通过共聚焦与超分辨率显微镜联合技术对小鼠神经肌肉接头进行表征

摘要

本方案描述了一种通过共聚焦与STED显微镜联合进行神经肌肉接头形态计量分析的方法，用于量化脊髓性肌萎缩（SMA）和与ColQ相关的先天性肌无力综合征（CMS）小鼠模型中的病理改变。

摘要

神经肌肉接头（NMJs）是下运动神经元与骨骼肌纤维之间高度特化的突触，它们在神经系统向随意肌传递分子信号并引发肌肉收缩的过程中发挥着关键作用。许多人类疾病都会影响神经肌肉接头，包括杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）、先天性肌无力综合征（congenital myasthenic syndromes, CMS）、脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等遗传性神经肌肉疾病。因此，在疾病小鼠模型中监测神经肌肉接头的形态及其变化，是病理学研究和治疗策略临床前评估的重要工具。本文介绍了从小鼠分离的单根肌纤维中标记和分析运动终板突触前和突触后部分三维（3D）形态的方法。详细描述了样本制备流程，以及通过共聚焦成像测量神经肌肉接头体积、面积、分支复杂度（tortuosity）和轴突终末形态/占据情况的方法，同时还介绍了利用超分辨率受激发射损耗（stimulated emission depletion, STED）显微镜测量突触后皱褶与乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor, AChR）条带宽度之间距离的技术。本文以脊髓性肌萎缩症（SMA）和先天性肌无力综合征（CMS）突变小鼠为例，展示了这些神经肌肉接头参数的异常改变。

引言

神经肌肉接头（NMJ）是一种复杂的结构，由运动轴突末梢、突触周围许旺细胞和参与化学信息传递以及将下运动神经元活动与肌肉收缩相偶联的骨骼肌纤维部分组成。在哺乳动物中，神经肌肉接头的形态在发育过程中发生变化，成熟后呈现典型的椒盐卷饼样形状，不同物种之间的形态和复杂程度存在差异，并且在应对运动或衰老等生理过程时表现出一定程度的可塑性^1,2,3,4。突触后运动终板形成称为接头皱褶的膜内陷结构，其上部含有乙酰胆碱受体（AChR），并与突触前轴突末梢分支紧密接触⁵。

神经肌肉接头的形态和功能改变参与了多种神经退行性疾病（如脊髓性肌萎缩症（SMA）和肌萎缩侧索硬化症（ALS））、肌病（如杜氏肌营养不良症（DMD）、先天性肌无力综合征（CMS）、重症肌无力（MG）和中心核肌病（CNM））以及衰老相关性肌肉减少症^{3,6,7,8,9,10,11,12}的病理生理过程。在这些疾病中，可观察到神经肌肉接头的结构改变，例如终板碎裂、突触后褶皱尺寸减小和/或失神经支配。神经肌肉接头的病理变化可能在疾病进展过程中作为原发性或早期事件出现，也可能作为继发性事件在后期出现，并促进临床症状的发展。无论哪种情况，在这些疾病的动物模型中监测神经肌肉接头的形态均是研究病理变化和评估潜在治疗效果的重要参数。

神经肌肉接头的形态通常通过共聚焦显微镜^2,13,14,15或电子显微镜^5,16技术进行分析，这两种方法分别存在分辨率或技术操作难度等固有局限性。近年来，超分辨率显微镜也被用于可视化神经肌肉接头的特定区域，例如突触前活性区或突触后膜上乙酰胆碱受体（AChR）的分布^16,17,18，作为电子显微镜进行超微结构分析的替代或补充手段。

本方案旨在通过结合荧光共聚焦显微镜和受激发射损耗（STED）显微镜技术，提供一种详细且可重复的评估神经肌肉接头（NMJ）形态学参数的方法。在正常和疾病状态下，对小鼠 gastrocnemius 和 tibialis anterior 肌肉中去单根肌纤维神经支配的突触前和突触后终板的重要特征进行了量化分析，包括体积、面积、相对曲折度、乙酰胆碱受体（AChR）条带宽度以及轴突终末分布等参数。特别地，以脊髓性肌萎缩症的 Smn^2B/- 小鼠模型为例展示了NMJ的缺陷，该神经肌肉疾病由 SMN1 基因突变引起运动神经元变性^11,19；此外还采用了不对称乙酰胆碱酯酶胶原样尾亚基基因敲除（ColQ^Dex2/Dex2 或 ColQ-KO）小鼠作为先天性肌无力综合征的模型进行了研究^20,21,22。

方案

小鼠的饲养和操作均依照国家及欧洲关于动物实验的法律法规进行，并经机构伦理委员会批准。研究中使用了3周龄和6周龄的Smn^2B/- （C57Bl/6J背景）以及ColQ^Dex2/Dex2（B6D2F1/J背景）小鼠，包括雄性和雌性个体。

