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方法文章

真核生物糖原代谢研究的分光光度法

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DOI：

10.3791/63046

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2021年8月19日

1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

本文内容

摘要

介绍了一种利用可见光范围内的简易分光光度计测定糖原代谢关键酶活性的技术。

摘要

糖原是由从细菌到动物等多种生物合成的葡萄糖储存形式。该分子由α1,4-连接的葡萄糖残基组成的线性链构成，并通过引入α1,6-连接形成分支结构。要理解糖原的合成与降解如何被调控，以及糖原如何形成其特有的分支结构，必须研究糖原储存相关的酶。然而，目前研究这些酶活性最常用的方法通常依赖于某些并非所有研究人员都能获得的试剂或技术。本文介绍了一系列技术方法，这些方法在操作上简便、成本低廉，但仍能有效揭示糖原储存的调控机制。这些技术需要使用波长范围为330至800 nm的分光光度计，并假设使用者将采用一次性塑料比色皿进行实验。不过，这些方法易于按比例放大，也可修改后适用于微孔板读数仪，从而实现高通量平行分析。

引言

糖原在自然界中广泛分布，存在于细菌、多种原生生物、真菌和动物中。在微生物中，当营养物质受限时，糖原对细胞存活具有重要作用；而在哺乳动物等高等生物中，糖原的合成与降解有助于维持血糖水平的稳定1,2,3。因此，糖原代谢的研究对于微生物学和哺乳动物生理学等不同领域均具有重要意义。理解糖原代谢需要研究糖原合成（糖原合酶和分支酶）以及糖原降解（糖原磷酸化酶和去分支酶）的关键酶。目前测定糖原合酶、磷酸化酶、分支酶和去分支酶活性的金标准方法依赖于放射性同位素标记。例如，通常通过检测葡萄糖从UDP-[14C]葡萄糖（适用于动物和真菌酶）或ADP-[14C]葡萄糖（适用于细菌酶）掺入糖原的过程，采用终止式放射化学法测定糖原合酶活性4,5。类似地，糖原磷酸化酶的测定是在糖原合成方向上进行的，通过追踪[14C]葡萄糖-1-磷酸中的葡萄糖掺入糖原来完成6。分支酶的活性测定是通过检测该酶促进糖原磷酸化酶将[14C]葡萄糖从葡萄糖-1-磷酸掺入α1,4-连接链的能力来实现的7，而去分支酶活性则通过检测其将[14C]葡萄糖掺入糖原的能力来确定8。尽管这些放射性方法极为灵敏，可用于酶活性较低的粗制细胞提取物，但放射性底物成本高昂，且使用受到放射性同位素相关法规的限制。这些障碍使得许多研究人员难以采用此类测定方法。然而，多年来已陆续报道了多种用于测定这些酶的分光光度法。总体而言，这些方法最终依赖于检测NADH/NADPH的生成或消耗，或利用糖原与碘之间形成有色复合物的现象进行检测。因此，这些方法操作简便，仅需配备钨灯或氙闪光灯的普通分光光度计即可完成实验。

糖原合酶的分光光度法测定依赖于检测葡萄糖添加到生长中的糖原链时，从糖核苷酸供体释放出的核苷二磷酸9,10。下文方案第1节中所述的测定糖原合酶活性的操作步骤是对Wayllace等11所提出方法的改进，其偶联反应方案如下所示：

(葡萄糖)n + UPD-葡萄糖 → (葡萄糖)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + 磷酸烯醇式丙酮酸 → 丙酮酸 + ATP

