微型显微镜体内钙成像是一种研究自由活动小鼠神经元动态和微环路的有力技术。本方案描述了进行脑部手术以利用微型显微镜实现良好体内钙成像的步骤。
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摘要
摘要
微型荧光显微镜（miniscope）是一种强大的工具，可用于 体内 对自由活动动物进行钙成像。相较于传统的多光子钙成像系统，该技术具有多项优势：（1）体积紧凑；（2）重量轻；（3）成本低廉；（4）可实现对自由活动动物的记录。本方案描述了用于深部脑区 体内 使用定制开发的微型显微镜记录系统进行钙成像。制备过程包括三个步骤：（1）通过立体定位将病毒注射至小鼠脑内目标区域，以利用基因编码的钙离子传感器标记特定神经元亚群；（2）植入梯度折射率（GRIN）透镜，将深部脑区的钙成像信号传递至微型显微镜系统；（3）在小鼠颅骨上固定微型显微镜支架，以便后续安装微型显微镜。为进行 体内 钙成像时，将微型显微镜固定在支架上，同时采集神经元钙信号图像和行为学记录。本手术方案适用于任何商用或定制的单光子及双光子成像系统，可用于深部脑区成像 体内 钙成像
引言
细胞内Ca2+信号转导是调控细胞生长、增殖、分化、迁移、基因转录、分泌以及凋亡的关键调节机制1。在神经元中，Ca2+信号转导受到精确调控，因其时空模式与膜兴奋性、神经递质释放以及突触可塑性等重要功能密切相关2。
体内钙成像是一种强大的技术，可用于解析与正常动物行为相关的基本神经环路表征，识别脑疾病动物模型中的异常神经活动，并揭示可能使这些异常环路恢复正常功能的潜在治疗靶点。目前两种常见的体内钙成像系统为双光子激光扫描荧光显微镜3,4,5,6和头戴式微型显微内镜（miniscope）7,8,9,10,11,12,13。传统的双光子显微镜具有显著优势，例如更高的分辨率、更低的噪声和更少的光漂白效应；然而，实验动物需要头部固定，从而限制了可开展的行为学研究类型3,4,5,6。相比之下，头戴式miniscope系统体积小、便携性强，使得在自由活动的动物中开展多种行为学测试成为可能7,8,9,10,11,12,13。
有两种主要的Ca2+ 指示剂，化学指示剂5,14 以及基因编码的钙离子指示剂（GECIs）15,16. Ca2+ 成像技术已通过使用高灵敏度的基因编码钙离子指示剂（GECIs）得到促进，这些指示剂借助病毒载体递送，可实现对目标神经环路中特定神经元的标记。持续改进GECIs的灵敏度、稳定性和对亚细胞区室的标记能力，使其成为多种应用的理想选择 体内 钙成像研究17,18,19.
成像过程中，脑组织对光的散射限制了光学成像的穿透深度，即使使用双光子显微镜也难以克服。然而，梯度折射率（GRIN）透镜能够解决这一问题，因为GRIN透镜可直接嵌入生物组织中，将深部脑区的图像传递至显微镜物镜。与由光学均质材料制成、需复杂曲面来聚焦成像的传统透镜不同，GRIN透镜的性能依赖于透镜材料内部折射率的渐变，从而通过平面表面实现聚焦20。GRIN透镜的直径可小至0.2 mm，因此可将微型化的GRIN透镜植入深部脑组织，且造成的损伤极小。
本文介绍了一种完整的深部脑手术操作流程 体内 钙成像。为演示目的，我们描述专门针对小鼠脑内侧前额叶皮层（mPFC）的脑部手术。 体内 钙成像记录 通过 由美国国家药物滥用研究所（NIDA/IRP）林博士团队自主研发的微型显微镜系统7,12实验过程包括两次主要的脑部手术。第一次手术是通过立体定位法将表达GCaMP6f（一种GECI）的病毒载体注射到内侧前额叶皮层（mPFC）。第二次手术是将GRIN透镜植入同一脑区。在完成上述脑部手术并恢复后，接下来的步骤是使用牙科水泥将微型显微镜固定座（基座）安装在小鼠颅骨上。 在体 Ca2+ 成像可在将微型显微镜安装到底座后任意时间进行。用于病毒注射和GRIN透镜植入的手术方案可与任何商用或定制的单光子及双光子深部脑成像系统兼容。 体内 钙成像
方案
实验方案遵循怀俄明大学的动物护理指南。本研究使用的为6月龄雄性C57BL/6J小鼠。该方法可用于靶向任何深部脑区 体内 钙成像。此处作为示例，靶向脑区为小鼠 mPFC（前后轴 (A/P)：1.94 mm，内外侧轴 (M/L)：0.5 mm，背腹轴 (D/V)：1.8 mm）。本方案基于先前发表的方案进行修改21.