1. 小鼠安乐死及肌肉解剖：tibialis anterior 和 gastrocnemius

1. 在通过颈椎脱位实施安乐死之前，先通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（87.5 mg/kg）和赛拉嗪（12.5 mg/kg）混合溶液（每20 g体重注射0.1 mL）进行麻醉。
   注意：由于脊髓性肌萎缩症（SMA）和ColQ型先天性肌无力综合征（ColQ-CMS）的发病与性别无关，本实验方案中使用了雄性和雌性小鼠。
2. 使用小型电动剃刀去除后肢毛发，并用70%乙醇冲洗腿部。
   注意：每种肌肉的解剖步骤有所不同。解剖胫骨前肌（tibialis anterior，TA）时，请按照步骤1.2.1–1.2.3操作；解剖腓肠肌（gastrocnemius，GA）（内侧和外侧部分）时，请按照步骤1.2.4–1.2.6操作。解剖过程中应轻柔操作肌肉，避免组织损伤，防止挤压或拉伸肌肉。
   1. 将小鼠置于仰卧位。
   2. 使用尖头钝头剪刀沿后肢远端前外侧部分（平行于胫骨）做一条约5 mm长的皮肤切口，以暴露肌肉。使用超细剪刀去除筋膜。
   3. 先用超细剪刀和弯头细镊子剪断远端肌腱（靠近足部），再剪断近端肌腱（靠近膝部）。操作时需小心，避免损伤肌纤维和神经。
      注意：为完整获取整块肌肉，近端肌腱应尽可能靠近骨骼处切断。
   4. 将小鼠置于俯卧位，使用尖头钝头剪刀从后肢远端后侧区域上部向下至足部做皮肤切口，并剥离皮肤。
   5. 用中号带齿镊夹住跟腱，用超细剪刀将其剪断，并轻柔地将腓肠肌从周围组织中分离至其近端附着点。
   6. 在近端侧，将中号带齿镊插入股二头肌（BF）与腓肠肌之间的间隙，分离两块肌肉，并用超细剪刀尽可能靠近骨骼附着点处切断腓肠肌肌腱。
3. 进行组织固定时，将每块肌肉放入含有1 mL 4%（w/v）多聚甲醛（PFA）溶液（溶于磷酸盐缓冲液PBS，不含Ca²⁺和Mg²⁺）的2 mL微量离心管中，于4 °C孵育18–24小时。
   警告：多聚甲醛和甲醛具有毒性，必须在化学通风橱内佩戴适当的防护装备进行操作。
4. 次日，在化学通风橱内，将固定后的肌肉置于12孔板中，用PBS在室温（RT）下轻轻振荡洗涤3次，每次5分钟。
   注意：本方案可在该步骤暂停，并在一个月内继续进行。若需暂停，请加入含0.01%叠氮化钠的PBS保存样本，并置于4 °C冰箱中。
5. 使用两把细带齿镊子将每块肌肉撕解成宽度约为1 mm的小束肌纤维。
   注意：撕解过程中必须极其轻柔地使用镊子操作肌肉，避免施加过大力量，以防组织损伤。
   1. 根据TA肌肉的大小，将其分离为3或4个肌束。
   2. 对于GA肌肉，先分离其内侧和外侧部分，再根据各部分的大小分别解离为4–5个肌束。

2. 免疫染色

1. 进行肌纤维透化处理：将肌束转移至含有1% (v/v) Triton X-100的PBS溶液的24孔板中，在室温下轻轻振荡（50 rpm）1小时，或在4 °C下振荡5小时。
   注意：将肌束分至两个孔板中，以便进行独立的免疫染色，避免抗体混淆。不要将肌束分至超过两个孔（每板1孔）；否则，所获得的能代表分析肌肉整体状态的神经肌肉接头（NMJ）数量（N）可能不足。
2. 在室温下用PBS洗涤样本3次，每次5分钟，并在4 °C、轻柔振荡（50 rpm）条件下，用含4%牛血清白蛋白（BSA）的PBS/Triton X-100 1%封闭液孵育4小时。
   注意：洗涤过程中不要使用抽吸泵，而应使用200 µL移液器和小号吸头手动移除溶液（参考材料见材料表）。
3. 在4 °C、轻柔振荡（50 rpm）条件下，用步骤2.2中所述的封闭液，加入针对神经丝蛋白M（NF-M，2H3，稀释比例1/200）或突触小泡糖蛋白2（SV2，稀释比例1/200）的单克隆一抗，对样本进行过夜（O/N）孵育，分别用于标记突触前轴突末端或活性区。
4. 次日，在振荡（50 rpm）条件下，用PBS洗涤肌束3次，每次5分钟。
   1. 用于共聚焦成像：在室温、振荡（50 rpm）条件下，将肌束与偶联红色荧光染料（F594）的二抗（抗小鼠，稀释比例1/500）以及偶联绿色荧光染料的α-银环蛇毒素（α-BTX-F488，稀释比例1/1000）在PBS中共同孵育2小时。
   2. 用于STED成像：在室温、振荡（50 rpm）条件下，将肌束与偶联绿色荧光染料（F488）的二抗（抗小鼠，稀释比例1/500）以及偶联具有高光稳定性的远红荧光染料的α-银环蛇毒素（α-BTX-F633，稀释比例1/1000）在PBS中共同孵育2小时。
      注意：孵育过程中避免样本暴露于光线下，以防荧光淬灭。
5. 在振荡（50 rpm）条件下，用PBS洗涤标记后的肌束3次，每次5分钟，然后将其置于载玻片上，并加入封片剂。
   注意：每张载玻片最多放置4至5个肌束，以便封片。
6. 在样本上方加盖一张#1.5（或#1.5H）玻璃盖玻片（厚度0.17 mm），并在载玻片两侧放置圆柱形磁铁，施加压力以压平肌肉组织。
7. 将载玻片置于避光条件下，在4 °C过夜保存，并用指甲油永久封片。

