通过显微注射在类 圆线虫 物种中产生转基因和敲除

Summary

寄生线虫 类圆线 虫粪类和大 鼠类圆线 虫的功能基因组工具包包括转基因、CRISPR/Cas9 介导的诱变和 RNAi。该协议将演示如何使用性腺内显微注射将转基因和CRISPR成分引入 粪类猪笼草 和 鼠李糖杆菌中。

Abstract

类圆线虫属由多种具有不同宿主范围的穿透皮肤线虫组成，包括粪类圆线虫和大鼠类圆线虫。S. stercoralis是一种人类寄生虫，穿透皮肤的线虫，感染约6.1亿人，而大鼠寄生虫S. ratti与粪类S. stercoralis密切相关，通常用作粪类菌丝虫的实验室模型。S. stercoralis和S. ratti都很容易通过性内显微注射的外源核酸递送技术产生转基因和敲除，因此，已经成为其他尚未适应该技术的寄生蠕虫的模型系统。

寄生 类圆线虫 成虫栖息在宿主的小肠中，并通过粪便将后代释放到环境中。一旦进入环境，幼虫就会发育成自由生活的成虫，它们生活在粪便中并产生必须找到并入侵新宿主的后代。这种环境生成是 类圆线虫 物种所独有的，在形态上与自由生活线虫 秀丽隐杆线虫 模型足够相似，为 秀丽隐杆线虫 开发的技术可以适应与这些寄生线虫一起使用，包括性腺内显微注射。使用性腺内显微注射，可以将各种各样的转基因引入类 圆线虫中。CRISPR / Cas9组分也可以显微注射以产生突变 的圆线虫 幼虫。这里，描述了性腺内显微注射到 类圆线虫的技术， 包括自由生活成人的制备，注射程序和转基因后代的选择。包括使用CRISPR / Cas9诱变产生的转基因 类圆线虫 幼虫的图像。本文的目的是使其他研究人员能够使用显微注射来产生转基因和突变 的类圆线虫。

Introduction

与更广泛认可的钩虫和蛔虫蛔虫相比，类粪类圆线虫长期以来一直被忽视为一种重要的人类病原体。以前对蠕虫负担的研究往往严重低估了粪类链球菌的患病率，因为粪类疟原虫的常见诊断方法的敏感性较低 ².近年来，基于改进的诊断工具的流行病学研究估计，粪类菌感染的真实患病率远高于先前报告的，全世界约有6.1亿人²。

S. stercoralis和其他类圆线虫物种，包括密切相关的大鼠寄生虫和常见的实验室模型S. ratti，都有一个不寻常的生命周期，对实验基因组研究有利，因为它由寄生和自由生活（环境）^第3代组成（图1）。具体来说，S. stercoralis和S. ratti都可以通过单一的自由生活世代循环。自由生活的一代由后寄生虫幼虫组成，这些幼虫发育成自由生活的成年雄性和雌性;自由生活的成虫的所有后代都发育成感染性幼虫，必须感染宿主才能继续生命周期。此外，这种环境或自由生活的一代可以在实验室中通过实验操纵。由于自由生活的类圆线虫成虫....

Protocol

注意:沙鼠用于通过 S. stercoralis，大鼠用于通过 S. ratti。所有程序均由加州大学洛杉矶分校动物研究监督办公室（协议编号2011-060-21A）批准，该办公室符合AAALAC标准和实验室动物护理和使用指南。以下任务必须在显微注射前至少一天完成:蠕虫培养，制备显微注射垫，为显微注射混合物创建结构，以及将细菌（大肠杆菌 HB101）扩散到6厘米线虫生长培养基（NGM）平板⁸上。自由生活的雌性需要在25°C下收集粪便后至少24小时才能发育成年轻人，然后才能进行显微注射。显微注射垫必须完全干燥。细菌板必须干燥并建立小草坪。

1.显微注射载玻片的制备:注射前至少一天

注意:蠕虫安装在带有干燥琼脂垫的显微注射盖玻片上。

1. 将加热块设置为90°C。
2. 加入5mL ddH₂O，然后将100mg琼脂糖加入硼硅酸盐玻璃管中。
3. 在火焰上加热管中的琼脂糖混合物，直到琼脂糖溶解。
4. 将管置于90°C的加热块中，以保持琼脂糖处于液态。
5. 使用玻璃巴斯德移液管或带有塑料吸头的移液管将约180μL琼脂糖溶液滴到盖玻片上。立即在上面放上第二个盖玻片，将琼脂糖压平成薄垫。
6. 5-10秒后，通过将顶部盖玻片....