1. 在mPFC中进行病毒的立体定位注射（图1）
- 手术准备
- 使用高压灭菌器对所有手术器械进行灭菌，并将其放置在无菌表面上。
- 用生理盐水预冲一支10 µL注射器，并预先填充5 µL生理盐水。将注射器连接至微泵（参见材料表）。
- 打开加热垫，将温度维持在35 °C。
- 将小鼠放入诱导室（5" x 10" x 4"，长×宽×高），通入5%异氟烷和1 L/min的氧气。密切观察并计数小鼠的呼吸频率。当小鼠呼吸频率降至每秒1次时，将其取出。
注意：可通过观察每次吸气时背部肌肉的上下运动来轻松监测小鼠的呼吸频率。 - 将小鼠置于远离手术区域的实验台面上使其稳定。使用剃毛器剃除小鼠头部至第一颈椎处的毛发。
- 将小鼠固定于立体定位仪（参见材料表）上，使用耳杆和鼻夹固定其位置。维持向立体定位仪输送1.5%异氟烷和0.5 L/min的氧气。
- 用干净的棉签将润滑性眼膏涂抹于双眼，以防止手术期间眼睛干涩。检测小鼠的足底反射，确认其已完全麻醉后再开始手术。
- 使用无菌棉签，分别以7.5%聚维酮碘溶液（参见材料表）和70%乙醇各擦拭无毛区域三次进行消毒。
- 在无毛区域皮下注射少量（50 µL）2%利多卡因。
- 使用手术刀沿中线做一条2 cm长的皮肤切口，暴露颅骨上的人字缝和前囟。
- 借助干燥棉签和尖头镊子去除颅骨上的筋膜。
- 当前囟和人字缝清晰可见后，使用牙科钻头（直径0.5 mm）的尖端测量前囟和人字缝的Z坐标（参见材料表）。调节鼻夹高度，直至前囟和人字缝处于相同的Z位置。
- 将0.5 mm牙科钻头定位至相对于前囟A/P: 1.94 mm、M/L: 0.5 mm的位置，钻穿颅骨。
注意：此处以小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）为目标脑区进行演示。本方案也可用于靶向其他深部脑区。例如，若目标脑区为伏隔核（NAc），则相应位置应为A/P: 0.9 mm、M/L: 1.2 mm。 - 使用30 G针尖去除硬脑膜，并用45°角锐头镊子清除所有骨碎片。
注意：清洁过程中可能损伤小血管而导致出血，属常见现象。使用无菌棉签止血，并用生理盐水冲洗该区域。定期滴加生理盐水以保持暴露的颅骨区域湿润。 - 通过微泵控制面板将病毒装入微升注射器。以50 nL/s的流速先吸取500 nL空气泡，再吸取800 nL病毒。
注意：为演示目的，此处将表达GCaMP6f（一种GECI）的1型腺相关病毒（AAV1），即AAV1-CamKII-GCamp6f，注射至mPFC（参见材料表）。病毒滴度为2.8 × 1013 GC/mL，注射前用生理盐水按1:2稀释。 - 将针尖轻触前囟顶部，记录前囟的Z坐标。随后将针移至钻孔上方，注入100 nL病毒，以确保针头未堵塞。
- 缓慢将针向下插入脑组织至目标D/V坐标1.75 mm，然后略微上移至D/V坐标1.65 mm。
注意：此操作旨在为病毒溶液的灌注创造一个小空腔。若目标脑区为NAc，则目标D/V坐标应为4.2 mm，随后略微上移至4.1 mm。 - 使用控制面板设置微泵以50 nL/min的流速注入500 nL病毒。按下控制面板上的RUN按钮开始注射。
注意：注射过程约需10分钟。注射完成后，需额外等待5–10分钟再将针头从脑组织中取出。注射期间应频繁滴加生理盐水，以保持暴露的颅骨区域湿润。 - 将针头缓慢上提并退出脑组织。以50 nL/s的流速连续两次注入500 nL体积。
注意：此步骤用于确认已向脑内准确注入适量病毒。第一次500 nL注射时，先释放病毒，随后出现气泡；第二次500 nL注射时，先出现气泡，随后流出生理盐水。此时注射器已准备好为下一只小鼠装载病毒。手术结束后，需用丙酮彻底清洗微升注射器和针头，再用生理盐水冲洗。 - 对齐皮肤边缘，使用4.0缝线小心缝合切口。在缝合部位涂抹抗生素软膏以预防感染。
- 将小鼠从立体定位仪上取下并放回其饲养笼中。将饲养笼置于33 °C培养箱中，直至小鼠恢复自主活动能力。
注意：小鼠通常在停止吸入异氟烷后10–15分钟内苏醒并开始活动。 - 当小鼠开始自主活动后，连续3天给予非甾体类抗炎药物（参见材料表）。术后让小鼠恢复14天后再进行GRIN透镜植入手术。
2. mPFC 中 GRIN 透镜的植入（图 1）
- 手术准备
- 配制含 124 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄ 的人工脑脊液（ACSF）2PO4，1.2 mM MgCl₂2，25 mM 葡萄糖，26 mM NaHCO₃3 和 2.4 mM CaCl₂2.