3. 图像采集

1. 共聚焦显微镜图像采集
   注意：使用倒置激光扫描共聚焦显微镜，配备63倍油浸物镜（HCX Plan Apo CS，数值孔径（NA）1.4）进行图像采集。
   1. 为实现盲法分析，请由未参与分析的人员为每张切片编号。在完成所有样本的神经肌肉接头（NMJ）参数定量前，始终保持对实验分组的盲态。
   2. 以配置模式 > machine.xlhw 启动显微镜软件（补充图1）。
   3. 将切片置于显微镜载物台上，使用DAPI滤光片组在宽场荧光照明下观察样本，找到合适的观察平面。
   4. 点击打开项目 > 新建项目，创建一个用于存储图像采集数据的文件夹（补充图1）。
      注意：为每处神经肌肉接头单独创建新项目，以限制文件夹大小，避免计算机内存问题。
   5. 为管理采集参数，点击采集选项卡窗口，将共聚焦针孔设为1.0艾里单位（Airy unit），并调节激光功率，以优化488 nm激光对终板区域绿色/F488（α-BTX）荧光信号的增益和偏移水平（开启实时模式）。
   6. 随后，使用适用于F594检测的激光优化红色/F594（NF-M或SV2）荧光信号的采集。本研究中使用552 nm激光（实时模式开启）。设定各激光的染料发射光谱范围如下：405 nm激光（DAPI）为414–483 nm，488 nm激光（F488-α-BTX）为506–531 nm，552 nm激光（NF-M/SV2）为622–650 nm。
   7. 以相同设置采集各实验组神经肌肉接头的图像堆栈：图像尺寸为1024 × 1024像素（73.7 × 73.7 µm），采样速率为400 Hz，X轴双向扫描开启，缩放倍数为2.5，Z步进大小为0.5 µm，Z-Wide模式。
      注意：针对每个神经肌肉接头，应设置足够的切片层数以完整覆盖整个接头结构。上述采集参数符合奈奎斯特-香农采样定理。用户可点击所有近期共聚焦操作系统中均配备的优化格式按钮，确保像素尺寸和Z步进满足理想的奈奎斯特采样率，从而避免图像过采样或欠采样，防止体积测量精度下降。
   8. 将原始文件（.lif）或Z堆栈图像（.tif）保存至一个命名包含切片代码、染色类型及终板编号的文件夹中。
      注意：应依次（而非同时）使用488 nm和552 nm激光（F488和F594）进行扫描采集，以避免F488荧光信号串扰至F594通道，或反之（串色）。注：可通过显微镜软件中的染料助手（Dye Assistant）配置光路。
   9. 更换至下一张编号切片，并对每个神经肌肉接头重复步骤3.1.3–3.1.8。
   10. 会话结束时，点击在3D查看器中打开，选择一个代表性的实验组神经肌肉接头，以可视化三维标记结果。
       注意：此视图模式有助于验证采集参数设置是否正确。
   11. 关闭显微镜软件，用镜头纸清洁物镜，然后关闭系统。
2. STED显微镜图像采集
   注意：使用配备775 nm门控STED功能的倒置激光扫描共聚焦显微镜，结合100倍油浸物镜（HC PL APO CS2，1.4 NA）进行图像采集。
   1. 为实现盲法分析，请由未参与分析的人员为每张切片编号。在完成所有样本的神经肌肉接头（NMJ）参数定量前，始终保持对实验分组的盲态。
   2. 以配置模式 > machine.xlhw 启动显微镜软件，并开启STED功能（补充图2）。
   3. 点击打开项目 > 新建项目，创建用于存储图像采集数据的文件夹。
      注意：为每张切片单独创建新文件夹，以限制文件夹大小，防止计算机内存问题。
   4. 将切片置于显微镜载物台上，使用488 nm激光在宽场荧光照明下观察样本，确定观察平面。
   5. 使用488 nm激光（光谱检测范围506–531 nm）寻找经神经丝蛋白M（NF-M）或SV2染色标记的神经肌肉接头。
   6. 确定神经肌肉接头后，点击激活STED，使用635 nm激光（光谱检测范围640–750 nm）开始采集包含多个接头皱褶区域的图像（补充图3）。
      注意：采集图像时需注意饱和伪彩表（look-up table），点击快速LUT按钮以避免过曝（8位图像中灰度值>255）。
   7. 以相同设置采集各实验组图像：图像尺寸为2048 × 2048像素（38.75 × 38.75 µm），采样速率为400 Hz。
      注意：耗尽激光（STED）功率设定为65%。
   8. 将图像以包含切片代码的文件名保存。
      注意：可点击优化XY格式：设置格式，以获得STED成像的最佳采集设置。
   9. 更换至下一张编号切片，并重复步骤3.2.3–3.2.8。对所有切片重复此流程。
   10. STED显微镜会话结束后，将图像文件传输至另一台计算机，并将原始文件（.lif）保存至外部硬盘或服务器。
   11. 关闭显微镜软件，用镜头纸清洁物镜，然后关闭系统。

4. 图像分析——共聚焦显微镜

注意：所有图像均使用安装了 Microsoft Windows 10 专业版操作系统的计算机进行处理。

1. 启动 ImageJ 及自定义宏，以计算突触后神经肌肉接头（NMJ）终板体积、最大强度投影（MIP）面积和相对扭曲度。
   1. 使用美国国立卫生研究院（NIH）提供的免费软件 ImageJ²³、iGeodesic 插件和自定义宏处理 NMJ 图像堆栈，获取 NMJ 参数测量值。启动 ImageJ 软件。
      注意：ImageJ 的最新版本可免费下载²⁴。为打开专有文件格式，需下载 Bio-Formats Package²⁵ 插件²⁶。若操作者使用 Fiji，则此步骤非必需，因为该插件已预装于软件中。用于计算扭曲度的 iGeodesic 插件²⁷也可在线获取²⁸；请确认所使用的 ImageJ/Fiji 版本中该插件可用。自定义宏亦可在线获取²⁹。
   2. 将 Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm（自定义宏，补充代码文件 1）拖放至 ImageJ 窗口，宏将在新窗口中打开。在该新窗口中，点击 Macros > Run Macro。
      注意：该宏可处理专有格式和 TIFF 文件。文件需满足以下条件：对于专有文件格式，每个文件仅保存一个接头（即图像堆栈），并按文件夹归类；对于 TIFF 图像，文件必须保存在一个包含子文件夹的主文件夹中，每个子文件夹命名为 JunctionX （X 对应 NMJ 编号），并包含对应接头的图像堆栈（RGB TIFF）（补充图 4）。
   3. 选择包含待分析 Junction 子文件夹的原始文件夹，然后点击 Select。
   4. 在名为 Saving Folder 的新弹出菜单中，选择存储文件夹并点击 Select。
   5. 在名为 Image Type 的新弹出菜单中，选择 Z 堆栈采集的格式。
   6. 选择与目标染色对应的 RGB 通道，并输入 XY 像素大小和 Z 步长（z）。宏将自动执行分析。
      注意：若选择专有文件格式，宏将直接读取像素大小和 Z 步长（z），但用户仍需指定目标通道（C1、C2 或 C3）。宏将在保存文件夹中为每个接头参数（终板体积、MIP 面积和扭曲度）生成一个数据表（.csv）。宏还会生成三个 .TIF 文件，分别对应 α-BTX 染色的轮廓 Drawing_MaxprojX.tif、DrawingJunctionX.tif 和 MIP MaxprojX.tif。这些 TIFF 文件用于验证采集质量，并确保图像处理正确完成。
      突触后 NMJ 体积（V）：宏将分离单个 NMJ 的图像，并保留对应于突触后终板的 α-布加毒素 F488 通道。使用 Otsu 阈值法³⁰对堆栈中间切片进行分割。所得二值图像进行 1 像素膨胀处理，并使用 Analyze Particles 功能测量每个检测对象的终板面积。为获得突触后 NMJ 体积，宏将堆栈中所有测量的终板面积相加后乘以 Z 步长值（z，单位为 µm）。
      
