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方法文章

数字滴定PCR法用于定量小鼠视网膜中AAV转导效率

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DOI：

10.3791/63038

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2021年12月25日

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Nanotechnology Research and Application Center (SUNUM), Sabanci University

本文内容

摘要

本方案介绍了如何结合数字滴定PCR（dd-PCR）、小规模AAV制备、玻璃体内注射、视网膜成像及视网膜基因组DNA提取，定量小鼠视网膜中AAV的转导效率。

摘要

目前，许多视网膜细胞生物学实验室已常规使用腺相关病毒（AAV）进行基因编辑和调控应用。AAV转导效率通常至关重要，直接影响整体实验结果。决定转导效率的主要因素之一是AAV载体的血清型或变体。目前已有多种人工构建的AAV血清型和变体，它们对宿主细胞表面受体具有不同的亲和力。在视网膜基因治疗中，这导致不同视网膜细胞类型的转导效率存在差异。此外，注射途径以及AAV制备的质量也可能影响视网膜中AAV的转导效率。因此，比较不同变体、批次和方法的转导效率十分必要。数字滴定PCR（dd-PCR）方法能够高精度地定量核酸，且无需标准品或参照物即可实现对特定目标的绝对定量。利用dd-PCR，还可通过绝对定量注射后视网膜内AAV基因组拷贝数来评估AAV的转导效率。本文提供了一种利用dd-PCR定量AAV在视网膜细胞中转导率的简便方法。经过少量修改后，该方法也可用于线粒体DNA拷贝数的定量，以及评估碱基编辑效率，这对于多种视网膜疾病及基因治疗应用具有重要意义。

引言

腺相关病毒（AAVs）目前已被广泛用于多种视网膜基因治疗研究。AAVs 提供了一种安全且高效的基因递送方式，具有较低的免疫原性和较少的基因组整合风险。AAV 进入靶细胞的过程通过内吞作用实现，该过程需要病毒与细胞表面的受体和共受体结合1,2。因此，AAV 对不同类型细胞的转导效率主要取决于其衣壳以及与宿主细胞受体的相互作用。AAV 具有不同的血清型，每种血清型可能表现出独特的细胞/组织嗜性及转导效率。此外，还可通过病毒衣壳的化学修饰、杂合衣壳的构建、肽段插入、衣壳重排、定向进化以及合理诱变等方法，人工构建 AAV 血清型和变异体3。即使衣壳的氨基酸序列或结构发生微小改变，也可能影响其与宿主细胞因子的相互作用，从而导致嗜性发生变化4。除了衣壳变异体外，注射途径以及 AAV 生产过程中的批次间差异等因素也会影响 AAV 在神经视网膜中的转导效率。因此，建立可靠的比较不同变异体转导效率的方法十分必要。

目前大多数测定腺相关病毒（AAV）转导效率的方法依赖于报告基因的表达，包括荧光成像、免疫组织化学、蛋白质印迹或对报告基因产物进行组织化学分析5,6,7。然而，由于AAV载体存在容量限制，并不总是能够容纳报告基因以监测转导效率。使用强启动子元件（如杂合的巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子）或土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）作为mRNA稳定序列，进一步加剧了载体容量的问题8。因此，采用更直接的方法来确定注射后AAV的转导率将具有重要意义。

数字滴定聚合酶链式反应（dd-PCR）是一种从极微量样本中定量目标DNA的强大技术。dd-PCR技术依赖于将目标DNA和PCR反应混合物包裹在油滴中。每次dd-PCR反应包含数千个液滴，每个液滴均作为一个独立的PCR反应进行处理和分析9。通过对液滴的分析，可直接利用泊松算法计算出任何样本中目标DNA分子的绝对拷贝数。由于AAV的转导效率与其在神经视网膜中基因组的拷贝数相关，因此我们采用dd-PCR方法来定量AAV基因组。

本文介绍一种基于数字滴定聚合酶链式反应（dd-PCR）的方法，用于从视网膜基因组DNA中计算腺相关病毒（AAV）载体的转导效率6,10。首先，采用小规模制备方案生成表达tdTomato报告基因的AAV，并通过dd-PCR方法测定其滴度11。随后，将AAV通过玻璃体内注射导入神经视网膜。为评估转导效率，我们首先使用荧光显微镜结合ImageJ软件对tdTomato的表达水平进行定量分析。接着，提取基因组DNA，并利用dd-PCR对注射后视网膜中的AAV基因组进行定量。将tdTomato表达水平与dd-PCR定量得到的转导AAV基因组数量进行比较，结果表明dd-PCR方法能够准确量化AAV载体的转导效率。本研究提供的实验方案详细描述了基于dd-PCR技术定量AAV转导效率的方法。此外，该方案还展示了如何通过基因组DNA提取后的稀释倍数及dd-PCR结果，直接计算玻璃体内注射后被转导的AAV基因组的绝对数量。总体而言，该方法提供了一种强有力的替代方案，可用于替代报告基因表达分析，以定量评估AAV载体在视网膜中的转导效率。

