从脂肪组织中获取间充质干细胞及长期冷冻保存后基质血管组分表征的技术

摘要

本方案描述了一种改进的ADSC分离方法，与文献报道相比，该方法可获得极高的细胞产量，并节省大量时间。本研究还提供了一种简单的方法，可在长期冻存后获得相对大量的活细胞。

摘要

源自脂肪组织的人类间充质干细胞因其具备适宜的特性且易于获取，已成为再生医学临床应用中日益受关注的细胞来源。目前已有多种方案用于获取脂肪来源干细胞。本文介绍了一种改进的、节省时间的方案，可获得更大量的脂肪来源干细胞（ADSC），并阐述了如何对ADSC进行冻存与复苏，以获得可用于培养扩增的活细胞。本研究从9名接受择期腹部整形术的患者腹部区域，使用长26 cm、带三个孔、口径3 mm的注射器进行负压抽吸，收集100 mL脂肪抽吸物。通过一系列含钙的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤步骤，并结合胶原酶消化，完成干细胞的分离。所获得的基质血管组分（SVF）细胞被冻存，并通过免疫表型分析检测其活力。SVF细胞的平均得率为15.7 × 10⁶个/mL脂肪组织。⁵ 个/mL，范围介于6.1–26.2个/mL。贴壁的SVF细胞平均在7.5（±4.5）天达到汇合，平均细胞收获量为12.3（±5.7）×10⁵ 细胞/mL。解冻后SVF细胞在冻存8个月、1年和2年后的存活率范围为23.06%–72.34%，平均存活率为47.7%（±24.64），其中最低存活率与冻存两年的样本相关。使用添加钙离子的DPBS溶液，并结合较短时间的胶原酶消化以及通过静置袋装样本实现脂肪沉淀，可提高最终干细胞的细胞得率。该获得高存活率干细胞的详细操作流程在时间和细胞得率方面均优于以往研究中的技术方法。即使经过长期冷冻保存，SVF中仍可检测到存活的ADSC细胞。

引言

人类间充质干细胞在基础研究和应用研究中均具有显著优势。相较于胚胎干细胞或其他细胞类型，该成体细胞的使用避免了伦理问题，是自体组织再生工程和细胞治疗领域最具前景的研究方向之一¹例如肿瘤区域、退行性疾病的治疗，以及重建外科领域的治疗应用^2,3,4,5已有报道指出，脂肪组织的基质血管细胞组分中含有丰富的间充质多能和多能干细胞^6,7这些ADSC被认为是细胞治疗及移植/输注的理想候选细胞，因为其具有较强的扩增能力且可获得较大量的细胞 离体 可通过微创操作以高产量轻松获取^5,8.

此外，已有研究证明，脂肪组织提供间充质干细胞的能力强于其他两种来源（骨髓和脐带组织）⁹。除了免疫原性低，并具有高度整合入宿主组织及与周围组织相互作用的能力外^4,10，脂肪来源的干细胞（ADSC）还具有向多种细胞系分化的多向分化潜能，在适当的培养条件下，已有报道显示其可分化为软骨细胞、成骨细胞和肌源性细胞^11,12,13，也可分化为胰腺细胞、肝细胞以及神经源性细胞等^14,15,16。

科学界普遍认为，间充质干细胞的免疫调节作用是细胞治疗中比其分化特性更为重要的作用机制^17,18,19。使用脂肪来源干细胞（ADSC）最重要的优势之一在于可实现自体输注或移植，从而成为多种疾病的替代治疗方法。在再生医学领域，ADSC 已被应用于肝损伤、心肌重建、神经组织再生、骨骼肌功能改善、骨再生、癌症治疗以及糖尿病治疗等病例中^20,21。

截至目前，在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）网站上登记的评估ADSC潜力的临床试验共有263项²²。尽管已建立多种获取脂肪组织的方案，但文献中尚未就用于临床的ADSC分离标准化方法达成共识^23,24。手术过程中及术后对脂肪抽吸物的处理方法可直接影响细胞活力、最终的细胞收获量²⁵以及ADSC群体的质量²⁰。关于手术前处理，目前尚不明确哪种术前处理技术在分离后能获得更大量的活细胞，也不清楚注入脂肪组织的麻醉液是否会影响细胞产量及其功能²⁶。同样，不同获取脂肪细胞的技术之间的差异可能导致活ADSC数量减少高达70%²⁰。根据文献报道，应避免采用包括超声在内的机械处理方法来获取高活力的细胞群体，因为这些方法可能破坏脂肪组织²⁰。然而，使用注射器进行的手动脂肪抽吸法损伤较小，造成的细胞破坏较少，而肿胀性吸脂术则能够获得数量较多且质量最佳的细胞²⁶。