      最大强度投影（MIP）终板面积：堆栈经阈值处理后，使用 Z-project ImageJ 功能获得最大强度投影（MIP）。随后使用 Analyze particles 功能量化 MIP 终板面积。
      NMJ MIP 扭曲度（T）：NMJ 扭曲度反映突触后运动终板的复杂程度，包括皱褶和穿孔³¹，其基于每个 MIP 使用以下公式计算，其中 d_Obj(AB) 为沿物体周长 A 与 B 之间的距离，d_Euc(AB) 为 A 与 B 之间的欧几里得距离（直线距离）。
      
   7. 将每种实验条件下野生型组中的最高扭曲度值设为 100%，并将该实验条件下所有其他值归一化为此值，以获得相对 NMJ 扭曲度。
2. 启动 ImageJ 及自定义宏，以量化突触前神经丝积累和突触小泡糖蛋白 2 染色。
   注意：神经丝积累（此处为 NF-M）和/或突触小泡分布异常（此处为 SV2）是轴突运输异常和/或囊泡运输受损的标志物，此前已在多种脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠模型的 NMJ 中观察到^32,33,34。
   1. 将 Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm （自定义宏，补充代码文件 2）拖放至 ImageJ 窗口，宏将在新窗口中打开。在该新窗口中，点击 Macros > Run Macro。
      注意：该宏可处理专有文件格式和 TIFF 文件。文件必须满足步骤 4.1.2 注释中所述条件。
   2. 选择包含待分析 Junction 子文件夹的原始文件夹，然后点击 Select。
   3. 在名为 Saving Folder 的新弹出菜单中，选择存储文件夹并点击 Select。
   4. 在名为 Image Type 的新弹出菜单中，选择 Z 堆栈采集的格式。
   5. 在 Staining Infos 弹出窗口中，输入突触前和突触后标记物及其颜色，然后点击 OK。例如：突触前标记物：SV2 或 NF，突触前颜色：R，突触后标记物：BTX，突触后颜色：G。
      注意：对于专有文件格式，需指定标记物及其对应通道（C1、C2 或 C3）。
   6. 在 Pixel Size 弹出窗口中，输入 XY 像素大小 0.072 µm 和 Z 步长 0.5 µm（z），然后点击 OK。宏将自动执行分析。
      注意：该参数对应共聚焦显微镜采集前选定的图像尺寸 1024 x 1024 像素（73.7 x 73.7 µm），并与物镜和缩放设置相关。若选择专有文件格式，宏将直接读取像素大小和 Z 步长（z）。宏将在保存文件夹中存储突触前和突触后体积的数据表（.csv），以及当前检测结果的多页 TIFF 图像（分别对应突触前和突触后标记）。如上所述，这些 TIFF 文件用于检查采集质量和确保图像处理正确完成。
      宏从与 α-布加毒素-F488 标记共定位的 NF-M-F594 通道计算轴突神经丝 M 染色体积（NF 体积），并从与 α-BTX-F488 标记共定位的 SV2-F594 通道计算 NMJ 突触小泡糖蛋白 2 染色体积（SV2 体积）。NF-M 积累通过计算 NF 体积与突触后终板（α-BTX）体积之比进行量化，NMJ 轴突终末占据率则通过 SV2 体积与 α-BTX 体积之比计算，如下所示。
      
      