- 使用高压灭菌器对所有手术器械进行灭菌，并将其放置于无菌表面。
- 打开加热垫并将温度维持在 35 °C。
- 将1%琼脂糖融化后，置于42 °C水浴中备用。
注意：融化的琼脂糖可在水浴中保存数小时。 - 消毒GRIN透镜（直径1 mm，长度4.38 mm， 图2A在70%乙醇中放置15分钟，然后转移至装有生理盐水的试管中，充分冲洗后再进行植入。
注意：GRIN透镜（参见 材料表）被产生 通过 特殊玻璃中的银和锂离子交换，使其无毒且对神经元友好6,7然而，许多市售的梯度折射率（GRIN）透镜可能会析出有毒残留物，导致神经退行性病变，因此不适合长期植入活体脑组织中 体内 成像研究。这些GRIN透镜可能需要涂覆生物相容性材料（如聚对二甲苯C）以防止对邻近神经元产生毒性副作用22.
- 称重小鼠，并通过腹腔注射 Ketamine/Xylazine 混合物进行麻醉（参见 材料表（氯胺酮：100 mg/kg；赛拉嗪：15 mg/kg）。
注意：一只体重为30 g的小鼠在初始麻醉时需要300 µL的氯胺酮/赛拉嗪混合液（氯胺酮100 mg/mL，赛拉嗪1.5 mg/mL），术中追加麻醉时每次需给予150 µL氯胺酮（10 mg/mL）。为维持小鼠在整个手术过程中的麻醉状态，需至少每小时追加一次氯胺酮（50 mg/kg）。应通过评估足底反射频繁监测小鼠的麻醉深度。 - 用剃刀剃除手术区域的毛发，并用湿纸巾清理毛发。
- 将小鼠置于立体定位仪上，通过拧紧鼻夹和耳杆固定其位置。使用无菌棉签在两只眼睛上涂抹润滑性眼膏。通过评估足底反射确认小鼠是否完全麻醉。
- 用无菌棉签分别以7.5%聚维酮碘溶液和70%乙醇各消毒无毛区域三次。在股部肌肉注射2 mg/kg地塞米松，以降低手术相关性肿胀和炎症的风险。
- 在手术区域的皮下注射 50 µL 2% 利多卡因。
- 使用精细剪刀切除一块三角形皮肤区域，大小为1.5 cm（高）×1.0 cm（底边），位置从两眼之间的前部延伸至人字缝后方的后部。
- 使用精细镊子、微型刀片和棉签去除颅骨上的骨膜组织。
注意：在进行下一步之前，应将颅骨彻底清洁并干燥。 - 使用氰基丙烯酸酯（参见 材料表将皮肤边缘用氰基丙烯酸酯粘附到颅骨上。等待5分钟，直至氰基丙烯酸酯完全干燥。
- 使用0.5 mm钻头磨头，在调整鼻夹高度的同时，使前囟（bregma）和后囟（lambda）处于同一水平面。
- 将牙科钻头（直径1.2 mm）定位至前囟坐标A/P：1.94 mm，M/L：0.8 mm处。钻透颅骨。使用30 G针尖去除硬脑膜，并用45°斜角尖头镊清除所有骨碎片。
注意：如果未彻底清除，这些骨碎片可能会阻塞后续的抽吸步骤。 - 连接一根27 G手动打磨的钝端针头（图2B）连接至安装在呈10°倾斜角的机械臂上的持针器（图2C将持针器的另一端连接至实验室的真空系统。
注意：机械臂（参见 材料表由中国台湾林博士团队在NIDA/IRP开发，由自主开发的开源软件AutoStereota（https://github.com/liang-bo/AutoStereota）控制23 - 将针尖定位至刚好接触前囟点。通过点击将前囟点的Z坐标设为0 前囟 AutoStereota 上的按钮
