼亚大学的 James Lok 博士慷慨赠送的。我们感谢 Astra Bryant 对手稿提出的有益意见。本研究由布罗德-韦尔奇基金会传染病发病机制研究者奖、霍华德·休斯医学研究所教员学者奖以及美国国立卫生研究院 R01 DC017959 项目（E.A.H.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (−)-尼古丁，≥99%（GC），液体 | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | 用于麻痹线虫的尼古丁 |
| 3" 铁制C型夹，3" x 2"（容量 x 深度） | VWR | 470121-790 | 用于将装置固定在实验台面上的C型夹 |
| 低电渗琼脂糖（Agarose LE） | Phenix | RBA-500 | 用于载玻片的琼脂糖 |
| 骨炭，4磅桶装，10 x 28目 | Ebonex | n/a | 用于粪便-炭培养的活性炭 |
| 骨炭，颗粒状，10 x 28目 | Reade | bonechar10x28 | 用于粪便培养的活性炭（上述产品的替代品） |
| 粗调微操作器 | Narishige | MMN-1 | 粗调微操作器 |
| Corning Costar Spin-X 离心管滤器 | Fisher | 07-200-385 | 微型滤柱 |
| 盖玻片，48 x 60 mm，1号厚度 | Brain Research Lab | 4860-1 | 盖玻片（48 x 60 mm） |
| 深型培养皿，加厚型，带6个通气孔，直径100 mm | VWR | 82050-918 | 10 cm 培养皿（用于粪便-炭培养） |
| Eisco 带杆铁架台底座 | Fisher | 12-000-101 | Baermann 装置用支架 |
| Eppendorf FemtoJet 显微注射器微加载吸头 | VWR | 89009-310 | 用于填充显微注射针头 |
| Fisherbrand 吸水垫巾 | Fisher | 14-206-62 | 实验台纸（用于样品制备） |
| Fisherbrand 铸铁环 | Fisher | 14-050CQ | Baermann 装置用O型环 |
| Fisherbrand 三角形聚丙烯烧杯 | Fisher | 14-955-111F | 塑料烧杯（用于混合） |
| Fisherbrand 三角形聚丙烯烧杯 | Fisher | 14-955-111F | 塑料烧杯（用于接液桶/水桶） |
| Fisherbrand 三角形聚丙烯烧杯 | Fisher | 14-955-111F | 塑料烧杯（x2）（用于制作支架） |
| 注射器装Gorilla环氧树脂 | McMaster-Carr | 7541A51 | 胶水（用于连接管路） |
| 卤代烃油700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | 卤代烃油 |
| 食品饮料级耐高温硅橡胶管，内径1/2"，外径5/8" | McMaster-Carr | 3038K24 | 管路（用于漏斗） |
| KIMAX 长颈漏斗，60° 角，Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann 漏斗 |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 实验台保护垫 | Fisher | 15-235-101 | 实验台纸（用于样品制备） |
| 带荧光功能的Leica体视显微镜 | Leica | M165 FC | 用于鉴定和分选转基因线虫的GFP体视显微镜 |
| microINJECTOR 黄铜直臂针夹 | Tritech | MINJ-4 | 显微注射针夹 |
| microINJECTOR 系统 | Tritech | MINJ-1 | 显微注射系统 |
| 蒙古沙鼠 | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | 用于维持粪类圆线虫（S. stercoralis）的沙鼠，雄性，4–6周龄 |
| Nasco Whirl-Pak 易封袋，18盎司 | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak 样品袋 |
| 尼龙网纱（网状） | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | Baermann 支架用尼龙网 |
| 铂丝，36号规格，每英寸 | Thomas Scientific | 1233S72 | 用于制作线虫挑取针的铂/铱合金丝 |
| Puritan 压舌板，152 mm（长）x 17.5 mm（宽） | VWR | 62505-007 | 木棒（用于混合样品） |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（250次） | QIAGEN | 27106 | QIAGEN 质粒小提试剂盒 |
| 大鼠-Long Evans品系 | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | 用于维持类圆线虫（S. ratti）的大鼠，雌性，4–6周龄 |
| 大鼠-Sprague Dawley品系 | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | 用于维持类圆线虫（S. ratti）的大鼠，雌性，4–6周龄 |
| Really Useful Boxes 半透明带盖储物盒，容量1.6 L，尺寸7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | 用于加湿培养室的塑料盒 |
| Shepherd 技术板，8 x 16.5英寸 | Newco | 999589 | 技术板 |
| 不锈钢抬高式金属网底板 | Ancare | R20SSRWF | 金属网笼底 |
| StalkMarket 可降解餐具勺，6"，白色，每包1000个 | Office Depot | 9587303 | 勺子 |
| Stender 培养皿，叠放式，37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | 表面皿（小型，圆形） |
| 体视显微镜 | Motic | K-400 LED | 解剖制备用体视显微镜 |
| 储物箱，透明/白色，外部高度4-7/8英寸，外部长度13-5/8英寸，Sterilite品牌 | Grainger | 53GN16 | 用于加湿培养室的塑料盒 |
| Sutter P-30 微量移液管拉制仪 | Sutter | P-30/P | 带铂/铱丝加热丝的针头拉制仪 |
| Syracuse 表面皿 | Fisher | S34826 | 表面皿（大型，圆形） |
| Thermo Scientific Castaloy 固定角度夹具 | Fisher | 05-769-2Q | 漏斗夹具（2个） |
| 三轴悬挂式操纵杆油压微操作器 | Narishige | MM0-4 | 精细微操作器 |
| United Mohr 压夹钳 | Fisher | S99422 | 压夹钳（2个） |
| 带通气孔的锐边培养皿（直径60 mm） | Tritech Research | T3308P | 6 cm 培养皿（用于小规模粪便-炭培养） |
| VWR 轻型擦拭纸 | VWR | 82003-820 | Baermann 支架内衬 |
| 表面皿，方形，1-5/8英寸 | Carolina (Science) | 742300 | 表面皿（小型，方形） |
| Whatman 定性滤纸圆片，1号等级，直径5.5 cm | Fisher | 09-805B | 滤纸（用于6 cm 培养皿） |
| Whatman 定性滤纸圆片，1号等级，直径9 cm | Fisher | 09-805D | 滤纸（用于10 cm 培养皿） |
| World Precision Instrument 硼硅酸盐玻璃毛细管，1.2 mm x 4英寸 | Fisher | 50-821-813 | 用于显微注射针头的玻璃毛细管 |
| X-Acto 刀具，1号刀柄配11号刀片 | Office Depot | 238816 | 无刀片的X-Acto刀具，用于固定线虫挑针 |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | 倒置显微镜 |
参考文献
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).
- Buonfrate, D., et al.
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