5. 图像分析 - STED 显微镜

注意：图像处理使用 STED 显微镜制造商提供的离线软件进行。

1. 启动显微镜软件。
2. 点击打开项目 按钮以打开项目。选择项目文件（.lif）并打开。图像及其名称将显示在屏幕上。
3. 在处理窗口中：点击降噪 > 中值滤波。在中间窗口的底部，将半径 设置为 5.00，迭代次数 设置为 1.00，并取消勾选3D 滤波。
4. 然后在窗口左上角选择打开的项目选项卡，并选择一幅图像。
5. 点击应用 以确认参数。此时将生成一幅新图像，命名为“nameofimage_median001”。
   注意：在点击应用 之前，可先点击预览 以观察中值滤波的效果，该操作可增强图像对比度，并使用于定量分析的线轮廓更加平滑。
6. 按照步骤 5.4–5.5 所述，将该滤波器应用于所有图像。
7. 在打开的项目选项卡中，点击软盘图标以保存所有项目，包括新生成的滤波后图像。
   注意：下一步将使用名为“nameofimage_median001”的滤波后图像进行操作。
8. 计算 AChR 条纹之间的距离
   注意：在神经肌肉疾病中，突触后皱褶形态的改变常作为神经肌肉接头（NMJ）病理（发育不成熟或退化）的标志。通过 α-银环蛇毒素染色检测到的 AChR 条纹之间的距离（d），可通过生成强度轮廓并绘制线轮廓来量化各最大强度峰之间的距离（补充图 5）。
   1. 使用显微镜软件，在中央窗口顶部选择定量分析 菜单。
   2. 点击左上角的工具 选项卡。在左上面板中选择强度，然后点击线轮廓图标。将过采样 设为 1，并勾选通道排序。
   3. 点击打开的项目选项卡，并选择待分析的滤波后图像。
      注意：可通过滚动鼠标滚轮放大图像。通过图像左侧的滑动条可调整图像的动态范围，有助于条纹的可视化。
   4. 然后点击右侧窗口顶部菜单中的绘制线条图标，画一条垂直穿过多个条纹/接头皱褶的直线。
      注意：强度轮廓将在中央窗口中显示。
   5. 点击第一个峰的顶部，按住鼠标左键并移动指针，直至到达下一个最大强度峰。
      注意：相关信息将显示在强度轮廓中，两峰之间的距离将以“dx”表示并显示在图表下方。
   6. 在右侧窗口的图像上点击鼠标右键，选择保存感兴趣区域（ROIs）。通过点击加载 ROIs来打开已保存的感兴趣区域。
   7. 点击右侧窗口左上角的箭头图标，选中 ROI 后点击垃圾桶图标将其删除。
   8. 根据需要重复上述操作，从多个强度轮廓中获取足够数量的 AChR 条纹间距数据，以代表所分析肌肉的整体情况。
      注意：可根据组间预期差异、α 风险、检验效能以及单尾或双尾检验预先计算最优 N 值。在本实验设计中，采用单尾 Mann-Whitney 检验（α 风险 = 10%；检验效能 = 80%），估算每个 NMJ 至少需要五个 AChR 条纹间距数据，以便比较两组动物。
9. AChR 条纹宽度
   注意：条纹宽度（w）对应于强度轮廓的半高全宽（FWHM），即 α-BTX 荧光信号强度达到其最大值一半时两点之间的距离（补充图 5）。
   1. 使用显微镜软件，在中央窗口中选择定量分析 菜单。
   2. 点击左上角的工具 选项卡。在左上面板中选择强度 ，然后点击确定 FWHM图标。勾选通道排序。
      注意：为优化软件对峰的识别，将设定阈值和宽度 分别设为 50 和 3。请根据每次实验的具体情况调整这些参数，并咨询有经验的成像科学家的建议。
   3. 点击打开的项目 选项卡，并选择待分析的滤波后图像。
      注意：可通过滚动鼠标滚轮在右侧窗口中放大显示的图像。如前所述（步骤 5.8.3 后的注释），可调整图像的动态范围以实现条纹的最佳可视化。
   4. 接下来，点击右侧窗口顶部菜单中的绘制矩形 图标。选择一条水平或垂直的条纹，并垂直于该条纹绘制一个矩形。此时中央窗口将出现一个轮廓图。
   5. 根据条纹方向为垂直或水平，在左侧面板的平均投影菜单中点击垂直 或水平 。
   6. 在中央窗口中点击统计，读取 FWHM 值。
   7. 在右侧窗口显示的图像上点击鼠标右键，选择保存 ROIs。
      注意：通过点击加载 ROIs来打开已保存的感兴趣区域。
   8. 点击右侧窗口左上角的箭头图标，选中 ROI 后点击垃圾桶图标将其删除。
   9. 根据需要重复此操作，从不同的矩形感兴趣区域中获取足够数量的 AChR 条纹宽度数据，以代表所分析肌肉的整体情况。

6. 实验设计与统计学检验

1. 使用特定软件进行统计分析。
   注意：每个实验组的数据来自 N ≥ 3 个生物学重复，共采集每个基因型至少 20 个神经肌肉接头（NMJ）用于共聚焦显微镜成像；STED 成像则来自 N ≥ 5 个生物学重复，每个基因型 N = 5 个 NMJ。显著性通过非配对 Mann-Whitney 检验（非参数检验）进行评估，p 值在相应图注中注明。

结果

为了以可重复的方式对神经肌肉接头在突触前和突触后水平进行形态学分析，我们建立了一套从肌肉组织采集到显微镜成像及定量分析的工作流程，该流程结合了显微镜软件和ImageJ自定义宏（图1）。为展示本实验方案的应用价值，我们评估了两种遗传性疾病小鼠模型——脊髓性肌萎缩症（SMA）模型Smn^2B/- 小鼠和先天性肌无力综合征（CMS）模型ColQ^Dex2/Dex2小鼠——的神经肌肉接头形态，并将其数据与同龄对照组 littermates 进行比较。

