一种灵活的方法学流程，利用用户友好的开源软件包，在聚焦离子束扫描电子显微镜图像数据中识别、可视化并定量分析纤细的亚细胞神经元突起。
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本文内容
摘要
摘要
扫描电子显微镜技术的最新进展使得对超薄亚细胞结构进行快速三维（3D）分析成为可能。本文介绍了一种方法学流程，用于识别、可视化和分析细小的神经元突起，例如伸入其他神经元突触前末梢的结构（称为“突触小芽”或“spinules”）。利用免费开源的软件工具，本方案展示了如何在聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）图像数据中，基于形态学标准构建决策树，以识别常见的神经元亚细胞结构，并特别关注识别伸入突触前末梢的多种类型的突触小芽。具体而言，本方案详细描述了如何在神经元突触内追踪突触小芽，从而实现对这些细小亚细胞突起、其母体神经突以及突触后伙伴的三维重建。此外，本方案还提供了一份可用于分析FIB-SEM数据的免费开源软件列表，并给出了若干提升三维重建质量以用于可视化和发表的实用建议（如平滑处理、光照设置等）。这一可灵活调整的方案为在FIB-SEM图像数据中快速开展纳米尺度下亚细胞结构的分析提供了入门途径。
引言
对纳米级亚细胞组分的结构-功能关系的研究通常得益于三维可视化与分析1。然而，连续切片透射电子显微镜研究因需要使用金刚石刀切割并排列数百至数千个厚度≥40 nm的连续超薄切片，而在时间和空间上受到限制。这些限制阻碍了对较细小（直径<40 nm）亚细胞结构的取样与有效分析，同时掌握超薄连续切片技术的难度也限制了三维结构分析的应用2,3。然而，聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）技术的最新进展已彻底提升了可获取图像体积的速度与分辨率，使得大规模定量分析诸如光面内质网4,5、神经元突触3,6以及突触小泡7,8等细小亚细胞结构成为可能。此外，FIB-SEM图像体积数据的广泛应用也加速了开放获取FIB-SEM图像数据库9和三维分析软件（例如 Espina10、IMOD11、Ne....
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方案
1. 图像体积数据与亚细胞结构大小：注意事项与注册
- 获取包含目标亚细胞结构的感兴趣区域的高质量聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）图像数据集。
注意：本方案使用来自晚期青少年雪貂初级视觉皮层的 FIB-SEM 图像体积的片段（24.2 x 16.2 x 2.4 µ微米，4 纳米各向同性体素），以及来自成年大鼠 CA1 海马区的公开可获取的 FIB-SEM 三维图像数据（10.2 × 7.7 × 5.3 µm；5 nm 各向同性体素）由 Knott 实验室提供（https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/）。使用能够保持超微结构细节并在 FIB-SEM 成像条件下产生高对比度的方案制备 FIB-SEM 用组织块至关重要。23,24重要的是，组织成像时应确保最终的 FIB-SEM 图像体素分辨率达到 <0.5 × 感兴趣亚细胞结构最小直径的尺寸。例如，由于突棘突起进入突触前终末的位点直径可小至30 nm，因此体素尺寸应 <15 nm 的采样尺度将足以满足奈奎斯特判据对这些结构的成像要求。此外，以各向同性（在所有维度上相等）的分辨率（例如 5 × 5 × 5 nm 体素）对组织进行成像，有助于可视化和重建在 x/y/z 各平面尺寸相近的细微结构。 - 下载并安装 Image....
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结果
量化雪貂初级视觉皮层兴奋性突触前末梢群体中含突触小芽的比例
尽管数十年来已在神经突中观察到向兴奋性突触前末梢内延伸的类似小芽的突起19,26，但其在突触功能中的潜在重要性仍不明确。本实验旨在确定在雪貂初级视觉皮层（V1）出生后发育过程中，含有突触小芽的兴奋性突触前末梢所占的比例，以评估突触小芽在发育关键阶段突触功能中的潜在作用。为此，使用FEI Helios 660 DualBeam FIB-SEM在背散射模式下，以52°倾角、4.2 mm工作距离、3 kV加速电压和400 pA电流，获取了来自出生后第（p）21天（15.1 × 14.1 × 2.8 µm）、p46（9.7 × 8.4 × 2.7 µm）、p60（24.2 × 16.2 × 2.4 µm）以及大于p90（>p90，24.2 × 16.2 × 2.4 µm）雪貂V1的4 nm/体素各向同性FIB-SEM图像体积。尽管在采集时使用FEI软件对图像堆栈进行了粗略对齐，但所有堆栈均通过Fiji进行了亚像素级对齐（参见1........
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讨论
该FIB-SEM图像体积分析流程可对细小的亚细胞结构进行可靠的三维重建和定量测量。尽管当前基于深度神经网络和分割算法的半自动化技术能够提高在大图像体积中重建具有相对较高膜对比度的细胞结构的速度和效率33，但由于膜对比度较低和/或形态迂曲，许多亚细胞结构（如突触小芽、滑面内质网、内体）仍难以通过自动化方法可靠地识别；尽管较新的方法已开始能够识别对比度较高的线粒体和粗面内质网34,35。此外，未标记的亚细胞结构之间存在的细微差异（如网格蛋白介导的内吞作用与具有网格蛋白包被尖端的突触小芽，或内体与内质网）将要求对任何自动化重建结果进行反复的人工校验36。因此，本方案强调在开始对FIB-SEM图像中的亚细胞结构进行分析之前，必须建立明确的亚细胞结构阳性鉴定标准。
为实现这些目标，必须熟悉特定亚细胞结构在不同随机切面角度（例如，图2
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了华盛顿大学桥梁基金和华盛顿大学塔科马分校试点RRF基金的支持。衷心感谢来自俄勒冈健康与科学大学医学制造中心的Claudia Lopez博士和Jessica Riesterer博士 &感谢#38;科学大学在FIB-SEM技术方面的支持，感谢Graham Knott博士提供CA1区FIB-SEM图像数据集，以及华盛顿大学塔科马分校神经元重建课程（TBIOMD 495）的学生们在使用本实验方案过程中所表现出的耐心与卓越工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fiji（ImageJ） | https://imagej.net/software/fiji/downloads | ||
| 重建 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | ||
| 搅拌器 | Blender 基金会 | https:/www.blender.org |
参考文献
- Holler, S., Kostinger, G., Martin, K. A. C., Schuhknecht, G. F. P., Stratford, K. J. Structure and function of a neocortical synapse. Nature. 591 (7848), 111-116 (2021).
- Xu, C. S., Pang, S., Hayworth, K. J., Hess, H. F. Transforming FIB-SEM. Volume microscopy: Multiscale imaging with photons, electrons, and io....
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重印与许可
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