- 设置 输入 X 值设为 0.8， 输入 Y 值为1.94， 输入 Z 将值设为 1.0，然后点击 查找 按钮，将针头移至颅骨钻孔的顶部。
- 调整针头位置至暴露的脑组织区域的中心 通过 AutoStereota
注意：若需将针头向侧方或内侧移动，请输入步长值，然后点击 侧向 或 内侧 AutoStereota 上的按钮。类似地，若需将针向前或向后、背侧或腹侧方向移动，请点击 头侧 或 尾侧 和 背侧 或 腹侧 按钮，分别。 - 打开真空泵，通过重力控制的管路系统用ACSF冲洗暴露的脑区（参见 材料表) 连接至尖端弯曲的30 G针头。ACSF持续用95% O₂2 和5% CO2 经0.2 µm滤膜过滤。
注意：ACSF 的流速约为 1.5 mL/min。混合气体的输出压力保持在约 3 psi。 - 借助 AutoStereota 软件逐层吸取脑组织图3).
注意：脑组织抽吸分4轮完成，以形成一个柱状孔隙（深1.8 mm，直径1 mm）。- 在 "zStep" 会话中，点击并选中第一行和第二行。将第一行的值设置为 0.2 和 1，将第二行的值设置为 0.15 和 4（图3A).
- 在 "模式" 环节，设置 针头尺寸 27 号针头和 1.2，套装 维度 0.9。其余所有值均采用默认值（图 3A).
- 依次点击 设置, 保持为零 和 开始 启动吸液的按钮。
注意：这是第1个st 吸取一轮。输入值表明，在第一阶段单层操作中，吸取深度为0.2 mm（从Z坐标0开始）；在第二阶段，吸取深度为0.15 mm，并连续重复4层。吸取分辨率为1.2，直径为0.9 mm。吸取过程中，可通过轨迹图面板实时监测针尖位置。完成此轮吸取后，形成一个深度为0.8 mm、直径为1 mm的柱状孔洞。针尖将返回中心位置，Z坐标为0。 - 在 "zStep" 在会话中，单击并选中第一行和第二行。将第一行的值设置为 1 和 1，将第二行的值设置为 0.15 和 4（图3B).
- 在 "模式" 环节，保持所有数值与上一轮相同（图3B).
- 依次点击 设置, 保持零 和 开始 启动吸液的按钮。
注意：这是第2个nd 吸取一轮。输入值表明，在第一阶段单层操作中，吸取深度为1 mm（从Z坐标0起算）；在第二阶段，吸取深度为0.15 mm，持续重复4层。完成此轮吸取后，形成一个深度为1.6 mm、直径为1 mm的柱状孔洞。 - 在 "zStep" 会话中，仅点击并选中第一行。将第一行的值设置为 1.8 和 1（图3C).
- 在 "模式" 环节，设置 针头尺寸 27 号针头和 2.2。其余所有参数均与上一轮相同（图3C).
- 依次点击 设置, 保持为零 和 开始 启动吸液的按钮。
注意：这是第3部分rd 吸取一轮。输入值表示吸取深度为1.8 mm（从Z坐标0起算），层数为1层。吸取分辨率为2.2。完成此轮吸取后，形成一个深度为1.8 mm、直径为1 mm的柱状孔洞。 - 在 "zStep" 会话中，仅点击并选中第一行。将第一行的值设置为 1.6 和 1（图3D).
- 在 "模式" 会话，设置 针头尺寸 27 号针头和 2.2，套装 维度 0.6 (图3D).