在3周龄和6周龄的Smn^2B/- （C57Bl/6背景）和ColQ^Dex2/Dex2（B6D2F1/J背景）小鼠中，当这些动物已出现疾病表征时，分别从小腿前肌（tibialis anterior）和腓肠肌（gastrocnemius）评估神经肌肉接头（NMJ）结构。在3周龄时，Smn^2B/- 小鼠表现出骨骼肌发育迟缓和失神经支配的迹象，例如NMJ萎缩和丢失^35,36。先天性肌无力综合征（CMS）小鼠的NMJ存在原发性病理改变，并从出生第一周起即表现出体重下降和显著的肌无力²⁰（数据未显示）。如图2A所示，通过共聚焦显微镜观察，用荧光标记的α-银环蛇毒素染色的突触后运动终板在两种小鼠模型的突变体中均显得更小和/或呈碎片化。使用定制的ImageJ宏对NMJ的Z轴堆栈图像进行量化，结果显示，与对照组相比，脊髓性肌萎缩症（SMA）和CMS小鼠的终板体积、最大强度投影（MIP）以及相对扭曲度均显著降低，提示存在NMJ成熟缺陷³²（图2B-D）。在患病动物中，突触后终板体积和MIP均下降（Smn^2B/- 小鼠体积减少2.7倍，MIP减少2.5倍；ColQ^Dex2/Dex2小鼠体积减少2.0倍，MIP减少2.0倍）。SMN和ColQ缺陷肌肉中的相对扭曲度也低于野生型（SMA小鼠为16.97% ± 1.33%，野生型小鼠为48.84% ± 5.90%；CMS小鼠为13.29% ± 2.79%，对照小鼠为30.20% ± 4.44%）。此外，使用ImageJ自定义宏对突触前轴突终末分支分布进行量化，结果显示两种动物模型中神经丝蛋白M（neurofilament M）的分布模式发生改变，免疫荧光信号增强（Smn^2B/- 小鼠为84.65% ± 0.32% 对照组为16.57% ± 2.03%；ColQ^Dex2/Dex2小鼠为23.64% ± 2.78% 对照组为18.77% ± 1.73%）（图3A-D）。通过SV2染色发现，Smn^2B/- 小鼠的占据率（即含有相邻神经末梢活性区的乙酰胆碱受体区域所占百分比）减少了43%（SMA小鼠为49.36% ± 3.76%，野生型小鼠为85.69% ± 2.34%）（图3E、F）。该NMJ参数也在ColQ^Dex2/Dex2突变体的胃肌（GA）中进行了计算，但与对照组 littermates 相比未发现统计学显著差异（数据未显示）。

我们通过量化突触后膜皱襞之间的距离以及位于这些皱襞 crest 处的 AChR 条带宽度，进一步分析了突触后膜的特征， ColQ使用超分辨率受激发射损耗（STED）显微镜观察缺乏特定蛋白的肌肉组织。如图所示 图4，这些结构的形态可通过荧光标记的α-银环蛇毒素染色及强度分布分析清晰地可视化。我们评估了这些神经肌肉接头参数，发现乙酰胆碱受体条带的接合褶间距（d）和宽度（w）增加 腓肠肌 突变体肌肉中肌节的距离为 358.3 nm ± 11.97 nm 和 320.8 nm ± 10.90 nm，宽度为 216.9 nm ± 10.51 nm 和 186.3 nm ± 7.015 nm ColQ^Dex2/Dex2 与野生型小鼠相比，p < 0.05) (图4C，D).

图1：通过共聚焦与STED显微镜进行三维多尺度神经肌肉接头（NMJ）表征的视频方案流程图。Tibialis anterior (TA) 和 gastrocnemius (GA) 肌肉取自小鼠，分离出肌纤维后，使用α-银环蛇毒素-F488或α-银环蛇毒素-F633、DAPI、针对中等神经丝蛋白（NF-M）和突触小泡糖蛋白2（SV2）的一抗，以及荧光染料（F488或F594）标记的二抗进行标记。通过共聚焦显微镜获取图像堆栈，并用于测量突触后NMJ体积、突触前NF-M聚集程度、NMJ轴突终末占据率、突触后最大强度投影（MIP）终板面积以及曲率（d_Obj(AB) 表示沿物体边缘（红线）A点与B点之间的距离，而d_Euc(AB)表示A点与B点之间的欧几里得距离（绿线））。在STED显微镜分析中，通过α-BTX-F633染色的强度分布曲线量化乙酰胆碱受体（AChR）条带的宽度以及接头皱襞之间的距离。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：脊髓性肌萎缩（SMA）和ColQ相关先天性肌无力综合征（CMS）小鼠模型中突触后神经肌肉接头的多参数表征。（A）使用α-银环蛇毒素-F488（α-BTX）标记的胫骨前肌（TA）和腓肠肌（GA）突触后运动终板的代表性图像。（B）3周龄野生型（WT）和Smn^2B/-小鼠（左图，每种基因型N = 3只动物，n = 37和n = 56个神经肌肉接头）以及6周龄WT和ColQ^Dex2/Dex2小鼠（右图，每种基因型N = 5只小鼠，n = 89和n = 97个神经肌肉接头）TA肌肉中神经肌肉接头突触后终板体积的定量分析，（C）最大强度投影（MIP）面积，以及（D）相对扭曲度。数据以每只小鼠的平均值（圆点）± 标准误（SEM）表示。组间差异通过Mann-Whitney检验进行分析（* p < 0.05）。比例尺为10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：野生型和突变型小鼠肌肉中突触前轴突终末分布的形态计量学分析。 野生型（WT）、脊髓性肌萎缩症（SMA）及ColQ相关先天性肌无力综合征（CMS）小鼠的胫骨前肌（tibialis anterior，TA）和腓肠肌（gastrocnemius，GA）中的神经肌肉接头（NMJ）支配模式。（A，B）21日龄野生型和Smn^2B/-小鼠TA肌肉中代表性神经肌肉接头，使用针对中等分子量神经丝蛋白（NF-M，红色）和α-银环蛇毒素-F488（α-BTX，绿色）的抗体标记（A），以及神经丝蛋白聚集的定量分析结果（B）；（C，D）6周龄野生型和ColQ^Dex2/Dex2小鼠GA肌肉中代表性神经肌肉接头，使用针对中等分子量神经丝蛋白（NF-M，红色）和α-银环蛇毒素-F488（α-BTX，绿色）的抗体标记，显示碎片化和未成熟的突触后终板（C），以及两组动物神经丝蛋白聚集的分析结果（D）。实验中分析了N = 4（n = 34个NMJ）（B）和N = 3（n = 54个NMJ）（D）只野生型动物，以及N = 3（n = 36个NMJ）只Smn^2B/-小鼠和N = 3（n = 55个NMJ）只ColQ^Dex2/Dex2小鼠（B，D）。（E，F）3周龄野生型和Smn^2B/-小鼠TA肌肉中神经肌肉接头轴突终末占位的代表性图像，使用针对突触小泡糖蛋白2（SV2，红色）和α-银环蛇毒素-F488（α-BTX，绿色）的抗体标记（E），以及NMJ占位率（SV2/AChR体积比）的分析结果（F）。共分析了N = 3（n = 50个NMJ）只野生型和N = 4（n = 62个NMJ）只Smn^2B/-小鼠的肌肉样本。数据以每只小鼠的平均值（圆点）±标准误（SEM）表示。组间差异采用Mann-Whitney检验进行分析（* p < 0.05）。比例尺为20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4STED成像技术用于神经肌肉接头突触后终板的观察 (A代表性STED图像，显示用α-银环蛇毒素-F633（α-BTX）标记的神经肌肉接头 腓肠肌 6周龄野生型小鼠的突触后乙酰胆碱受体条带（比例尺为5 µm）。(B) 乙酰胆碱受体（AChR）条带区域的高倍放大图像（下图），用于生成强度分布曲线。对该区域的AChR条带宽度（w）以及相邻两条带之间的距离（d）进行量化，并以柱状图形式展示。示意图显示突触后终板结构，以说明AChR条带的宽度（w）和间距（d）。这些参数（CAChR 条带间距和（D）宽度，在 ColQ^Dex2/Dex2 小鼠及6周龄的对照同窝小鼠。来自5只野生型（总计n = 29个NMJ）和6只 ColQ^Dex2/Dex2 （总共分析了43个NMJ的动物），分析过程采用盲法。数据以每只小鼠的平均值（圆点）± 标准误（SEM）表示。组间统计学差异采用Mann-Whitney检验分析（* p < 0.05). 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图1：LAS X软件的启动及共聚焦图像采集参数。 共聚焦图像采集的各个步骤在实验方案的3.1.2至3.1.7节中进行了描述。每次采集神经肌肉接头（NMJ）图像堆栈时，需打开一个项目（步骤3.1.4），并设置图像尺寸、采集速度以及X、Y和Z轴参数（步骤3.1.7），同时指定每次连续扫描的条件（Seq.1，405激光用于DAPI染色；Seq.2，488激光用于α-BTX-F488；Seq.3，552激光用于F594标记的二抗）。请点击此处下载该文件。