丙酮酸 + NADH + H+ → 乳酸 + NAD+

糖原合酶将UDP-葡萄糖中的葡萄糖添加到糖原上。此过程中生成的UDP由核苷二磷酸激酶（NDP激酶）转化为UTP，该反应同时生成ADP。生成的ADP随后作为丙酮酸激酶的底物，丙酮酸激酶利用磷酸烯醇式丙酮酸作为磷酸供体，将ADP磷酸化。所产生的丙酮酸在乳酸脱氢酶催化下转化为乳酸，该反应消耗NADH。因此，该检测可连续进行，通过监测NADH消耗引起的340 nm处吸光度的降低来实现。该方法也可方便地适用于以ADP-葡萄糖作为葡萄糖供体的酶。在此情况下，偶联步骤更为简单，因为糖原合酶反应释放的ADP可直接被丙酮酸激酶利用。

目前有多种分光光度法可用于测定糖原磷酸化酶的活性。在经典方法中，酶促反应被逆向驱动，朝向糖原合成的方向进行，如下所示：

(葡萄糖)n + 葡萄糖-1-磷酸 → (葡萄糖)n+1 + Pi

在设定的时间间隔内，取出反应混合物的等分试样，定量测定所释放的磷酸盐含量12，13。据我们经验，该检测方法的应用受到一定限制，原因在于许多市售的葡萄糖-1-磷酸制剂中已含有可直接测得的游离磷酸盐，同时磷酸化酶作用又需要较高浓度的葡萄糖-1-磷酸。因此，我们常规采用另一种替代性检测方法，通过测定磷酸化酶降解糖原时所释放的葡萄糖-1-磷酸来实现检测13。该方法采用如下所示的偶联反应体系。

(葡萄糖)n + Pi → (葡萄糖)n-1 + 葡萄糖-1-磷酸

葡萄糖-1-磷酸 → 葡萄糖-6-磷酸

葡萄糖-6-磷酸 + NADP+ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H+

葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖变位酶的作用下转化为葡萄糖-6-磷酸，后者随后被氧化为6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时伴随NADP+还原为NADPH。下文方案第2节中详述的操作步骤源自Mendicino等14以及Schreiber & Bowling15所描述的方法。该检测可连续进行，通过测定340 nm处随时间增加的吸光度，从而确定反应速率。

分光光度法测定去分支酶活性依赖于检测该酶作用于磷酸化酶极限糊精所释放的葡萄糖含量16。该化合物是通过磷酸化酶对糖原进行彻底处理而制得。由于糖原磷酸化酶的作用在距离α1,6-分支点4个葡萄糖残基处停止，因此极限糊精中的糖原外链被缩短至约4个葡萄糖残基。本文所述的磷酸化酶极限糊精制备方法，源自Taylor等17以及Makino & Omichi18所建立的实验流程。

去分支化是一个两步过程。双功能去分支酶的4-α-葡聚糖转移酶活性首先将三个葡萄糖残基从分支点转移至附近α1,4-连接葡萄糖链的非还原末端。随后，分支点上剩余的单个α1,6-连接葡萄糖残基被α1,6-葡萄糖苷酶活性水解19。该检测通常以终止法进行，在特定时间（或一系列时间点）后释放的葡萄糖通过如下所示的偶联酶法进行测定：

(葡萄糖)n → (葡萄糖)n-1 + 葡萄糖

葡萄糖 + ATP → 葡萄糖-6-磷酸 + ADP

葡萄糖-6-磷酸 + NADP+ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H+

测定生成的NADPH可反映葡萄糖的产量。下文方案第3节所述步骤基于Nelson等人16所描述的方法。与其他依赖NADH/NADPH消耗或生成的方法类似，该检测方法具有较高的灵敏度。然而，若存在淀粉酶或其他葡萄糖苷酶，这些酶亦可从磷酸化酶极限糊精中释放出游离葡萄糖，从而造成显著干扰（见讨论部分）。

分支酶活性的比色测定依赖于以下事实：葡萄糖的α1,4-糖苷键链可形成螺旋结构，与碘结合生成有色复合物20。所形成复合物的颜色取决于α1,4-糖苷键链的长度。因此，由长而基本无分支的α1,4-连接葡萄糖链组成的直链淀粉与碘形成深蓝色复合物。相比之下，糖原的外链通常仅由6至8个葡萄糖残基组成，与碘形成橙红色复合物。若将直链淀粉溶液与分支酶共同孵育，分支酶在直链淀粉中引入分支，导致生成更短的α1,4-连接葡萄糖链。因此，直链淀粉/碘复合物的吸收峰向较短波长方向移动。本文所述方法源自Boyer & Preiss21的详细方案，分支酶活性通过测定直链淀粉/碘复合物在660 nm处随时间推移吸光度的降低来定量。