- 依次点击 设置, 保持零 和 开始 按钮，以开始抽吸。
注意：这是第4th 抽吸步骤。此步骤的目的是清除囊腔内积聚的血液。由于抽吸过程中常会破裂小血管，因此出血较为常见。为彻底清除血液，请停止人工脑脊液（ACSF）灌注5分钟，然后重新开启灌注。重复该操作4次。th 反复抽吸直至囊腔无血液残留。该方案可用于靶向其他任何深部脑区。例如，若靶向脑区为伏隔核（NAc），则背腹向（D/V）的最终对应Z坐标应为4.4 mm。
- 停止真空吸引和人工脑脊液灌注。将针头移至 Z 坐标 +2 mm 处，并位于中心点前方 0.5 mm。将无菌的 1 mm GRIN 透镜置入囊袋中。
- 保持针尖与暴露的GRIN透镜接触，以确保GRIN透镜处于10°角。用无菌软纸轻轻按压GRIN透镜的上表面，确保其下表面与脑组织紧密接触。
- 使用刮刀将融化的琼脂糖涂抹于GRIN透镜与脑组织之间的间隙。待琼脂糖凝固成胶后，用微型刀片去除多余的琼脂糖。
- 用生理盐水和棉签彻底清洁颅骨。在后续使用牙科水泥前，让颅骨自然晾干（参见 材料表应用。
- 从-20 °C冰箱中取出混合皿。将牙科水泥粉末与催化剂液体混合，然后在颅骨上涂抹一层自固化粘接树脂水泥；首先围绕GRIN透镜周围涂抹，随后覆盖整个暴露的颅骨表面。
- 等待5分钟，使其完全凝固。小心移除抽吸针。
- 在洁净的塑料孔中，将牙科水泥粉末、黑色木炭与液体混合，然后在第一层牙科水泥上涂抹一层该混合物。静置 5 分钟使其硬化。
- 使用PCR管制成的定制帽覆盖暴露的GRIN透镜以进行保护（图 2D). 使用氰基丙烯酸酯将帽状结构粘附到牙科水泥上。
- 皮下注射1 mL预热的生理盐水至小鼠体内，随后给予0.1 mg/kg的丁丙诺啡。将小鼠放回其原饲养笼中，将饲养笼置于33 °C的培养箱内，并持续监测小鼠直至其能够自主活动。小鼠从麻醉状态恢复至开始活动通常需要20–40分钟。
- 给予非甾体抗炎药物，并至少监测小鼠术后3天。让小鼠术后恢复30天。
3. 将微型显微镜固定座（基座）粘附到小鼠颅骨上（图1）
- 将小鼠置于诱导室中，使用 5% 异氟烷和 1 L/min 的氧气流速进行麻醉，直至其呼吸频率降至每秒 1 次。
- 将小鼠固定于立体定位仪上，使用耳杆和鼻夹固定其位置。持续输送异氟烷（1.5%）和氧气（0.5 L/min）。
- 在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏以保持湿润。开启加热垫并将温度维持在 35 °C。通过检测足底反射确认小鼠已完全麻醉。
- 使用尖头镊子轻轻取下覆盖在梯度折射率（GRIN）透镜上的帽盖。使用微型钻头彻底清除牙科水泥上的干燥氰基丙烯酸酯残留物（参见材料表）。
- 用小剪刀剪除牙科水泥周围区域的毛发。借助压缩空气除尘器清除碎屑。使用蘸有丙酮的棉签清洁 GRIN 透镜的上表面。
- 准备带有支架（底座）的微型显微镜。
- 将一个 #00-90 六角螺母（参见 材料表）放入底座的槽中，并涂抹氰基丙烯酸酯将其固定（图 2E）。
- 将聚四氟乙烯（PTFE）胶带紧密缠绕在微型显微镜的螺纹部分，并剪去多余胶带（图 2F）。
- 将微型显微镜固定到底座上，并使用锁紧螺钉将其牢固固定（图 2G）。
- 将微型显微镜连接至其数据线，并启动自主开发的、目前开源的 NeuView 软件（参见 材料表）。