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方案

所有实验方案均经萨班哲大学伦理委员会批准，并按照“视觉与眼科研究协会”关于实验动物使用的声明进行。

1. 小规模 AAV 制备12

  1. 使用15 cm培养板，在10 mL完全DMEM/10% FBS培养基中培养HEK293T细胞，直至细胞融合度达到70-80%。
  2. 在5 mL DMEM中制备转染混合物，其中包含20 µg辅助质粒（pHGT1-Adeno1）、7 µg衣壳质粒、7 µg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE载体以及136 µL PEI溶液（1 mg/mL）。
  3. 将5 mL制备好的转染混合物加入含有10 mL培养基的细胞培养皿中，将转染后的细胞在37 °C下孵育48-60小时。
  4. 在转染后48-60小时收集培养上清，加入DNase I至终浓度为250 U/mL，在37 °C下消化30分钟。
  5. 将消化后的上清在4000 × g、4 °C条件下离心30分钟，随后用0.22 µm针头滤器过滤，并收集至预先润湿的100 kDa再生纤维素膜中。
  6. 将再生纤维素膜在4000 × g、4 °C条件下离心30分钟，弃去滤过液。
  7. 用含0.001% Pluronic F-68的PBS洗涤再生纤维素膜，并在4000 × g、4 °C条件下离心30分钟，重复洗涤离心三次，每次均弃去PBS。
  8. 从再生纤维素膜的上层收集浓缩的AAV，并分装用于后续使用。
  9. 取5 µL新制备的AAV，加入DNase I（0.2 U/µL）在37 °C下消化15分钟用于滴度测定；随后在95 °C孵育10分钟，以同时灭活DNase I并降解病毒衣壳。
  10. 使用含0.05% Pluronic F-68的缓冲液对消化后的AAV进行10倍系列稀释。采用AAV2-ITR和WPRE引物进行滴定（表1）。滴度通过将dd-PCR结果乘以稀释倍数计算得出，结果转换为基因组拷贝数/mL（GC/mL）。
    注意：小规模AAV制备的浓度通常约为1 × 1012 GC/mL。本方案不适用于像AAV213这类不能有效将AAV释放到培养上清中的血清型。

2. AAV 的玻璃体内注射

  1. 设备准备
    1. 开始前，准备一支带有36 G钝针头的10 µL微量注射器。用70%乙醇冲洗五次，再用ddH2O冲洗五次，最后用PBS冲洗五次。
    2. 根据每次注射所需，将适量的AAV装入微量注射器中。
    3. 准备好手术针（缝线，丝线，6/0）、胶带、镊子和剪刀。
  2. 玻璃体内注射
    1. 在麻醉前，向每只眼睛滴加1滴含0.5%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素（例如Mydfrin）的眼药水，以扩大瞳孔。
    2. 使用5%异氟烷（1 L/min）对小鼠进行麻醉诱导，并在操作过程中维持1.5%异氟烷（1 L/min）。初次诱导时使用小型异氟烷麻醉舱。
    3. 通过翻正反射消失、回缩反射消失以及尾部夹捏反应来确认麻醉深度。
    4. 在注射操作前，向每只眼睛施用0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松无菌眼用溶液。滴眼液可防止角膜干燥，并发挥抗炎和抗菌作用。
    5. 使用手术钩固定上眼睑，轻轻向后牵拉以暴露眼球背侧部分。用胶带将钩子固定在实验台上以保持其位置稳定。
    6. 在解剖显微镜下，使用弯头虹膜剪剪除结膜（面积小于1 mm2），暴露巩膜。使用新的无菌胰岛素注射器（30 G）穿刺巩膜。
    7. 通过显微操作仪将微量注射器的针头经同一穿刺点插入，将针尖置于晶状体后方、眼杯中央位置。
    8. 缓慢向玻璃体腔内注射1 µL AAV2/BP2 和 AAV2/PHP.S 载体，其浓度分别为1.63 x 1012 GC/mL 和 1.7 x 1012 GC/mL。注射体积由手动控制。注射后留针1分钟，然后缓慢拔出针头。
    9. 松开眼睑，并在眼杯上涂抹含有0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松的抗炎抗菌外用凝胶。在随后几天内根据评分表监测和评估小鼠状况，评估指标包括外观（眼睛明亮、毛发整洁、弓背）、行为（活动能力、不动、自残）和体重，评分范围为0至3分。每项条件评分为0–3分，总分达到或超过3分即为终止实验的标准。
    10. 待动物恢复后，将其放回笼中。

