方法文章

数字液滴PCR法定量分析小鼠视网膜AAV转导效率

DOI：

10.3791/63038

⸱

2021年12月25日

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1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Nanotechnology Research and Application Center (SUNUM), Sabanci University

本文内容

摘要

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该协议介绍了如何使用数字液滴PCR（dd-PCR）以及小规模AAV生产，玻璃体内注射，视网膜成像和视网膜基因组DNA分离来量化小鼠视网膜中的AAV转导效率。

摘要

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许多视网膜细胞生物学实验室现在经常使用腺相关病毒（AAV）进行基因编辑和调控应用。AAV转导的效率通常是至关重要的，这会影响整体实验结果。转导效率的主要决定因素之一是AAV载体的血清型或变体。 目前，各种人工AAV血清型和变体可用于宿主细胞表面受体的不同亲和力。对于视网膜基因治疗，这导致不同视网膜细胞类型的转导效率不同。此外，注射路线和AAV生产的质量也可能影响视网膜AAV转导效率。因此，比较不同变体、批次和方法的效率至关重要。数字液滴PCR（dd-PCR）方法以高精度定量核酸，并允许在没有任何标准品或参考的情况下对给定靶标进行绝对定量。使用dd-PCR，通过绝对定量注射视网膜内的AAV基因组拷贝数来评估AAV的转导效率也是可行的。在这里，我们提供了一种使用dd-PCR量化视网膜细胞中AAV转导率的简单方法。通过微小的修改，这种方法也可以成为线粒体DNA拷贝数定量的基础，以及评估碱基编辑的效率，这对于几种视网膜疾病和基因治疗应用至关重要。

引言

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腺相关病毒（AAV）现在通常用于各种视网膜基因治疗研究。AAV提供了一种安全有效的基因递送方式，免疫原性较低，基因组整合较少。AAV通过内吞作用进入靶细胞，这需要细胞表面受体和共受体结合1，2。因此，AAV对不同细胞类型的转导效率主要取决于衣壳及其与宿主细胞受体的相互作用。AAV具有血清型，每种血清型可以具有不同的细胞/组织向性和转导效率。还有人工AAV血清型和变异，通过化学修饰病毒衣壳，杂交衣壳的产生，肽插入，衣壳洗牌，定向进化和合理诱变产生3。即使氨基酸序列或衣壳结构的微小变化也会对与宿主细胞因子的相互作用产生影响，并导致不同的趋向性4。除了衣壳变异体外，其他因素，如注射途径和AAV生产的批次间变异，都会影响AAV在神经元视网膜中的转导效率。因此，需要可靠的方法来比较不同变体的转导速率。

大多数测定AAV转导效率的方法依赖于报告基因表达。这些包括荧光成像，免疫组织化学，蛋白质印迹或报告基因产物5，6，7的组织化学分析。然而，由于AAV的大小限制，包括报告基因来监测转导效率并不总....

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方案

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所有实验方案均被萨班哲大学伦理委员会接受，实验按照"视觉和眼科研究协会"的声明进行，用于研究动物

1. 小规模AAV生产12

  1. 使用15cm板在完整的10 mL DMEM / 10%FBS中培养HEK293T细胞，直到70-80%汇合。
  2. 用20μg辅助质粒（pHGT1-Adeno1），7μg衣壳质粒和7μgAAV2-CBA-tdTomato-WPRE载体和136μLPEI溶液（1mg / mL）在5mL DMEM中制备转染混合物。
  3. 将5mL制备的转染混合物加入含有10mL培养基的细胞培养皿中，并在37°C下孵育转染的细胞48-60小时。
  4. 转染后48-60小时收集培养基，并在37°C下以终浓度为250 U / mL用DNase I消化30分钟。
  5. 将消化的培养基在4000×g，4°C下离心30分钟，然后用0.22μm注射器过滤器将其过滤到预润湿的再生纤维素膜中100kDa。
  6. 将再生纤维素膜在4000×g，4°C下离心30分钟并弃去培养基。
  7. 用含有0.001%Pluronic F-68的PBS洗涤再生纤维素膜并在4000×g，4°C下离心30分钟。在每个步骤中丢弃 PBS。
  8. 从再生纤维素膜的....