从上述讨论中可以明显看出，碘与α1,4-葡萄糖链形成的复合物颜色随链长变化，这意味着糖原/碘复合物的吸光度光谱应随糖原分支程度的不同而变化。事实确实如此，分支较少或外链较长的糖原比分支较多或外链较短的糖原在更长的波长处吸收光。因此，碘染色反应可用于快速获得关于糖原分支程度的定性数据22。当糖原与碘形成复合物时，所产生的橙棕色通常并不十分明显。然而，通过加入饱和氯化钙溶液可增强显色效果22。这种方法的灵敏度可提高约10倍，从而能够方便地分析微克量级的糖原。下文方案第4节所述的分支程度测定方法改编自Krisman建立的实验流程22。该检测只需将糖原样品与碘溶液和氯化钙混合于比色皿中，并采集330 nm至800 nm范围内的吸收光谱即可完成。随着分支程度降低，吸光度最大值向更长波长方向移动。

总体而言，本文所述方法为评估糖原代谢关键酶的活性以及获取糖原分支程度的定性数据提供了简单可靠的手段。

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方案

1. 糖原合酶活性的测定

  1. 按照表1所示，在实验前一天配制所需试剂的储备液。
组分配制方法
50 mM Tris pH 8.0将 0.61 g Tris 碱溶于约 80 mL 水中。  冷却至 4 °C。  用 HCl 调节 pH 至 8.0，并加水定容至 100 mL。
20 mM HEPES 缓冲液将 0.477 g HEPES 溶于约 80 mL 水中。  用 NaOH 调节 pH 至 7.0，并加水定容至 100 mL。
132 mM Tris/32 mM KCl 缓冲液 pH 7.8将 1.94 g Tris 碱和 0.239 g KCl 溶于约 90 mL 水中。  用 HCl 调节 pH 至 7.8，并加水定容至 100 mL。
0.8% w/v 牡蛎糖原称取 80 mg 牡蛎糖原，加入水中。  加水定容至 10 mL，轻轻加热并混匀，使糖原完全溶解。
100 mM UDP-葡萄糖将 0.31 g UDP-葡萄糖溶于水中，定容至 1 mL。  分装后于 -20 °C 冻存。  可稳定保存数月。
50 mM ATP将 0.414 g ATP 溶于约 13 mL 水中。  用 NaOH 调节 pH 至 7.5，加水定容至 15 mL。  分装后于 -20 °C 冻存。  可稳定保存数月。
100 mM 葡萄糖-6-磷酸 pH 7.8将 0.282 g 葡萄糖-6-磷酸溶于约 7 至 8 mL 水中。  用 NaOH 调节 pH 至 7.8。  加水定容至 10 mL。  分装后于 -20 °C 冻存。  至少可稳定保存六个月。
40 mM 磷酸烯醇式丙酮酸将 4 mg 磷酸烯醇式丙酮酸溶于 0.5 mL 20 mM HEPES 缓冲液（pH 7.0）中。  于 -20 °C 保存。  至少可稳定保存一周。
0.5 M MnCl2将 9.90 g MnCl2 溶于水中，定容至 100 mL。
NDP 激酶用适量水溶解冻干粉，配制成 1 U/µL 溶液。  分装后用液氮速冻，于 -80 °C 保存。  至少可稳定保存一年。