该技术使用含有利多卡因和肾上腺素的生理盐水溶液，将其注射至吸脂区域。每注射3 mL溶液，即抽吸1 mL。本研究中采用湿式吸脂技术，即每注射1 mL肾上腺素和生理盐水溶液，抽吸0.2 mL脂肪组织。在分离脂肪来源干细胞（ADSC）的过程中，常使用消化酶，尤其是胶原酶。

在实验室完成初次分离步骤后，最终获得的沉淀物称为基质血管组分（stromal vascular fraction, SVF）。SVF包含多种细胞类型²⁷，包括内皮祖细胞、内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞、壁细胞、前脂肪细胞以及具有贴壁能力的脂肪来源干细胞（ADSCs）。当体外（in vitro）培养完成最终分离后，通过更换培养基可去除未贴壁的细胞。经过八周的扩增、换液和传代，ADSCs成为培养瓶中主要的细胞群体²⁰。使用分离获得的脂肪来源干细胞进行潜在未来治疗的一大显著优势在于其可进行冷冻保存。已有研究表明，即使冷冻6周后，冷冻保存的脂肪抽吸物仍是SVF细胞的潜在来源²⁸；冷冻保存2年后仍具有生物学活性²⁹，并在培养中保持完整的增殖和分化能力³⁰。然而，在解冻过程中通常会损失相当比例的细胞³¹。因此，脂肪抽吸物的采集过程以及后续的细胞分离方法必须确保获得最高的细胞得率。

本研究描述了一种更快捷的脂肪来源干细胞（ADSC）采集与分离方法，具有较高的细胞得率和存活率，可提高细胞治疗的效率。此外，还评估了该改进技术在长期基质血管组分（SVF）冻存后的效果。

方案

本研究经圣保罗联邦大学（UNIFESP）伦理委员会批准（方案编号：0029/2015，CAAE：40846215.0.0000.5505），并在根据《赫尔辛基宣言》（2004年）获得患者书面知情同意后进行。本研究的样本包括9名女性患者，年龄33至50岁（平均年龄41.5岁），初始平均体重指数（BMI）为24.54（范围在22.32至26.77之间）（表1），这些患者因妊娠后皮肤多余，在巴西圣保罗联邦大学（UNIFESP）整形外科部门接受了美容性腹壁成形术。为减少偏倚，患者在性别、年龄和BMI方面被选为同质群体。本研究使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获取。

1. 脂肪抽吸物的采集

注意：此步骤需在手术中心进行。

1. 使用 4% 葡萄糖酸氯己定（见材料表）进行皮肤准备和无菌处理。
   1. 在皮下层（位于真皮下层与腱膜之间）做 2 mm 的皮肤切口。插入一根 26 mm 3 G 三孔、直径 3 mm 的克莱因套管针，并连接注射器，将 500 mL 肾上腺素溶液（1 mg/mL）（见材料表）用生理盐水稀释至 1:1,000,000 后注入脐下区域。
2. 将一个 60 mL 注射器连接至 26 mm 3 G 三孔、直径 3 mm 的吸脂套管针，通过皮肤切口插入，并锁定活塞以形成负压。
   1. 进行推拉操作，使在负压作用下脂肪抽吸物保留在 60 mL 注射器中。
3. 使用带阀门的无菌连接器，将收集的 100 mL 脂肪抽吸物转移至一个 150 mL 聚氯乙烯转移袋中（见材料表）。
   1. 将转移袋置于聚苯乙烯盒中，在室温（约 25 °C）下立即送往实验室。从采集到开始组织处理的时间不得超过 30 分钟。