注：NeuView 软件由 NIDA/IRP 的 Dr. Lin 团队为微型显微镜体内钙成像自主开发7,12，现为开源软件（https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0）。 - 在 NeuView 中，点击硬件，勾选LED1，然后点击流式传输按钮以查看实时图像（图 4A）。要停止实时传输，请点击停止按钮。
- 将微型显微镜安置于定制的微型显微镜支架臂（图 2H）上，该支架臂的 XYZ 位置可通过电动控制器调节（图 2I）。
- 将微型显微镜定位在暴露的 GRIN 透镜正上方，并使其与透镜表面平行。缓慢将微型显微镜向下移动靠近 GRIN 透镜，并调节其 Z 轴位置，直至找到最佳焦平面。
注：最佳焦平面通过比较多个可能的 Z 轴位置后确定，选择能最清晰显示大多数细胞体的焦平面。 - 在不改变微型显微镜位置的前提下，小心地在其底座周围涂上第一层牙科水泥。待水泥硬化后，轻轻移除支架臂，使微型显微镜能够独立稳固地立于小鼠头部。
注：牙科水泥在硬化后容易收缩，可能将微型显微镜从原始焦平面拉离。通常在涂抹牙科水泥前，会将微型显微镜的 Z 轴位置略微抬高，以补偿可能发生的位移。 - 在底座周围涂上第二层牙科水泥，填满所有缝隙，确保无 LED 光线从缝隙泄漏。让牙科水泥充分硬化。
- 将小鼠从立体定位仪上取下。松开锁紧螺钉，将微型显微镜从底座上拆下。将一个 3D 打印的保护帽插入底座，以保护暴露的 GRIN 透镜，并拧紧底座上的锁紧螺钉（图 2J）。
- 将小鼠放回其饲养笼中。
注：小鼠通常需要 10–15 分钟才能从异氟烷麻醉中苏醒并开始活动。
4. 微型显微镜安装与 体内 Ca2+ 成像（图1)
- 将微型显微镜安装至其基座上
- 将小鼠在诱导室中短暂麻醉（5% 异氟烷，1 L/min 氧气流速）。将小鼠置于洁净的实验台表面。
- 用小螺丝刀松开锁定螺丝，取下保护帽，并用浸有丙酮的棉签清洁GRIN透镜表面。
- 用聚四氟乙烯胶带紧密缠绕微型显微镜的螺纹部分，并将微型显微镜牢固地固定在小鼠头部的基座上。
- 将微型显微镜连接至电缆（图 2K），打开 NeuView 软件
- 在 NeuView 中，单击 硬件，检查 LED1，然后单击 流 按钮以查看实时图像（图 4A).
- 通过使用钝头镊子轻微拧紧或松开微型显微镜与底座之间的连接，调整微型显微镜相对于底座的位置，以确定最佳焦平面。
注意：最佳焦平面是通过比较多个可能的位置后确定的，应选择能够清晰显示大多数细胞体的那个位置。 - 拧紧锁定螺丝，然后将小鼠放回其饲养笼中。
- 在NeuView中，将LED光源功率调节至最佳水平。点击 捕获 然后 触发 开始录制并按下按钮 停止 150 帧之后。
注意：最低的LED功率决定了获得足够亮度图像的最佳LED功率水平。录制短时视频的目的是便于在后续重复成像时识别相同的焦平面。 - 将电缆从微型显微镜上断开。在开始实验前，让小鼠恢复至少30分钟。
注意：为保护微型显微镜，通常在此短暂期间内移除水瓶和导线式食物喂食器。若小鼠需要在笼内停留较长时间，建议提供市售的饮食凝胶（参见 材料表在家庭笼具中。
- 数据采集用于 体内 钙成像
注意： 体内 钙成像可与研究者希望进行的任何行为学测试同时开展。为演示目的，此处示例为 在体 Ca2+ 开放场测试中的成像。为实现这一目标，需要两台计算机。其中一台计算机配备商业软件（见 材料列表）来控制摄像机，以自动记录小鼠行为。另一台计算机配备 NeuView 软件，用于控制微型显微镜并记录钙信号2+ 图像- 打开行为摄像软件（参见 材料表）以通过直播功能查看小鼠行为实验区域。手动调整顶部相机的焦距（图 2L).