表1：测定糖原合酶活性所需的储备溶液。

  1. 在测定当天，通过将 4.5 mg NADH 溶解于 1.5 mL 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）中，新鲜配制 4 mM NADH 工作液。置于冰上保存，并避光。
  2. 将 UDP-葡萄糖、ATP、磷酸烯醇式丙酮酸和 NDP 激酶的储备液在冰上解冻。
  3. 将水浴预热至 30 °C。
  4. 在 1.5 mL 离心管中设置每项糖原合酶测定反应，加入 表 2 所列的反应混合试剂。
组分体积 (µl)
160 mM Tris/32 mM KCl 缓冲液，pH 7.8250
水179
100 mM 葡萄糖-6-磷酸，pH 7.858
0.8 % w/v 牡蛎糖原67
50 mM ATP80
4 mM NADH80
100 mM UDP-葡萄糖28
40 mM 磷酸烯醇式丙酮酸20
0.5 M MnCl28
终体积770

表2：糖原合酶活性测定反应体系的组成。

注意：为便于操作，可配制一种主混合液，其中包含完成计划中所有检测所需的上述每种试剂的足量成分。

  1. 准备一个空白反应，将上述混合物中的 NADH 替换为水。转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中，并用其在分光光度计上于 340 nm 处调零。
  2. 取 770 µL 反应混合物 aliquot 置于 1.5 mL 离心管中。加入 2 µL NDP 激酶和 2 µL 丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶混合液，轻轻混匀，于 30 °C 预孵育 3 分钟以预热反应体系。
  3. 加入含有糖原合酶的样品 30 µL（溶于 20 mM Tris 缓冲液，pH 7.8）；混匀后，将反应混合物转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。
  4. 将比色皿放入分光光度计中，以固定时间间隔记录 10 至 20 分钟内 340 nm 处的吸光度。以时间为横坐标，绘制吸光度变化曲线。
    注意：应进行一个对照反应，将糖原合酶样品替换为 20 mM Tris 缓冲液，以排除 NADH 非酶促氧化的影响。根据样品纯度不同，可能还需进行其他对照反应。详见“讨论”部分。
  5. 确定反应速率（详见结果部分）。

2. 糖原磷酸化酶活性的测定

  1. 按照表3所示配制储备溶液（实验前一天进行）。
组分操作步骤
125 mM PIPES pH 6.8将3.78 g PIPES溶于水中。  用NaOH调节pH至6.8，并加水定容至100 mL。
8% w/v 牡蛎糖原称取0.8 g牡蛎糖原加入水中。  加水定容至10 mL，轻轻加热或混匀以溶解糖原。  -20 °C冷冻保存。
200 mM 磷酸钠 pH 6.8将2.63 g Na2HPO4·7H2O和1.41 g NaH2PO4·H2O溶于水中。  加水定容至100 mL。
1 mM 葡糖-1,6-二磷酸将2 mg葡糖-1,6-二磷酸溶于4 mL水中。  分装后-20 °C冷冻保存。  可稳定保存至少数月。
10 mM NADP将23 mg NADP溶于3 mL水中。  分装后-20 °C冷冻保存。  可稳定保存至少数月。

表3：测定糖原磷酸化酶活性所需的储备溶液。

  1. 将水浴预热至 30 °C
  2. 在 1.5 mL 离心管中配制每份糖原磷酸化酶检测反应体系，加入下表所列的反应混合物试剂（表 4）。
组分体积 (µl)
125 mM PIPES 缓冲液，pH 6.8160
水70
8% w/v 牡蛎糖原100
200 mM 磷酸钠，pH 6.8400
1 mM 葡糖-1,6-二磷酸20
10 mM NADP20
终体积770