3. 荧光与眼底成像

  1. 通过向每只眼睛滴加0.5%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素滴眼液，使小鼠瞳孔散大。
  2. 使用异氟烷按上述方法对动物进行麻醉，并通过轻捏足爪仔细评估麻醉深度。
  3. 将小鼠放置于成像台上，通过眼底相机检查确认瞳孔充分散大。在眼睛表面涂抹局部凝胶（0.2%卡波姆980），以防止麻醉期间角膜脱水，并作为成像时的耦合介质。
  4. 调整成像台位置，使其与物镜的接头对齐。根据需要调节成像台，使小鼠眼睛位于中心位置。当眼睛居中后，缓慢移动物镜直至其与眼睛接触。
  5. 在玻璃体内注射后1周和2周，对双眼进行眼底成像和荧光成像，以追踪tdTomato的表达情况（图3B）14。采用相同的成像参数获取眼底和荧光图像，以便比较报告基因的表达水平。

4. 视网膜分离

  1. 在2周时间点完成眼底和荧光成像后，通过吸入CO2处死动物以收集视网膜。
  2. 使用13.5 cm分离镊将眼球向前移动。
  3. 用镊子轻轻施压，移除晶状体及残留的玻璃体。
  4. 用精密弯头镊切断眼球与视神经的连接，并用同一把弯头镊轻轻挤压视网膜。
  5. 将分离的视网膜转移至微量离心管中。
  6. 将离心管放入液氮中，快速冷冻视网膜。

5. 组织基因组DNA提取

  1. 使用市售的基于蛋白酶K消化的组织基因组DNA试剂盒提取基因组DNA。
  2. 在55 °C、200 × g 条件下，用试剂盒中提供的蛋白酶K消化视网膜组织30分钟。
  3. 按照制造商说明书进行RNase孵育、洗涤缓冲液I和II的洗涤步骤，最后进行洗脱步骤。
  4. 最后一次洗涤后增加一次离心步骤，以去除残留的乙醇。
  5. 测定基因组DNA浓度，并将样品储存在-20 °C。

6. 采用微滴数字PCR分析小鼠视网膜样本以定量病毒基因组

  1. 将注射后视网膜的基因组DNA用0.05% Pluronic F-68溶液稀释，使每个样本的最终浓度达到1 ng/µL。
  2. 分别对WPRE和18S进行独立反应，使用靶标特异性引物，每种引物的终浓度为125 nM。
  3. 在20 µL的PCR反应体系中进行微滴生成，反应体系包含1 ng基因组DNA、125 nM引物和2× evagreen supermix。
  4. 将样本混合液加载至微滴生成芯片的中部区域。
  5. 完成样本加载后，向芯片底部一行加入70 µL微滴生成油。
  6. 将垫圈置于芯片上方，并放入微滴生成仪中，确保垫圈与芯片之间无间隙。
  7. 轻柔吸取顶部孔中生成的约40 µL微滴，将微滴溶液加入半裙边96孔PCR反应板中。
  8. 使用铝箔封口膜密封PCR板。
  9. 将PCR板放入96孔热封式PCR仪中，采用以下PCR程序：95 °C预变性5 min，随后进行40个循环（95 °C变性30 s，60 °C退火1 min），最后4 °C保持5 min，90 °C延伸5 min，再于4 °C无限期保存。每个循环的升温速率为2 °C/s，以确保微滴在每个步骤中达到准确温度。
  10. 将PCR板放入微滴读取仪中，使用dd-PCR软件对微滴进行定量分析。根据evagreen的特定设置建立分析模板。
  11. 使用一维图（荧光强度 vs 微滴数量）对每个样本的数据进行分析。设定阈值，使高于阈值的微滴判为阳性，低于阈值的判为阴性。随后应用泊松算法计算目标DNA的初始浓度（单位：copies/µL）。通过计算WPRE与18S的比值，评估AAV转导效率。

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结果

小规模AAV生产是一种快速高效的方法，可为玻璃体内注射提供载体（图1）。小规模AAV生产通常可获得约1 × 1012 GC/mL的滴度，足以在视网膜中检测到报告基因的表达（图2）。使用数字滴定PCR（dd-PCR）进行AAV滴度测定可获得一致的结果。常规使用ITR2和WPRE特异性引物，通过dd-PCR软件将目标分子的起始浓度建模为泊松分布进行计算。最终通过乘以稀释倍数并换算为每毫升基因组拷贝数（GC/mL）完成计算。本方案所制备的AAV2/BP2和AAV2/PHP.S的滴度分别为1.63 × 1012 GC/mL和1.7 × 1012 GC/mL7,15。作为对照，两种血清型使用了相同的tdTomato表达载体。我们注射了大致相等滴度的AAV，以量化AAV的转导效率。在注射上述浓度的AAV 1 µL后，分别于1周和2周时间点对动物进行成...