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结果

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小规模AAV生产是一种快速有效的方法，可为玻璃体内注射提供载体（图1）。小规模AAV生产通常使滴度在1 x 1012 GC / ml的范围内，足以检测视网膜中的报告表达（图2）。使用滴定聚合酶链反应对 AAV 进行滴定可提供一致的结果。常规使用ITR2和WPRE特异性引物，并使用dd-PCR软件通过建模为泊松分布来计算每个靶分子的起始浓度。通过增殖稀释因子并最终确定计算，并转换为每mL的基因组拷贝。为该方案生产的AAV的滴度分别为1.63 x 1012 GC / mL和1.7x10 12 GC / ml，用于AAV2 / BP2和AAV2 / PHP.S 7，15。为了进行比较，对两种菌株使用相同的tdTomato表达结构。我们注射了大致相同滴度的AAV，用于AAV转导效率的定量。从上述浓度的AAV中注射1μL后，在1周和2周的时间点对动.......

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讨论

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在该协议中，我们生成了两个具有不同衣壳蛋白的AAV载体，然后相应地滴定它们。该协议最关键的步骤之一是产生足够量的AAV，这将在转导12，13之后产生可检测的报告者表达。

AAV的滴度也是调整玻璃体内注射AAV剂量的重要因素。一旦达到这些重要标准，就可以通过dd-PCR方法量化AAV的转导效率。

许多实验室正在使用定量 PCR （qPCR） 方法进行 AAV 滴定。基于qPCR的绝对定量方法需要具有已知量的目标DNA18的稀释度的标准曲线。然而，dd-PCR不需要标准曲线，因为它通过检测具有至少一个靶DNA拷贝的阳性液滴，直接量化给定样品中靶分子的总数。由于dd-PCR是一种终点分析，不需要标准曲线，因此qPCR反应过程中发生的效率问题与低效率PCR或标准曲线的质量一样，对dd-PCR来说不太重要 9。dd-PCR方法.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们要感谢Oezkan Keles，Josephine Jüttner和巴塞尔分子与临床眼科研究所的Botond Roska教授，复杂病毒平台对AAV生产的帮助和支持。我们还要感谢宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Jean Bennett教授的AAV8 / BP2菌株。动物工作在盖布泽技术大学动物设施进行。为此，我们感谢Leyla Dikmetas和Uygar Halis Tazebay教授对畜牧业的技术援助和支持。我们还要感谢Fatma Ozdemir博士对手稿的评论。这项工作得到了TUBITAK，授权号118C226和121N275以及Sabanci University Integration grant的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔半裙边 ddPCR 板BioRad12001925ddPCR
Amicon 过滤器MilliporeUFC910096AAV
C1000 TOUCH 96 深孔BioRad1851197ddPCR
C57BL/6JRj 小鼠品系JanvierC57BL/6JRj小鼠
DG8 垫圈BioRad1863009ddPCR
DG8 小柱BioRad1864008ddPCR
DMEMLonzaBE12-604QAAV
DPBSPAN BIOTECHL 1825AAV
液滴生成油 eva greenBioRad1864006ddPCR
液滴读取器油BioRad1863004ddPCR
FBSPAN BIOTECHp30-3306用于
PX1 的 AAV 箔密封件PCR 板密封器BioRad1814040ddPCR
胰岛素注射器BD 医用320933玻璃体内注射
氟烷ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET
麻醉剂 显微注射器 MM33世界精密仪器82-42-101-0000玻璃体内注射
美光 IV凤凰研究实验室美光 IV基于 3-CCD 彩色相机、图像采集卡和现成软件的显微镜系统使研究人员能够对小鼠视网膜进行成像。
Mydfrin（%2.5 盐酸去氧肾上腺素）AlconS01FB01瞳孔散大
Nanofil 注射器 10 &μ;l世界精密仪器NANOFIL玻璃体内注射
针 RN G36,25 毫米，PST 2世界精密仪器NF36BL-2玻璃体内注射
PEI-MAXPolyscience24765-1AAV
青霉素-链霉素PAN BIOTECHP06-07100AAV
质粒 pHGT1-腺 1质粒工厂PF1236AAV
Pluronic F-68Gibco24040032AAV
PX1 PCR 封板系统BioRad1814000ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen 超混合液BioRad1864034ddPCR
QX200 微滴检测仪/QX200 微滴发生器BioRad1864001ddPCR
分流器镊子观察器
MAKER - 长度 = 13.5 CM		内托架医疗EJN-160-0155视网膜分离
无菌注射器过滤器AISIMOASF33PS22SAAV
组织基因组 DNA 试剂盒EcoSpinE1070gDNA 分离
Tobradex（0.3% 妥布霉素 / 0.1% 地塞米松）AlconS01CA01抗炎/抗生素
Tropamid （% 0.5 托吡卡胺）Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.S01FA06瞳散
TurbonucleaseAccelagenN0103LAAV
Viscotears（卡波姆 2 mg/g）Bausch+LombS01XA20润滑剂滴眼液
异 N01AB06

参考文献

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  1. Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
  2. Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry.

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重印与许可

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标签

DNA AAV AAV

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