2. 脂肪抽吸物的处理

注意：此步骤需在实验室中进行。

1. 首先，称量袋子，使用数字非接触式红外临床体温计测量温度，并将袋子置于超净工作台内静置 5 分钟，以使较油腻的层（气泡）和含有目标细胞的组织部分沉淀分离。
   1. 进行一系列组织清洗。第一次清洗：向转移袋中注入 100 mL 含钙的 DPBS（1x），用手轻轻混匀。
   2. 静置 5 分钟后，移除大部分沉淀的底层液体。
   3. 使用连接在袋适配器上的 60 mL 注射器弃去底层液体。此过程需重复两次。
2. 向袋中加入 100 mL 消化液（93 mL 无钙 DPBS + 60 µL 氯化钙（1 g/L）+ 7 mL 0.075% 无菌胶原酶，参见 材料表），于 37 °C 下缓慢搅拌孵育 30 分钟。
3. 将袋内所有内容物转移至四个 50 mL 锥形管中，在 22 °C 下以 400 × g 离心 10 分钟。
   1. 移除并弃去上清液，向细胞沉淀中加入 5 mL 添加了 20% FBS（胎牛血清）的低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（图 1）。

3. SVF 细胞计数

1. 取10 µL 0.05%的台盼蓝溶液（溶于蒸馏水中）与10 µL细胞悬液混合，孵育5分钟。
2. 使用倒置光学显微镜（参见材料表），在20倍放大倍数下，用Neubauer细胞计数板对活细胞进行计数³²。
3. 将细胞沉淀重悬于冷冻保护液中（5 mL胎牛血清 + 10%二甲基亚砜 - DMSO），调整细胞浓度至1 × 10⁶ 个细胞/mL。
4. 将1 mL上述悬液分装至冻存管中。使用可控降温冻存盒（参见材料表），以1 °C/min的速率降温至-80 °C。
   1. 在-80 °C条件下可保存1年。
   2. 保存1年后，转移至液氮气相（-165 °C）中的标准冻存盒中长期保存。

4. 细胞解冻过程

1. 从液氮中取出小瓶，立即放入37 °C水浴中1分钟。
2. 将SVF细胞放入锥形管中，加入4 mL预热至37 °C的DMEM（低糖，添加20% FBS）。
3. 在22 °C下以400 x g离心5分钟。
4. 弃去上清液，加入1 mL DMEM（低糖）+ 10% FBS。按以下步骤进行免疫表型分析。

5. 流式细胞术技术（免疫表型多标记）

1. 将1 mL细胞沉淀（浓度为1,000个细胞/µL）分装至五个流式管中（每管200 µL）。
2. 在22 °C下以400 × g离心5分钟，用移液器弃去上清液。
3. 加入300 µL磷酸盐缓冲液（PBS，10倍浓缩液），在22 °C下以400 × g离心，用移液器弃去上清液。
4. 准备五个试管用于不同的标记物组合，如下所示：5 µL CD11B / 5 µL CD19 / 20 µL CD45；5 µL CD73 / 20 µL CD90 / 5 µL CD105 / 20 µL CD45；20 µL CD34 / 5 µL HLA-DR / 20 µL CD45；细胞活力检测：5 µL荧光反应性染料（参见材料表），另设一管加入未染色细胞和PBS作为阴性对照。在涡旋振荡器上混匀，4 °C避光孵育30分钟。
   1. 在22 °C下以400 × g离心5分钟，用移液器弃去上清液，加入500 µL PBS（10倍浓缩液），随后进行细胞分选。
      ​注意：每组抗体在四色五参数流式细胞仪中采集五千个事件，并使用CellQuest软件进行分析。

第6步：第1代（P1）细胞的接种

1. 在75 cm²培养瓶中接种2 × 10⁵个细胞。
2. 加入12 mL低糖DMEM培养基，含20%胎牛血清（FBS）和10%抗生素/抗真菌素（每毫升含10,000单位青霉素、10 mg链霉素和25 µg两性霉素B，0.1 µm过滤）。
3. 当细胞融合度达到80%–90%时，用2 mL 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化贴壁细胞3分钟。
4. 再次计数细胞（如步骤3所述）。
5. 再次进行免疫表型分析（如步骤5所述）。

7. 统计分析

1. 使用 Spearman's Rho 计算器³³ 测量以下变量之间的关联强度，P < 0.05，如下所述。
   1. 选择 SVF 细胞得率与 SVF 在第一代（P1）培养至 80%–90% 汇合所需天数（至 P1 天数）。
   2. 选择 SVF 在进入 P1 前后阶段的细胞得率。
   3. 考虑至 P1 天数与进入 P1 前的细胞得率。
   4. 选择 SVF 细胞得率与经确认的 ADSC 平均百分比。
   5. 计算经确认的 ADSC 百分比与进入 P1 前的细胞得率。
   6. 确定 BMI 与 SVF 细胞得率之间的关系。