表4：糖原磷酸化酶活性测定反应体系的组成。

注意：为便于操作，可配制一份主混合液，其中包含完成计划中所有检测所需的上述每种试剂的足量。

  1. 准备一个空白反应，包含表4中列出的组分，但额外加入30 µL 25 mM PIPES缓冲液（pH 6.8，通过将125 mM PIPES缓冲液用水稀释5倍制备）。转移至一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，并在分光光度计上以340 nm波长设定零点。
  2. 取一份770 µL反应混合物置于1.5 mL离心管中。加入1 µL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和1 µL磷酸葡萄糖变位酶，轻轻混匀，并在30 °C下孵育3分钟，以预热反应混合物。
  3. 加入30 µL含有糖原磷酸化酶的样品（溶于25 mM PIPES缓冲液，pH 6.8）。混匀后将反应混合物转移至一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。
  4. 将比色皿放入分光光度计中，以340 nm波长在固定时间间隔下记录吸光度，持续10至20分钟。将测得的吸光度对时间作图。
    注意：应设置一个以25 mM PIPES缓冲液替代糖原磷酸化酶的反应作为对照。根据糖原磷酸化酶样品的纯度，可能还需设置其他对照（详见讨论部分）。
  5. 确定反应速率（详见代表性结果部分）。

3. 糖原脱支酶活性的测定

  1. 按照表5所示配制储备溶液（在实验前一天完成）。
组分配制方法
100 mM 马来酸缓冲液将 1.61 g 马来酸溶解于约 80 mL 水中。  用 NaOH 调节 pH 至 6.6，加水定容至 100 mL。
300 mM 三乙醇胺盐酸盐 / 3 mM MgSO4 pH 7.5将 27.85 g 三乙醇胺盐酸盐和 0.370 g MgSO4.7H2O 溶解于约 400 mL 水中。  用 NaOH 调节 pH 至 7.5，加水定容至 500 mL。
150 mM ATP / 12 mM NADP将 1.24 g ATP 溶解于约 10 mL 水中。  监测 pH，并在 ATP 溶解过程中加入 NaOH 以维持 pH 约为 7.5。  加入 0.138 g NADP。  用 NaOH 调节 pH 至约 7.5，加水定容至 15 mL。分装后于 –20 °C 保存，可稳定数月。
50 mM 磷酸钠缓冲液 pH 6.8将 32.81 g Na2HPO4.7H2O 和 17.61 g NaH2PO4.H2O 溶解于水中。  加水定容至 5 L。