- 选择 触发/闪光 并检查 "启用/禁用触发器" (图4B）。点击 记录 按钮，使用 浏览 选择行为记录的保存位置，并选择所需的图像格式。
注意： "触发控制" 启用该功能可使行为记录由NeuView软件触发，从而实现行为帧与相应钙成像帧的时间同步。行为记录可保存为任意所需格式，通常以JPEG格式保存在指定文件夹中。 - 将小鼠靠近实验区域，并将微型显微镜连接至与数据采集系统（Data Acquisition System）相连的电缆图2L）（参见 材料表然后将小鼠置于旷场的中央。
- 使用NeuView软件的实时流功能，调节LED功率以优化钙成像的亮度。
注意：进行钙成像时，默认记录帧速率为每秒10帧。 - 在 NeuView 中，取消勾选 LED1，点击 捕获 然后 触发 按钮以开始录制，然后按下 停止 100 帧之后。
注意：此步骤用于在LED灯关闭的情况下记录约100帧的背景图像。 - 在行为摄像软件中，单击 开始录制 (图4C）。在 NeuView 中检查 LED1，点击 捕获，然后 触发 按钮以开始录制。按下 停止 3000 帧后。
注意：本步骤旨在同步记录钙成像与行为数据。开放场测试持续15分钟，通常分为三个5分钟的记录阶段，以避免微型显微镜因连续使用而过热。 - 将钙成像和行为记录数据保存至指定文件夹中。在每次记录前先记录背景信号，再重复进行另外两次记录会话，并将所有记录数据保存至指定文件夹。
- 将微型显微镜从其底座上拆下。
- 记录完成后，断开显微镜上的电缆连接。
- 将小鼠在诱导室中短暂麻醉（5% 异氟烷，氧气流速为 1 L/min）。将小鼠置于清洁、温暖的表面上。
- 拧开底座上的锁定螺丝，将微型显微镜从底座上取下。将保护帽重新盖回底座上，并拧紧锁定螺丝。将小鼠放回其饲养笼中。
结果
图1 展示了实验流程示意图，包括病毒注射、GRIN透镜植入、微型显微镜底座固定于小鼠颅骨等步骤，以及 体内 钙成像 通过 微型显微镜。整个过程耗时约2个月。 图2 展示了微型显微镜实验方案中描述的主要组件 体内 钙成像 图3 展示了 AutoStereota 软件在 GRIN 透镜植入过程中的操作界面。 图4 显示 NeuView 与行为记录软件在运行期间的界面 体内 钙成像
结果 体内 钙成像依赖于病毒注射和GRIN透镜植入手术的成功。 图5 显示一系列结果（即不成功、次优和良好）来自 体内 钙成像记录。在不成功的情况下，钙成像图像可能显得过暗或过亮，但通常显示无或仅有极少的活跃神经元。我们通常不会继续进行 在体 如果活跃神经元少于五个，则钙成像记录实验无效。一个良好的 体内 钙成像通常可揭示数百个活跃神经元。如果一次记录中活跃神经元少于一百个，则认为该记录为次优记录。
在次优和良好记录中 体内 进行了钙成像实验，并对后续数据进行了分析。 视频 1 显示一个代表性 体内 从小鼠 mPFC 记录钙成像数据。行为视频和钙成像数据通常分别处理。小鼠行为视频可进行人工评分，钙成像文件则使用 CaImAn 钙成像处理工具箱进行处理。24. 图6 显示了一个代表性细胞图谱及来自状态良好的若干钙信号轨迹 在体 钙成像记录
完成体内钙成像后，最后一步是确认病毒注射和GRIN透镜植入是否位于目标脑区。为此，先用磷酸盐缓冲液（PBS）灌流小鼠，随后使用4%多聚甲醛（PFA）固定。取出小鼠脑组织，在4% PFA中后固定12小时，并在4 °C的PBS中保存。然后使用振动切片机将脑组织切成50 µm厚的切片。脑切片经DAPI染色后在显微镜下观察（本方案中未详细描述）12。图7为一只实验小鼠位于前囟前约1.94 mm处的脑切片，显示了GRIN透镜植入的轨迹。GRIN透镜轨迹下方及周围区域的绿色荧光表明GCaMP6f在mPFC区域的表达。
图1实验流程示意图 (A) 在 mPFC 中进行病毒的立体定位注射。B在mPFC植入GRIN透镜。C将微型显微镜基座固定到小鼠颅骨上。D微型显微镜安装与 体内 钙成像 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：体内钙成像所需的主要组件。（A）直径为 1 mm、长度为 4.38 mm 的梯度折射率（GRIN）透镜。（B）用于脑组织抽吸的 27 G 手工打磨钝端针头。（C）与针头夹持器连接的机械臂。（D）由 PCR 管定制的保护帽，用于在将微型显微镜基座固定于小鼠颅骨之前保护暴露的 GRIN 透镜。（E）带有六角螺母的微型显微镜夹持器（基座）。（F）螺纹部分缠绕聚四氟乙烯（PTFE）生料带的微型显微镜。（G）通过锁紧螺钉固定在基座上的微型显微镜。（H）微型显微镜夹持臂。（I）自行构建的三维电动控制器，用于实现微型显微镜在 XYZ 方向上的精确移动。（J）固定在基座上的保护帽，用于在小鼠未进行体内钙成像时保护暴露的 GRIN 透镜。（K）连接至电缆的微型显微镜。（L）用于体内 Ca2+ 成像的数据采集系统。