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讨论

在本实验方案中，我们构建了两种具有不同衣壳蛋白的AAV载体，并分别对其进行了滴定。该方案最关键的步骤之一是生产出足够量的AAV，以确保转导后能够检测到报告基因的表达12,13。

AAV滴定也是调整玻璃体内注射AAV剂量的重要因素。一旦满足这些关键条件，即可采用数字滴定PCR（dd-PCR）方法对AAV的转导效率进行定量分析。

许多实验室正在使用定量PCR（qPCR）方法对AAV进行滴度测定。基于qPCR的绝对定量方法需要一条标准曲线，该曲线包含已知数量目标DNA的不同稀释浓度样品18。然而，数字滴定PCR（dd-PCR）无需标准曲线，因为它通过检测含有至少一个拷贝目标DNA的阳性液滴，直接定量给定样品中目标分子的总数。由于dd-PCR是一种终点分析，且不需要标准曲线，因此在qPCR反应中可能出现的效率问题（例如低效PCR或标准曲线质量不佳）在dd-PCR中影响较小...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢巴塞尔分子与临床眼科学研究所复杂病毒平台的Oezkan Keles、Josephine Jüttner和Botond Roska教授在AAV生产方面提供的帮助与支持。我们还感谢宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Jean Bennett教授提供AAV8/BP2菌株。动物实验在盖布泽技术大学动物实验中心进行，对此我们感谢Leyla Dikmetas和Uygar Halis Tazebay教授在技术协助和动物饲养方面提供的支持。我们还感谢Fatma Ozdemir博士对稿件提出的宝贵意见。本研究得到土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）项目（资助号：118C226 和 121N275）以及萨班哲大学整合项目基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔半裙边ddPCR板BioRad12001925ddPCR
Amicon滤器MilliporeUFC910096AAV
C1000 TOUCH 96深孔PCR仪BioRad1851197ddPCR
C57BL/6JRj小鼠品系JanvierC57BL/6JRj小鼠
DG8密封垫BioRad1863009ddPCR
DG8微流控芯片BioRad1864008ddPCR
DMEM培养基LonzaBE12-604QAAV
DPBS缓冲液PAN BIOTECHL 1825AAV
Droplet generation oil eva greenBioRad1864006ddPCR
Droplet reader oilBioRad1863004ddPCR
FBS胎牛血清PAN BIOTECHp30-3306AAV
PX1 PCR板封膜机用铝箔封膜BioRad1814040ddPCR
胰岛素注射器BD Medical320933玻璃体内注射
异氟烷ADEKA ILAC SANAYI VE TICARETN01AB06麻醉剂
微量注射器MM33World Precision Instruments82-42-101-0000玻璃体内注射
Micron IVPhoenix Research LabsMicron IV基于3-CCD彩色相机、图像采集卡和现成软件的显微成像系统，可实现小鼠视网膜成像。
美多丽（2.5%盐酸去氧肾上腺素）AlconS01FB01瞳孔扩张
Nanofil微量注射器 10 μlWorld Precision InstrumentsNANOFIL玻璃体内注射
针头 RN G36，25 mm，PST 2World Precision InstrumentsNF36BL-2玻璃体内注射
PEI-MAXPolyscience24765-1AAV
青霉素-链霉素双抗PAN BIOTECHP06-07100AAV
质粒pHGT1-Adeno1PlasmidFactoryPF1236AAV
Pluronic F-68Gibco24040032AAV
PX1 PCR板封膜系统BioRad1814000ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBioRad1864034ddPCR
QX200微滴读取仪/QX200微滴生成仪BioRad1864001ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER
MAKER - 长度 = 13.5 cm		endostall medicalEJN-160-0155视网膜分离
无菌注射器滤器AISIMOASF33PS22SAAV
组织基因组DNA提取试剂盒EcoSpinE1070基因组DNA提取
托百士（0.3%妥布霉素 / 0.1%地塞米松）AlconS01CA01抗炎/抗生素
托吡卡胺（0.5%）Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.S01FA06瞳孔扩张
TurbonucleaseAccelagenN0103LAAV
维速达（卡波姆 2 mg/g）Bausch+LombS01XA20润滑型滴眼液

参考文献

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