一种改良的小鼠心肌梗死诱导简易方法

心肌梗死 （MI） 是全球死亡和残疾的重要原因之一 1,2,3,4,5。尽管及时进行了再灌注，但目前缺乏治疗心肌梗死后心脏重塑的有效疗法。相应地，在MI ^6,7,8的机理探索和治疗开发方面也做出了相当大的努力。值得注意的是，建立MI模型是实现这些目标的先决条件。

已经提出了几种方法（例如，异丙肾上腺素治疗、冷冻损伤、冠状动脉结扎等）来诱导小动物的心肌梗死模型。异丙肾上腺素治疗是诱导心肌梗死的简单方法，但不能诱发靶区梗死⁹。冷冻损伤通过冰晶的产生和细胞膜的破坏而不是直接缺血导致心肌坏死¹⁰。相比之下，冠状动脉结扎术可以精确控制梗死部位和梗死区域的范围，并忠实地再现梗死后的重塑反应^11,12。冠状动脉结扎术通常在插管、机械通气和开胸手术后进行，这在技术上具有挑战性^13,14。报道了几种改良的冠状动脉结扎方案（例如，无通气）并增强了心肌梗死的诱导，但缺乏详细的视觉演示^15,16,17。这些问题对希望使用MI模型进行研究的团体构成了重大的财务和技术障碍。本报告介绍了一种在小鼠中诱导心肌梗死的方法。目前的方法简单、省时，并且使用大多数实验室中容易找到的手术工具和设备。

涉及动物工作的实验是在上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物福利伦理委员会（R52021-0506）的所有必要批准下进行的。该研究使用了年龄在8-10周之间的雌性和雄性C57BL / 6J小鼠。

1.简易麻醉设备的准备（可选）

注意: 这是一个可选的术前设置，可以替换为第 2 节中提到的可滴定麻醉。在将此设置调整为动物程序之前，应咨询机构动物伦理委员会和兽医。

1. 取15 mL离心管，在距开口约3cm处垂直于管的长轴进行切口。
   注意: 确保切口大于管腔圆周长的一半，以便阀门可以成功插入。
2. 在切口和管口之间的离心机管壁上钻孔（直径，2 mm）。
3. 从塑料板上切下一块合适尺寸的阀门，然后将阀门插入管壁上的切口中。
   注意:该阀门可用于通过改变插入深度来控制异氟醚的释放速率。
4. 在通风橱内，切开管子底部并将其连接到氧气供应。在管子底端附近放置一个棉球，在棉球上加入 0.5 mL 异氟醚（如所得，参见 材料表），然后关闭阀门。
5. 通过用如上所述制备的管子掩盖小鼠来测试麻醉效果。通过脚趾捏合反应监测呼吸频率和麻醉深度。
   注意: 呼吸频率小于 10 次/10 秒提示过度麻醉，应调整瓣膜的插入深度。对于所有涉及麻醉的手术，必须使用装满活性炭片的气体过滤器（图1A-i），并且应在罩内进行手术。

2.手术准备和麻醉

1. 在手术当天准备和消毒所有必需的器械，包括一把镊子、一个微型蚊子止血器、一把手术剪刀、两对持针器、4-0 丝手术缝合线、6-0 丝手术缝合线、气体过滤器和光源（见 材料表）（图 1A）。
2. 戴上外科口罩和无菌手套。
3. 将脱毛膏涂在小鼠胸部并等待1分钟。用湿纱布轻轻擦去脱毛膏和头发。
4. 脱毛后用惯用手握住鼠标。通过吸入汽化的异氟烷（4%）和氧气供应（1L / min）来诱导麻醉，并维持在2-3%的异氟烷。
5. 通过缺乏脚趾捏合反应来确认充分麻醉。
6. 在双眼涂抹无菌眼霜，以防止角膜干燥。
7. 将小鼠固定在仰卧位的手术平台上。将聚维酮碘拭子（见 材料表）涂抹在胸部三次，并用无菌窗帘覆盖消毒后的胸部。