补充图2：LAS X软件的启动及STED成像参数。 获取STED图像的步骤在实验方案的3.2.2至3.2.8节中进行了描述。显微镜以STED ON配置模式启动（步骤3.2.2），并打开一个项目（步骤3.2.3）。图像采集参数（步骤3.2.7）（包括图像尺寸、采集速度、缩放倍数、X轴），以及每次连续扫描的设置均已标明（Seq.1用于α-BTX-F633；Seq.2用于F488标记的二抗）。请点击此处下载该文件。

补充图3：通过STED显微镜获得的α-BTX染色接头皱褶图像。 使用α-BTX-F633标记的6周龄野生型小鼠突触后终板图像示例，左图为正确聚焦下获得的图像，右图为聚焦不当时获得的图像。请点击此处下载该文件。

补充图4：自定义ImageJ宏的输入与输出数据说明窗口弹出界面。 左侧列展示了神经肌肉接头（NMJ）图像的输入数据示例（.tif 和 .lif 文件）。宏生成的输出数据（右侧列）将保存在文件夹中（Save_Volume、Save_Accu），其中包含接头图像（.tif）以及包含结果的数据表（.csv 文件）。请点击此处下载该文件。

补充图5：使用LAS X软件对STED图像中的AChR条纹间距和宽度进行分析。 分析NMJ STED图像的步骤详见方案第5节。A) 标记的突触后终板区域图像，其中包含AChR条纹。通过绘制垂直线（绿色线，用于条纹间距）或垂直矩形（紫色矩形，用于条纹宽度）来选择用于条纹分析的兴趣区域。B、C) 显示所选区域的强度分布曲线，以及用于计算AChR条纹间距（B）和AChR条纹宽度（C）的测量结果。请点击此处下载该文件。

补充代码文件 1：Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal。 ImageJ 自定义宏，用于提取神经肌肉接头（NMJ）参数测量值（NMJ 体积、最大投影终板面积和 NMJ 曲折度）。请点击此处下载该文件。

补充代码文件 2：Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal。用于提取 NF-M 累积和 SV2 染色的 ImageJ 自定义宏。请点击此处下载该文件。

讨论

本视频方案详细介绍了通过结合共聚焦显微镜和STED显微镜来定量分析神经肌肉接头三维结构的方法，可用于表征突触前和突触后水平的病理变化。STED显微镜的高分辨率能够可视化并进行形态计量分析，识别出传统共聚焦成像无法分辨的纳米级结构。该方法使我们能够测量脊髓性肌萎缩症（SMA）和ColQ相关先天性肌无力综合征（CMS）小鼠两种四肢肌肉——胫骨前肌（tibialis anterior）和腓肠肌（gastrocnemius）中神经肌肉接头的结构改变。

为了通过该技术获得可靠的结果，必须正确地解剖和分离肌肉，特别注意肌肉周围的筋膜以及用于分离肌束的力度；否则，神经支配模式可能被破坏，从而妨碍对神经肌肉接头（NMJ）突触前结构的准确评估。尽管文中提供了详细的胫骨前肌（TA）和腓肠肌（GA）神经肌肉接头分析方法，但原则上，本方案也可适用于其他肌肉，包括不需要进行肌束分离步骤的扁平肌肉，如膈肌或腹横肌³⁷。组织固定对于确保染色质量也至关重要，因此建议使用高质量的多聚甲醛（PFA），用量应为肌肉体积的15–20倍。此外，固定剂作用时间是一个关键步骤，因为过度固定可能导致收缩、聚集等假象，进而影响神经肌肉接头的形态特征。考虑到样本大小及多聚甲醛溶液在组织中的渗透速率³⁸，建议此类肌肉的固定时间为18–24小时。若计划在组织取材一周后进行染色步骤，建议将PFA固定的肌肉置于添加叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于4 °C保存，以防止细菌增殖。