表5：测定糖原脱支酶活性所需的储备溶液。

  1. 制备磷酸化酶极限糊精
    1. 将 0.3 g 牡蛎糖原溶解于 10 mL 的 50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 6.8）中。
    2. 将足量的磷酸化酶 A 冻干粉末溶解于 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中，使其酶活性达到 60 U。
      注：根据所购磷酸化酶 A 批次的不同，所需粉末质量会有所差异，通常在 5 至 10 mg 之间。
  2. 将 60 U 的磷酸化酶 A 加入糖原溶液中，并转移至透析袋内。在室温下用 1 L 的 50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 6.8）透析 8 小时。更换新鲜透析缓冲液后继续孵育过夜。
  3. 再加入 10 U 的磷酸化酶 A，并更换为新鲜透析缓冲液。8 小时后再次更换新鲜透析缓冲液，继续孵育过夜。
  4. 将透析袋内容物转移至离心管中，煮沸 10 分钟。冰上冷却后，在 10,000 × g 下离心 15 分钟。
  5. 将上清液转移至透析袋中，用 2 L 蒸馏水更换三次，每次 2 L，透析 8 小时。
  6. 将透析袋内容物转移至 50 mL 离心管中。测量体积，并加入两倍体积的冰冻无水乙醇以沉淀极限糊精。将离心管置于冰上静置 30 分钟。
    注：加入乙醇后应立即开始形成白色沉淀；若未形成，可加入一滴 3 M NaCl。
  7. 在 15,000 × g 下离心 15 分钟，弃去上清液。用约 30 mL 的 66% v/v 乙醇对极限糊精的白色沉淀物清洗两次。
  8. 将极限糊精转移至研钵中，使其在空气中完全干燥。干燥后用研杵研磨成粉末，并转移至合适的容器中保存；在 4 °C 下干燥保存。
  9. 若用作去分支酶底物，可配制 1% w/v 的水溶液。
  10. 将水浴预热至 30 °C。
  11. 将加热块或水浴预热至 95 °C。
  12. 准备四个 1.5 mL 离心管，每管中加入 100 µL 马来酸缓冲液、80 µL 磷酸化酶极限糊精和 10 µL 水。这些试管用于进行去分支酶活性测定。将其中两管标记为“反应管”，另两管标记为“对照管”。
  13. 在设定的时间点，向反应管中加入 10 µL 去分支酶样品，向对照管中加入 10 µL 用于制备去分支酶样品的缓冲液。在 30 °C 下孵育。
  14. 在指定时间点（例如孵育 5、10 和 20 分钟），从每个反应管和对照管中取出 50 µL 样品，立即放入 95 °C 的加热块或水浴中，加热 3 分钟。
  15. 在 15,000 × g 下离心 2 分钟，以去除沉淀的蛋白质。
    注：如有需要，此时可暂停实验流程。加热后的样品可在 -20 °C 冷冻保存，待后续进行释放葡萄糖的测定（见下文第 17 步）。
  16. 释放葡萄糖的测定
    1. 将 40 µL 加热后样品的上清液转移至一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，加入 833 µL 三乙醇胺盐酸盐/硫酸镁缓冲液、67 µL NADP/ATP 混合液和 60 µL 水。轻轻吹吸混匀，注意避免引入气泡。
      注：为便于操作，可预先配制主混合液，包含上述各试剂，总量足以完成计划中的所有测定。
    2. 通过混合 100 µL 马来酸缓冲液、80 µL 磷酸化酶极限糊精和 20 µL 水制备空白反应液。充分混匀后，取 40 µL 转移至一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。按步骤 3.17.1 所述加入 833 µL 三乙醇胺盐酸盐/硫酸镁缓冲液等试剂。
    3. 使用空白反应液在分光光度计上于 340 nm 处调零。
    4. 向每个比色皿中加入 0.5 µL 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。缓慢吹吸轻轻混匀。室温孵育 10 分钟后，记录 340 nm 处的吸光度。
      注：吸光度值应较低，表明样品中葡萄糖-6-磷酸污染较少。
    5. 向每个比色皿中加入 0.5 µL 己糖激酶。缓慢吹吸轻轻混匀。室温孵育 15 分钟后，记录 340 nm 处的吸光度。
    6. 继续在室温下孵育 5 分钟，再次记录 340 nm 处的吸光度。若吸光度较 15 分钟时升高，则继续孵育 5 分钟并再次检测吸光度。记录最终获得的 340 nm 吸光度值。
    7. 对每个样品，用己糖激酶加入后测得的最终吸光度减去葡萄糖-6-磷酸脱氢酶加入后测得的吸光度。将所得数值对相应样品与去分支酶孵育的时间作图。

