真核生物糖原代谢研究的分光光度法

摘要

介绍了一种利用可见光范围内的简易分光光度计测定糖原代谢关键酶活性的技术。

摘要

糖原是由从细菌到动物等多种生物合成的葡萄糖储存形式。该分子由α1,4-连接的葡萄糖残基组成的线性链构成，并通过引入α1,6-连接形成分支结构。要理解糖原的合成与降解如何被调控，以及糖原如何形成其特有的分支结构，必须研究糖原储存相关的酶。然而，目前研究这些酶活性最常用的方法通常依赖于某些并非所有研究人员都能获得的试剂或技术。本文介绍了一系列技术方法，这些方法在操作上简便、成本低廉，但仍能有效揭示糖原储存的调控机制。这些技术需要使用波长范围为330至800 nm的分光光度计，并假设使用者将采用一次性塑料比色皿进行实验。不过，这些方法易于按比例放大，也可修改后适用于微孔板读数仪，从而实现高通量平行分析。

引言

糖原在自然界中广泛分布，存在于细菌、多种原生生物、真菌和动物中。在微生物中，当营养物质受限时，糖原对细胞存活具有重要作用；而在哺乳动物等高等生物中，糖原的合成与降解有助于维持血糖水平的稳定^1,2,3。因此，糖原代谢的研究对于微生物学和哺乳动物生理学等不同领域均具有重要意义。理解糖原代谢需要研究糖原合成（糖原合酶和分支酶）以及糖原降解（糖原磷酸化酶和去分支酶）的关键酶。目前测定糖原合酶、磷酸化酶、分支酶和去分支酶活性的金标准方法依赖于放射性同位素标记。例如，通常通过检测葡萄糖从UDP-[¹⁴C]葡萄糖（适用于动物和真菌酶）或ADP-[¹⁴C]葡萄糖（适用于细菌酶）掺入糖原的过程，采用终止式放射化学法测定糖原合酶活性^4,5。类似地，糖原磷酸化酶的测定是在糖原合成方向上进行的，通过追踪[¹⁴C]葡萄糖-1-磷酸中的葡萄糖掺入糖原来完成⁶。分支酶的活性测定是通过检测该酶促进糖原磷酸化酶将[¹⁴C]葡萄糖从葡萄糖-1-磷酸掺入α1,4-连接链的能力来实现的⁷，....

方案

1. 糖原合酶活性的测定

1. 按照表1所示，在实验前一天配制所需试剂的储备液。

组分	配制方法
50 mM Tris pH 8.0	将 0.61 g Tris 碱溶于约 80 mL 水中。  冷却至 4 °C。  用 HCl 调节 pH 至 8.0，并加水定容至 100 mL。
20 mM HEPES 缓冲液	将 0.477 g HEPES 溶于约 80 mL 水中。  用 NaOH 调节 pH 至 7.0，并加水定容至 100 mL。
132 mM Tris/32 mM KCl 缓冲液 pH 7.8	将 1.94 g Tris 碱和 0.239 g KCl 溶于约 90 mL 水中。&#....

结果

糖原合酶活性测定
图1展示了使用纯化酶进行糖原合酶活性检测的代表性结果。在图A中，经过短暂的滞后期后，340 nm处的吸光度在约12分钟的时间内呈线性下降。图1A中吸光度变化速率约为0.12吸光度单位/分钟。吸光度变化速率在约0.010至约0.20吸光度单位/分钟之间为最佳，应调整所添加糖原合酶的用量，使反应速率落在该范围内。在图B中，显示了在检测中加入过多糖原合酶的结果，反应在前2分钟内即已完成。对照反应（本例中不含糖原合酶）在时间过程中未观察到可测的吸光度下降。如讨论部分所述，本检测中使用组织匀浆完全可行，但需增设额外的对照反应。

本方案采用牡蛎糖原作为底物，该底物适用于多种不同来源的糖原合酶。但需要注意的是，糖原合酶的活性可能因所用糖原类型的不同而表现出较大差异。因此，在开展任何深入研究之前，建议先对多种类型的糖原进行比较筛选。

该方案在反应体系中加入了葡萄糖-.......

讨论

总体而言，所介绍的各种方法的主要优势在于成本低、操作简便、速度快，且无需依赖专用设备。它们共有的主要缺点是与其它现有方法相比灵敏度较低。涉及NADH/NADPH生成或消耗的实验步骤的灵敏度较易估算。由于NADH/NADPH的摩尔消光系数为6.22 M^-1 cm^-1，通过简单计算可知，浓度变化约10–20 µM时即可被轻易检测到。根据本文所述的测定体积，这相当于能够检测约10–20 nmol的物质含量。可以说，这一灵敏度已相当可观。然而，通过调整放射性标记底物的比活性，可轻易使检测灵敏度超过分光光度法测定的极限。尽管分支酶活性测定和糖原分支的定性评估均依赖于碘与α1,4-连接的葡萄糖聚合物形成复合物，但两种测定的输出结果不同，其灵敏度也各不相同。下文将分别讨论每种测定方法的具体注意事项。

糖原合酶活性的测定
此处描述的偶联酶法检测可用于连续测定糖原合酶活性，适用于动力学参数的确定。该方法易于放大，且已有非常相似的方案被用于微孔板，从而可实现酶活性的高通量平行测定

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
来自糯玉米的支链淀粉（无直链淀粉）	Fisher Scientific	A0456
直链淀粉	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP，二钠盐	MilliporeSigma	A3377
D-葡萄糖-1,6-二磷酸，钾盐	MilliporeSigma	G6893
D-葡萄糖-6-磷酸，钠盐	MilliporeSigma	G7879
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，I型，来自酵母	MilliporeSigma	10127655001
糖原，II型，来自牡蛎	MilliporeSigma	G8751
己糖激酶	MilliporeSigma	11426362001
甲基丙烯酸酯比色皿，1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	必须使用甲基丙烯酸酯材质，因为某些实验在340 nm或更低波长下进行
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐	MilliporeSigma	N0505
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型二钠盐	MilliporeSigma	43420
核苷5'-二磷酸激酶	MilliporeSigma	N0379
磷酸烯醇式丙酮酸，单钾盐	MilliporeSigma	P7127
来自兔肌肉的磷酸葡萄糖变位酶	MilliporeSigma	P3397
来自兔肌肉的磷酸化酶A	MilliporeSigma	P1261
来自兔肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶酶混合物	MilliporeSigma	P0294
UDP-葡萄糖，二钠盐	MilliporeSigma	U4625