使用聚焦离子束扫描电子显微镜数据对薄亚细胞神经元结构进行 3D 重建和分析

Summary

一种灵活的方法学管道，使用用户友好的开源软件包来识别、可视化和量化聚焦离子束扫描电子显微镜图像体积内的薄亚细胞神经元过程。

Abstract

扫描电子显微镜技术的最新进展现在允许对超薄亚细胞过程进行快速三维 （3D） 分析。在这里，提出了一种方法学管道来识别、可视化和分析薄神经元过程，例如投射到其他神经元突触前钮扣（称为"棘"）中的过程。使用免费提供的软件包，该协议演示了如何使用决策树使用聚焦离子束扫描电子显微镜 （FIB-SEM） 图像体积内的形态学标准来识别常见的神经元亚细胞结构，特别注意识别投射到突触前钮扣中的棘叶的多样性。特别是，该协议描述了如何追踪神经元突触内的棘突，以产生这些薄的亚细胞投影、它们的亲代神经突和突触后伴侣的 3D 重建。此外，该协议还包括一个用于分析 FIB-SEM 数据的免费开源软件程序列表，并提供了改进 3D 重建以进行可视化和发布的技巧（例如，平滑、照明）。这种适应性强的协议为 FIB-SEM 图像体积内亚细胞结构的快速纳米级分析提供了一个切入点。

Introduction

对纳米薄亚细胞成分的结构-功能关系的研究通常受益于 3D 可视化和分析¹。然而，由于必须使用金刚石刀切割和对齐成百上千个 ≥40 nm 连续超薄切片，因此连续截面透射电子显微镜研究在时间和空间上受到限制。这些限制限制了对薄（直径 <40 nm）亚细胞结构进行采样和有效分析的能力，并且精通超薄连续切片的必要性阻碍了 3D 结构分析的应用 ^2,3。然而，聚焦离子束扫描电子显微镜 （FIB-SEM） 的最新进展彻底改变了可获得图像体积的速度和分辨率，现在可以定量分析薄的亚细胞结构，例如光滑的内质网 ^4,5、神经元突触 ^3,6 和突触囊泡 ^7,8大规模。此外，FIB-SEM 图像卷的广泛使用加速了可免费访问的 FIB-SEM 图像卷存储库⁹ 和 3D 分析软件（例如，Espina^....

Protocol

1. 图像体积数据和亚细胞物体大小:注意事项和配准

1. 获得包含感兴趣亚细胞对象的感兴趣区域的高质量 FIB-SEM 图像体积。
   注意:该协议使用来自晚期青少年雪貂初级视觉皮层（24.2 x 16.2 x 2.4 μm，4 nm 各向同性体素）的 FIB-SEM 图像体积片段，以及来自成年大鼠 CA1 海马体（10.2 x 7.7 x 5.3 μm;5 nm 各向同性体素）的可自由访问的 FIB-SEM 体积由 Knott 实验室 （https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/）。使用保留超微结构细节并在 FIB-SEM 成像条件下产生高对比度的方案为 FIB-SEM 准备组织块至关重要^23,24。重要的是，应对组织进行成像，使生成的 FIB-SEM 图像体素分辨率×感兴趣的最小亚细胞结构的直径大小<0.5。例如，由于棘突突出到突触前钮扣的部位直径可以小至 30 nm，因此 <15 nm 的体素大小对于高于奈奎斯特标准的这些结构进行采样是合适的。此外，以各向同性（所有维度相等）分辨率（例如，5 x 5 x 5 nm 体素）对组织进行成像也很有用，以便能够在所有 x/y/z 平面上具有相同维度的精细结构进行可视化和重建。
2. 下载并安装 ImageJ

Results

量化雪貂初级视觉皮层中兴奋性突触前钮扣种群中突触棘的百分比
尽管几十年来已经观察到从神经突到兴奋性突触前钮扣的棘状突起^19,26，^但它们对突触功能的潜在重要性仍然不清楚。这些实验旨在确定雪貂初级视觉皮层 （V1） 中整个出生后发育过程中包含棘突的兴奋性突触前钮扣的比例，以确定棘突对突触功能与发育里程碑的潜在重要性。因此，从出生后第 21 天 （p） 21 （15.1 x 14.1x 2.8 μm）、p46 （9.7 x 8.4 x 2.7 μm）、p60 （24.2 x 16.2 x 2.4 μm） 和 >p90 （24.2 x 16.2 x 2.4 μm） 雪貂 V1 获取对齐的 4 nm/体素各向同性 FIB-SEM 图像体积，使用 FEI Helios 660 DualBeam FIB-SEM 以 52° 倾斜度成像， 反向散射模式下 4.2 mm 工作距离、3 kV 加速电压和 400 pA 电流。尽管堆栈在采集时与 FEI 软件大致对齐，但所有堆栈都使用斐济进行亚像.......

Discussion

该 FIB-SEM 图像体积分析管道可以产生可靠的 3D 重建和薄亚细胞结构的定量测量。虽然目前使用深度神经网络和分割算法的半自动化技术可以提高在大图像量中重建具有相对高膜对比度的细胞结构的速度和效率³³，但许多亚细胞结构（例如，棘状、光滑内质网、内体）由于膜对比度和/或迂曲度较低，仍然难以使用自动化方法进行可靠捕获， 尽管较新的方法已经开始捕获更高对比度的线粒体和粗面内质网^34,35。此外，未标记的亚细胞结构之间的细微区别（例如，网格蛋白介导的内吞作用与带有网格蛋白涂层尖端的棘，或内体与内质网）将需要对任何自动重建技术进行反复的手动校对³⁶。因此，该协议详细说明了在开始分析 FIB-SEM 图像中的亚细胞结构之前建立明确亚细胞物体阳性识别标准的重要性。

为了实现这些目的，熟悉特定亚细胞结构在一系列随机切.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
斐济 （ImageJ）			https://imagej.net/software/fiji/downloads
重建			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https：/www.blender.org