4. 糖原分支酶活性的测定

  1. 实验前一天，先将 2.6 g KI 溶解于 10 mL 水中以配制碘/KI 溶液。在通风橱中称取 0.26 g 碘，并加入 KI 溶液中。
    注意：碘接触皮肤或吸入时有害。搅拌至碘完全溶解，于 4 °C 避光保存。同时配制 125 mM PIPES 缓冲液，pH 6.8（见表 3）。
  2. 开始实验时，配制酸化碘试剂的工作液。
    1. 取 45.7 mL 水于 50 mL 离心管中，加入 150 µL 碘/KI 溶液，随后加入 150 µL 1 M HCl。
    2. 充分混匀，于 4 °C 避光保存。该溶液在此条件下至少可稳定 3 天。
  3. 实验当天，新鲜配制 10 mg/mL 的直链淀粉溶液。
    1. 称取 50 mg 直链淀粉，转移至 15 mL 离心管中。
    2. 加入 200 µL 无水乙醇，轻轻振荡。
    3. 加入 500 µL 2 M KOH，轻轻振荡。
      注意：KOH 可引起严重皮肤灼伤和眼损伤。请使用适当的个人防护装备。
    4. 边轻轻振荡边加入 0.5 mL 水。若直链淀粉未完全溶解，可再加入 0.5 mL 水。
    5. 用 1 M HCl 将 pH 调整至约 6.5～7.0。
      注意：HCl 可能引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激。请使用适当的个人防护装备。
    6. 加水定容至终体积 5 mL。
    7. 通过 0.2 µm 注射器滤器过滤除菌，室温保存。切勿冷藏或冷冻。
  4. 将水浴锅预热至 30 °C。
  5. 准备十二个 1.5 mL 离心管，每管含 1 mL 酸化碘试剂，置于实验台上备用。这些试管用于终止支链酶反应。
  6. 准备四个 1.5 mL 离心管，每管含 150 µL 直链淀粉溶液、150 µL PIPES 缓冲液和 45 µL 水。这些试管用于进行支链酶活性测定。将其中两个标记为“反应管”，另两个标记为“对照管”。
  7. 在设定的时间点，向反应管中加入 5 µL 支链酶样品，向对照管中加入 5 µL 用于配制支链酶样品的缓冲液。于 30 °C 下孵育。
  8. 在指定时间点（例如孵育 5、10 和 15 分钟时），从每个反应管和对照管中取出 10 µL 反应液，加入含有 1 mL 酸化碘试剂的 1.5 mL 离心管中。再加入 140 µL 水，充分混匀，转移至一次性比色皿中。
    注意：样品应呈蓝色，溶液中不应有沉淀。该颜色在室温下至少可稳定 2 小时。
  9. 配制一个含 1 mL 酸化碘试剂和 150 µL 水的样品，充分混匀后转移至比色皿中。用此比色皿在分光光度计上于 660 nm 处调零。
  10. 测定十二个样品在 660 nm 处的吸光度。通过从各时间点含有支链酶（反应管）的吸光度中减去不含支链酶（对照管）的吸光度，计算支链酶反应速率。详见“代表性结果”部分。

5. 糖原分支的定性评估

  1. 通过将74.5 g无水氯化钙加入约40 mL水中并搅拌来制备饱和氯化钙溶液。再加入少量水并继续搅拌。用水定容至100 mL，并持续搅拌直至CaCl2完全溶解。
  2. 通过在15 mL离心管中将50 µL碘化钾/碘储备液（见上述步骤4.1）与13 mL饱和CaCl2溶液混合，配制碘/CaCl2显色工作液。充分混匀后，置于4 °C避光保存。此溶液在此条件下至少可稳定保存1周。
  3. 支链结构的测定
    1. 在1.5 mL离心管中，加入650 µL碘/CaCl2显色工作液和100 µL水，充分混匀。将溶液转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。
      注：比色皿中的溶液应呈澄清、淡黄色。
    2. 将比色皿放入分光光度计中，以波长扫描模式采集330 nm至800 nm的背景光谱。
    3. 在1.5 mL离心管中，加入650 µL工作浓度的碘/CaCl2显色试剂和50 µg牡蛎糖原。用水定容至750 µL，充分混匀后转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。
      注：比色皿中的溶液应呈澄清、深橙色/棕色。
    4. 将比色皿放入分光光度计中，采集330 nm至800 nm的吸收光谱。
    5. 对50 µg支链淀粉和30 µg直链淀粉样品，重复步骤4.4.3至4.4.4。
      注：支链淀粉样品应呈黄绿色，直链淀粉样品应呈绿色/蓝色，两种样品均应澄清。所形成的有色复合物在室温下至少1小时内稳定，吸收光谱无变化。
    6. 为初步判断未知糖原样品的支链结构，取25 µg至50 µg糖原与650 µL工作浓度的碘/CaCl2显色试剂混合。按上述步骤操作，用水定容至750 µL，充分混匀后转移至甲基丙烯酸甲酯比色皿中。
      注：糖原样品的颜色应为黄橙色至橙棕色，具体色调取决于样品中糖原的支化程度（外链长度）。样品应保持澄清。详见代表性结果部分。
    7. 采集吸收光谱。