Results

如果实验成功，F₁ 幼虫将表达感兴趣的转基因和/或突变表型（图4）。然而，转化率变化很大，取决于结构，蠕虫的健康状况，注射后培养条件和实验者的技能。一般来说，成功的实验将产生每只注射雌性>_{15 F 1} 幼虫，荧光标记物的转化率为>3%。如果活的后代总数平均少于10只幼虫/雌性，那么该结构可能是有毒的，并且转化的幼虫无法存活。发现大量荧光卵但没有发现荧光幼虫是另一个迹象，表明注射混合物可能是有毒的。首次学习该技术时，建议使用表达良好的结构，例如 act-2::mRFPmars， 它驱动体壁肌肉¹³ 中的稳健表达（图4）。

当通过CRISPR / Cas9介导的靶向诱变生成突变体时，建议使用包含 act-2::mRFPmars 或 act-2::GFP 转基因¹³ .......

Discussion

该显微注射方案详细介绍了将转基因结构和CRISPR / Cas9介导的诱变引入 粪类链球菌 和 鼠李糖杆菌的方法。 对于粪 类葡萄球菌 和 鼠李松，注射后存活率和转基因或诱变率受制于几个可以微调的变量。

成功转基因的第一个关键考虑因素是如何构建质粒转基因。以前的研究发现，类 圆线虫 中外源转基因的表达需要使用 类圆线虫 5'启动子和3'UTR元素^3，13，19。与 秀丽隐杆线虫 构建体类似， 类圆线虫 构建体通常使用基因特异性启动子和常见的3'UTR，例如来自 Ss-era-1 基因¹³的启动子。编码区域的密码子优化对于类 圆线虫的表达也很重要。最近，Wild Worm C.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
（−）-尼古丁，≥99% （GC），液体	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	尼古丁，用于麻痹蠕虫
3 英寸铁 C 型夹，3 英寸 x 2 英寸（容量 x 深度）	VWR	470121-790	C 型夹，用于将设置固定到工作台上
用于载玻片的琼脂糖 LE	Phenix	RBA-500	琼脂糖
骨炭，4 磅桶，10 x 28 目	Ebonex	n/a	木炭，用于粪炭培养
骨炭，颗粒，10 x 28 目	Reade	bonechar10x28	木炭，用于粪便培养（替代上述）
粗显微作器	Narishige	MMN-1	粗显微作器
康宁 Costar Spin-X 离心管过滤器	Fisher	07-200-385	微滤柱
盖玻片，48 x 60 mm，1 号厚度	脑研究实验室	4860-1	盖玻片（48 x 60 毫米）
深培养皿，重型，带 6 个通气孔，直径 100 毫米	VWR	82050-918	10 厘米培养皿（用于粪炭培养）
Eisco 蒸馏器底座，带杆	Fisher	12-000-101	贝尔曼仪支架
Eppendorf FemtoJet 显微注射器微量进样器吸头	VWR	89009-310	用于充填显微注射针
Fisherbrand 吸水底垫	Fisher	14-206-62	工作台纸（用于制备）
Fisherbrand 铸铁环	Fisher	14-050CQ	贝尔曼 O 形圈
Fisherbrand 三角聚丙烯烧杯	Fisher	14-955-111F	塑料烧杯（用于混合）
Fisherbrand 三角聚丙烯烧杯	Fisher	14-955-111F	塑料烧杯（用于集水桶/水桶）
Fisherbrand 三角聚丙烯烧杯	Fisher	14-955-111F	塑料烧杯 （x2）（用于制作支架）
注射器中的大猩猩环氧树脂	McMaster-Carr	7541A51	胶水（用于连接管道）
卤烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	卤烃油
食品和饮料用高温硅橡胶管，1/2" 内径，5/8" 外径	McMaster-Carr	3038K24	管（用于漏斗）
KIMAX 漏斗，长杆，60 度;Angle， Kimble Chase	VWR	89001-414	Baermann 漏斗