8. 分化实验

1. 按照分化试剂盒的说明书进行分化实验（参见材料表）。图4展示了案例1的实验结果。

结果

所研究的九名个体的特征，包括其年龄、体重、身高和体重指数（BMI），如表1所示。

根据最初提供的细胞产量，计算接种到培养中的细胞体积，使其尽可能接近75 cm²培养瓶的容量。每种样本接种的体积详见表2。随后，根据初始细胞产量，为每种样本确定了不同的细胞接种体积：细胞产量较高的样本接种1 mL，产量中等的样本接种1.1 mL，产量较低的样本接种2 mL，以使各组之间的细胞接种量尽可能接近。当培养细胞达到约80%–90%融合度（图2A）时（约7.5 ± 4.5天），进行贴壁细胞的胰酶消化处理（表2和图2B）。

即使在胰酶消化前观察到相同的汇合度，传代前的细胞产量也存在较大差异（表2）。这可能是由于细胞以多层方式生长所致。如表2

讨论

分离得率
众所周知，在细胞治疗中通常需要进行冷冻保存，而该过程会导致显著的细胞损失，有时甚至超过50%^29,30,35。因此，提高分离初期细胞得率的技术改进至关重要。脂肪抽吸物的采集方法以及细胞的分离方法都应致力于保留更多数量的细胞，维持较高的细胞活力，并从起始材料中提取尽可能多的细胞，同时兼顾细胞的长期培养与后续操作。因此，必须进行直接的培养维持，以避免细胞发生凋亡、衰老或遗传不稳定性，从而确保细胞治疗对患者具有有效性和安全性。

据我们所知，目前尚无先前文献报道使用本研究中这一系列步骤来分离来源于脂肪抽吸物的间充质干细胞，该方法具有节省时间且成本效益高的优势。在本研究中，每个方法学步骤均依据文献进行设计，以期在细胞分离过程中获得最高的终末细胞产量。本研究所采用技术的新颖之处在于手动抽吸结合一系列脂肪抽吸物洗涤步骤，随后将收集袋静置。用于运输和处理脂肪...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.8 mL 冻存管	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL 聚氯乙烯转移袋	JP FARMA	80146150059
2% 阿利新蓝 S 溶液，pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
肾上腺素（1 mg/mL）	Hipolabor	NA
阿辛蓝溶液	Sigma Aldrich	1,01,647
抗生素-抗真菌剂 100 倍浓缩液	Gibco	15240062
BD FACSCalibur 流式细胞仪，使用 BD CellQuest Pro 分析软件	BD BioSciences	NA
10% 氯化钙	Merck	102379
4% 葡萄糖酸氯己定	VIC PHARMA	NA
胶原酶 I 型，粉末	Gibco	17018029
DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）	Gibco	11966025
无钙、无镁 DPBS（杜氏磷酸盐缓冲液，Gibco 细胞治疗系统）	Gibco	A1285801
含钙 DPBS（杜氏磷酸盐缓冲液，Gibco 细胞治疗系统）	Gibco	A1285601
胎牛血清	Gibco	10500056
4% 甲醛	Sigma Aldrich	1,00,496
倒置光学显微镜	Nikon Eclipse TS100	NA
活死细胞检测试剂盒	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
单克隆抗体：CD105	BD BioSciences	745927
单克隆抗体：CD11B	BD BioSciences	746004
单克隆抗体：CD19	BD BioSciences	745907
单克隆抗体：CD34	BD BioSciences	747822
单克隆抗体：CD45	DAKO	M0701
单克隆抗体：CD73	BD BioSciences	746000
单克隆抗体：CD90	BD BioSciences	553011
单克隆抗体：HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty 冷冻容器	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS（磷酸盐缓冲液）1×，pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro 脂肪生成分化试剂盒	Gibco	A1007001
StemPro 软骨生成分化试剂盒	Gibco	A1007101
StemPro 成骨生成分化试剂盒	Gibco	A1007201
带有一个带针注射位点的无菌连接器	Origen Biomedical Connector, USA	NA	代码标记：IBS
0.4% 台盼蓝溶液	Sigma Aldrich	93595
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 1×，含酚红	Gibco	25200056