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结果

糖原合酶活性测定
图1展示了使用纯化酶进行糖原合酶活性检测的代表性结果。在图A中，经过短暂的滞后期后，340 nm处的吸光度在约12分钟的时间内呈线性下降。图1A中吸光度变化速率约为0.12吸光度单位/分钟。吸光度变化速率在约0.010至约0.20吸光度单位/分钟之间为最佳，应调整所添加糖原合酶的用量，使反应速率落在该范围内。在图B中，显示了在检测中加入过多糖原合酶的结果，反应在前2分钟内即已完成。对照反应（本例中不含糖原合酶）在时间过程中未观察到可测的吸光度下降。如讨论部分所述，本检测中使用组织匀浆完全可行，但需增设额外的对照反应。

本方案采用牡蛎糖原作为底物，该底物适用于多种不同来源的糖原合酶。但需要注意的是，糖原合酶的活性可能因所用糖原类型的不同而表现出较大差异。因此，在开展任何深入研究之前，建议先对多种类型的糖原进行比较筛选。

该方案在反应体系中加入了葡萄糖-...

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讨论

总体而言，所介绍的各种方法的主要优势在于成本低、操作简便、速度快，且无需依赖专用设备。它们共有的主要缺点是与其它现有方法相比灵敏度较低。涉及NADH/NADPH生成或消耗的实验步骤的灵敏度较易估算。由于NADH/NADPH的摩尔消光系数为6.22 M-1 cm-1，通过简单计算可知，浓度变化约10–20 µM时即可被轻易检测到。根据本文所述的测定体积，这相当于能够检测约10–20 nmol的物质含量。可以说，这一灵敏度已相当可观。然而，通过调整放射性标记底物的比活性，可轻易使检测灵敏度超过分光光度法测定的极限。尽管分支酶活性测定和糖原分支的定性评估均依赖于碘与α1,4-连接的葡萄糖聚合物形成复合物，但两种测定的输出结果不同，其灵敏度也各不相同。下文将分别讨论每种测定方法的具体注意事项。

糖原合酶活性的测定
此处描述的偶联酶法检测可用于连续测定糖原合酶活性，适用于动力学参数的确定。该方法易于放大，且已有非常相似的方案被用于微孔板，从而可实现酶活性的高通量平行测定

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披露

目前没有已知与本工作相关的利益冲突，且本工作未获得可能影响其结果的财务支持。

致谢

作者感谢Karoline Dittmer和Andrew Brittingham提供的见解以及许多有益的讨论。本工作部分得到了爱荷华骨科教育与研究基金（IOER 03-17-05和03-20-04）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
来自糯玉米的支链淀粉（无直链淀粉）Fisher ScientificA0456
直链淀粉Biosynth CarbosynthYA10257
ATP，二钠盐MilliporeSigmaA3377
D-葡萄糖-1,6-二磷酸，钾盐MilliporeSigmaG6893
D-葡萄糖-6-磷酸，钠盐MilliporeSigmaG7879
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，I型，来自酵母MilliporeSigma10127655001
糖原，II型，来自牡蛎MilliporeSigmaG8751
己糖激酶MilliporeSigma11426362001
甲基丙烯酸酯比色皿，1.5 mLFisher Scientific14-955-128必须使用甲基丙烯酸酯材质，因为某些实验在340 nm或更低波长下进行
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐MilliporeSigmaN0505
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型二钠盐MilliporeSigma43420
核苷5'-二磷酸激酶MilliporeSigmaN0379
磷酸烯醇式丙酮酸，单钾盐MilliporeSigmaP7127
来自兔肌肉的磷酸葡萄糖变位酶MilliporeSigmaP3397
来自兔肌肉的磷酸化酶AMilliporeSigmaP1261
来自兔肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶酶混合物MilliporeSigmaP0294
UDP-葡萄糖，二钠盐MilliporeSigmaU4625

参考文献

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