本方案采用α-BTX-F488进行共聚焦成像，α-BTX-F633进行STED成像。所选荧光染料符合所述实验设计，但可根据可用的设备和材料进行调整。例如，在使用STED连续波592 nm激光进行图像采集和定量分析时，可选择α-BTX F488标记。然而，本研究中采用的配置（脉冲激发门控STED，775 nm耗尽）在性能和分辨率方面优于其他方法（如连续波STED³⁹），因此更适用于当前应用。此外，需谨慎选择激光功率参数，尤其是STED的激发和耗尽激光功率，因为在信号饱和的情况下无法准确测量强度分布特征，因此神经肌肉接头图像中任何饱和信号都可能影响整个分析结果。

本详细工作流程包括使用显微镜软件和ImageJ宏进行图像采集与分析，旨在实现从单块肌肉出发，对神经肌肉接头（NMJ）进行自主形态计量分析，适用于共聚焦显微镜和STED显微镜。此前已报道的NMJ共聚焦分析工作流程，如NMJ-morph²或NMJ-Analyser¹⁴，为半自动分析方法的设计奠定了基础，促进了NMJ的形态学分析及比较研究。NMJ-morph（及其更新版本aNMJ-morph¹⁵）是一个基于免费ImageJ平台的工具，利用最大强度投影测量21项形态学特征；NMJ-Analyser则采用Python编写的脚本，从完整的三维NMJ结构中生成29个相关参数。在这两种方法中，图像处理过程中唯一需要用户参与的步骤是手动设定阈值。本整合性实验方案详细描述了组织制备、三维共聚焦图像采集以及基于ImageJ的完整骨骼肌NMJ处理步骤，并对突触后（体积、最大投影面积和曲折度）和突触前（轴突终末占据率和神经丝蛋白聚集）终板的五个重要参数进行了简明概述。此外，为在纳米尺度上进行形态计量分析，本研究引入了一个具有生物学意义的额外参数——突触后接头皱褶中乙酰胆碱受体（AChR）的组织排列模式，并通过超分辨率STED显微镜（分辨率20–30 nm）实现⁴⁰。有趣的是，STED成像的组织制备比其他用于NMJ超微结构研究的方法更为简便，例如传统的透射电子显微镜（TEM）⁹，后者是一种较为复杂且耗时的过程，需要熟练的操作人员才能获得适当肌肉区域的超薄切片。此外，利用STED配套软件可自动获取多个接头皱褶的定量数据。

本方案已用于阐明SMN和ColQ缺陷肌肉中先前已知的神经肌肉接头（NMJ）缺陷^20,36,41,42。通过共聚焦显微镜在两种小鼠模型中均观察到一些共同的变化，例如突触后终板体积减小、MIP面积减小、相对扭曲度降低，以及神经丝积聚增加；而某些更特异性的发现（如NMJ占据率降低）仅在脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠中观察到，提示囊泡运输功能受损³⁶。最后，通过STED分析在ColQ-KO小鼠中检测到乙酰胆碱受体（AChR）条纹间距和宽度增加，这表明突触后皱褶存在超微结构缺陷，此前透射电镜（TEM）研究中也观察到类似现象²⁰。重要的是，本方案有助于在发育、维持以及多种病理条件下对神经肌肉接头进行更深入的形态学表征。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
缓冲液与试剂
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (F488)	Life Technologies, Thermofisher	A-11001
Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX)	Life Technologies, Thermofisher	B13422
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG (F594)	Life Technologies, Thermofisher	A-11032
ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX)	Alomone Labs	B-100-FR
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma	A2153
DAPI Fluoromount-G	Southern Biotech	00-4959-52
DPBS	Gibco, Invitrogen	14190-169
无水乙醇	VWR	20821.296
浸油，n = 1.518	THORLABS	MOIL-10LF	低自发荧光
神经丝蛋白 (NF-M) 抗体	DSHB	AB_531793
多聚甲醛 (PFA)	MERCK	1.04005
突触小泡糖蛋白 2 (SV2) 抗体	DSHB	AB_2315387
Triton X-100	Sigma	T8787
材料
铝镍钴圆柱形磁铁	Farnell France	E822	直径 19.1 mm，最大拉力 1.9 Kg
63x 1.4 NA 油镜 HCX Plan Apo CS 物镜	Leica Microsystems
100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 物镜	Zeiss
弯曲细镊子 - Moria 虹膜镊	Fine Science Tools	11370-31
超细剪刀 - Vannas-Tübingen 弹簧剪	Fine Science Tools	15-003-08
细齿镊	Euronexia	P-95-AA
加样枪头（圆头）1-200 µL	COSTAR	4853
Leica 激光共聚焦显微镜 TCS SP8	Leica Microsystems
Leica 激光共聚焦显微镜 TCS SP8 Gated STED 775 nm	Leica Microsystems
镜头清洁纸	Whatman (GE Healthcare)	2105-841
中等齿镊	Euronexia	P-95-AB
显微镜盖玻片 24x50 mm，1.5H，170±5 µm	Marienfield	107222	高精度
Nunclon delta 表面（12 孔板）	Thermo Scientific	150628
Nunclon delta 表面（24 孔板）	Thermo Scientific	142475
Safeshield 手术刀	Feather	02.001.40.023
尖钝剪刀 - 精细剪刀 - 马氏体不锈钢	Fine Science Tools	14094-11
Superfrost plus 载玻片	Thermo Scientific	J1800AMNZ
软件
GraphPad	Prism, San Diego (US)	Release N°6.07	统计分析软件
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	Release N° 1.53f
Leica Application Suite X 软件	Leica Microsystems	Release N°3.7.2.2283	可在 https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ 免费获取的显微镜软件