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 台式保护器	Fisher	15-235-101	工作台纸（用于制备）
徕卡荧光立体显微镜	Leica	M165 FC	GFP 立体显微镜，用于识别和分拣转基因蠕虫
microINJECTOR 黄铜直臂针架	Tritech	MINJ-4	显微注射针架
显微注射器系统	Tritech	MINJ-1	显微注射系统
蒙古沙鼠	Charles River Laboratories	213-蒙古沙鼠	用于维护粪类沙鼠，雄性 4-6 周
Nasco Whirl-Pak 易封袋，18 盎司	VWR	11216-776	Whirl-Pak 样品袋
尼龙薄纱（网眼）	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	用于 Baermann 支架的尼龙网
铂金丝，每英寸 36 号，每英寸	Thomas Scientific	1233S72	铂金/铱丝 用于蜗杆
清教徒压舌板，152 毫米（长）x 17.5 毫米（宽）	VWR	62505-007	木棒（用于混合样品）
QIAprep 离心小量制备试剂盒 （250）	QIAGEN	27106	QIAGEN 小量制备试剂盒
大鼠-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu：LE Long Evans	大鼠，用于维持 S. ratti，雌性 4-6 周
大鼠-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd：Sprague Dawley SD	大鼠，用于维持 S. ratti，雌性 4-6 周
真正有用的盒子 半透明储物盒带盖，1.6 升容量，7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	办公仓库	452369	塑料盒，用于加湿室
Shepherd 技术板，8 x 16.5 英寸	Newco	999589	技术板
不锈钢凸起的铁丝地板	Ancare	R20SSRWF	铁丝笼底部
StalkMarket 可堆肥餐具勺子，6 英寸，白色，1,000 个装	Office Depot	9587303	勺
Stender 盘子，堆叠式，37 x 25 毫米	Carolina （Science）	741012	手表眼镜（小，圆形）
立体显微镜	Motic	K-400 LED	解剖准备镜
储物袋，颜色透明/白色，外部高度4-7/8英寸，外部长度13-5/8英寸，Sterilite	Grainger	53GN16	加湿室塑料盒
Sutter P-30 微量移液器拉拔器	Sutter	P-30/P	铂/铱丝拔针器
Syracuse 手表眼镜	Fisher	S34826	手表眼镜（大、圆形）
Thermo Scientific Castaloy 固定角夹具	Fisher	05-769-2Q	漏斗夹具 （2x）
三轴悬挂纵杆油液压显微作器	Narishige	MM0-4	精细显微作器
United Mohr 夹管夹具	Fisher	S99422	夹管夹 （2x）
通风、锋利边缘培养皿（直径 60 毫米）	Tritech研究	T3308P	6 cm 培养皿（用于小规模粪炭培养）
VWR 轻型纸巾擦拭器	VWR	82003-820	用于 Baermann 支架
手表玻璃的衬里，方形，1-5/8 英寸	卡罗来纳州（科学）	742300	手表眼镜（小，方形）
Whatman 定性等级普通圆圈，1 级，直径 5.5 厘米	Fisher	09-805B	滤纸（用于 6 厘米培养皿培养皿）
Whatman 定性级普通圆圈，1 级，直径 9 cm	Fisher	09-805D	滤纸（用于 10 cm 培养皿）
World Precision Instrument 硼硅酸盐玻璃毛细管，1.2 mm x 4 in	Fisher	50-821-813	用于显微注射针的玻璃毛细管
X-Acto 刀，1 号刀，带 11 号刀片	Office Depot	238816	X-Acto 刀，无刀片，用于固定蜗杆镐
蔡司 AxioObserver A1	蔡司	n/a	倒置显微镜