3.心肌梗死的诱发

1. 更换受污染的手套以确保无菌。
2. 用利多卡因局部阻滞后，沿着连接剑突和腋窝的线切开 0.5 厘米的皮肤。
3. 使用镊子和微型蚊子止血器钝性分离胸大肌和胸小肌，以暴露第四肋间隙。
4. 使用微型蚊子止血器打开第四肋间隙。
5. 用左手食指将心脏推向第四肋间隙，使心脏外化。
6. 用左手固定心脏，并用 6-0 缝合线将左前降支结扎在距其原点 3 毫米处。
7. 迅速将心脏放回胸腔。
   注意:将心脏外化不到 30 秒是安全的。
8. 手动轻轻按压胸腔，将空气排出胸腔。
9. 用 6-0 丝线缝合肋骨上的肌肉层。
10. 用 4-0 丝线缝合皮肤。
11. 手术后立即将小鼠放在垫子（37°C）上。
12. 每 4-6 小时皮下注射丁丙诺啡 （0.05-0.1mg/kg），以减轻术后疼痛长达 72 小时。
13. 完全恢复后，将手术小鼠放回笼子。
    注意:小鼠将在手术后3-5分钟内完全恢复。
14. 仔细监测小鼠并提供湿食物长达7天。

4. 收获组织

1. 通过颈椎脱位在心肌梗死建立后的不同时间点处死小鼠。
2. 将牺牲的小鼠固定在手术平台上的仰卧位。
3. 在上腹部做一个腹侧切口（~3-4厘米）。从胸腔两侧切掉肋骨，取下横膈膜。
4. 通过脑室内注射用10mL冷磷酸盐缓冲盐水（1x PBS，4°C）灌注心脏。
5. 通过切断主动脉根部收集心脏，并立即将心脏储存在-80°C。
   注:根据作者的经验，在储存后两周内进行TTC染色是可行的。
6. 用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色心脏。
   1. 使用剃须刀片在冰上将冷冻的心脏切成1毫米厚的部分。
   2. 将制备好的心切片在37°C的1%TTC溶液（溶解在1x PBS中）孵育10-15分钟。
      注意:孵育15分钟后，弃去TTC溶液，将染色的心脏切片浸入1x PBS中。
7. 使用数码相机拍摄切片。

实验方案和一些关键步骤如图1所示。简化的麻醉设备诱导麻醉。如图2A所示，诱导麻醉是稳定的，如常规呼吸频率（测试小鼠的呼吸频率为90-107次/分钟）所反映的那样。冠状动脉结扎术后，TTC染色分析显示心肌梗死成功诱导，心肌梗死后瘢痕大小发生时间变化（图2B）。同时，存活分析结果显示雄性和雌性C57BL / 6J小鼠在心肌梗死后7天内明显死亡（图2C，D）。心室破裂（雄性小鼠为56%;雌性小鼠为40%）是心肌梗死后死亡的常见原因。此外，心肌梗死后超声心动图评估显示成功诱导收缩功能障碍和心室重塑（图 2E、F）。

图 1:改良的心肌梗死诱导方法中的材料和关键步骤 。 （A） 本方案所需的手术器械和材料。（a） 4-0 真丝缝合线。（b） 6-0 蚕丝缝合线。（c） 镊子。（d） 剪刀。（e-f）针架。（g） 微型蚊子止血剂。（h） 光源。（i） 气体过滤器。（B）显示小鼠诱导心肌梗死的关键步骤的代表性图像。（a）麻醉后固定小鼠，并将聚维酮碘应用于手术部位。（b） 手术部位悬垂。（c） 用利多卡因局部阻断后在手术部位切开 0.5 厘米的切口。（d） 裸露的肋骨。箭头表示肋骨。（e） 解剖胸大肌和胸小肌，露出第四肋间隙。（f） 外化心脏。（克-高）用 6-0 丝线缝合结扎 LAD。箭头表示 LAD。（i） 将心脏放回胸腔。（j） 空气从胸腔排出。（k） 肌肉层用 6-0 丝线缝合在肋骨上，皮肤用 4-0 丝线缝合。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2:冠状动脉结扎术后的组织学和功能变化。 （A）通过简化麻醉设备麻醉的小鼠的呼吸频率（n = 10）。（B ） 在心肌梗死后不同时间点收集心脏切片（每颗心脏 4 片）的 TTC 染色结果。白色区域表示梗死区域，红色区域表示心肌存活。 （C） Kaplan-Meier 曲线显示雄性小鼠的心肌梗死后死亡率（每组 n=20）。 （D） Kaplan-Meier 曲线显示雌性小鼠的心肌梗死后死亡率（每组 n=20）。（E） 心肌梗死后不同时间点（假手术、心肌梗死后 3 天、7 天、21 天和 28 天）超声心动图分析的代表性图像。（F） 指定组左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）、左心室收缩末期直径（LVsD）和左心室舒张末期尺寸（LVdD）值的定量分析（n=5/组）。**p<0.01 或 ***p<0.001 对比。假;##p< 0.01 或 ###p< 0.001 对比。心肌梗死后 3 天，采用事后 Tukey HSD（诚实显着差异）检验进行单因素方差分析进行统计分析。 请点击这里查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。