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：AutoStereota 软件在逐层脑组织吸液过程中的界面。（A）对应步骤 2.17.1 至 2.17.3 的界面。（B）对应步骤 2.17.4 至 2.17.6 的界面。（C）对应步骤 2.17.7 至 2.17.9 的界面。（D）对应步骤 2.17.10 至 2.17.12 的界面。红色框突出显示输入值。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：NeuView 软件与行为记录软件在运行期间的界面 体内 钙成像 (ANeuView 的界面。B，C行为记录软件的界面。红色框标出需要点击的按钮。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5最大投影荧光细胞图，用于展示可能结果的范围。 (A,B) 不成功 体内 钙成像结果不符合后续数据分析要求。 (A）呈暗色，且包含的活跃神经元少于5个。B）很明亮，但没有活跃的神经元。C) 来自次优条件的细胞图谱 体内 包含一些活跃神经元的钙成像。D) 来自优质样本的细胞图谱 在体 包含数百个活跃神经元的钙成像。比例尺： 100 μm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6：成功实验的代表性细胞图谱与钙瞬变 体内 钙成像 左侧面板为最大投影荧光细胞图，来自一个 体内 在开放旷场实验期间对mPFC进行钙成像记录。记录持续5分钟。右侧面板显示来自15个感兴趣区域（颜色匹配）的钙瞬变。比例尺： 100 μm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图7：实验小鼠的死后评估。 对实验小鼠mPFC区域中GCaMP6f表达及GRIN透镜植入的死后评估。矩形区域表示GRIN透镜植入路径。在GRIN透镜植入区域下方的绿色区域证实GCaMP6f已成功表达，且GRIN透镜被精确植入目标脑区。Cg，扣带皮层；PrL，前喙部皮层；IL，下边缘皮层。比例尺：400 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：NIDA定制微型显微镜系统与其他微型显微镜系统的比较7,8,9,10,11,13,25,26。请点击此处下载该表格。
视频 1：一个 体内 在开放旷场实验期间对小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）进行钙成像记录 出于演示目的，本视频仅展示1分钟的录制内容。原始录制帧速率为10帧/秒。本视频播放速度为原始录制速度的6倍。 请点击此处下载此视频。
讨论
神经科学的一个核心问题是理解神经动力学和神经回路如何编码和存储信息，以及它们在脑部疾病中如何发生改变。使用微型显微镜 体内 Ca2+ 成像系统，可同时监测自由活动动物局部微环路中数百个神经元的单个神经元活动。本文详细描述了用于病毒注射和GRIN透镜植入的手术方案，以制备适用于深部脑区成像的啮齿类动物模型 体内 Ca2+ 成像 通过 一套定制开发的微型显微成像记录系统。 表1 展示了我们的微型显微镜系统与其他商用及定制微型显微镜系统的比较7,8,9,10,11,13,25,26值得注意的是，采用本手术方案植入GRIN透镜可与任何商用或定制的单光子及双光子成像系统兼容，用于深部脑区成像 体内 钙成像
从病毒注射到微型显微镜体内钙成像数据的采集，整个实验过程至少需要两个月才能完成。这是一个复杂且劳动密集型的过程。实验的最终成功取决于多种因素，包括GECI的恰当选择、将病毒准确注射至目标脑区、目标神经元群体中病毒的充分表达、GRIN透镜精确植入目标位置、动物手术后的充分恢复，以及术后是否出现严重炎症反应、动物行为是否受到手术严重影响等。
两个关键步骤包括立体定位病毒注射和GRIN透镜植入。为演示目的，立体定位微量注射在小鼠mPFC中进行，使用腺相关病毒（AAV1）携带在CaMKII启动子控制下的GCaMP6f，该启动子可特异性标记mPFC中的锥体神经元。选择GCaMP6f是因为它是最快速且最敏感的钙指示剂之一，其半衰减时间为71 ms15。此外，AAV病毒介导的GCaMP6f表达持久（即数月），非常适合在神经退行性疾病小鼠模型的纵向研究中长期重复进行体内 Ca2+成像27。当前的手术方案可调整用于靶向其他任何脑区的不同细胞群体。多种可用的病毒工具可在特定年龄阶段对目标脑区内的特定神经元群体进行特异性标记。此外，研究人员还可利用Cre-LoxP重组系统以及多种现有的转基因小鼠模型，实现基因修饰，并研究其行为学和神经环路层面的结果28,29。
本方案的一个独特之处在于，在植入GRIN透镜（直径为1 mm）之前，先通过自动化逐层吸除脑组织。该操作借助连接至真空系统的27 G针头，并由自主设计的机械臂和软件控制完成23。根据我们的经验，该方法可为GRIN透镜提供均匀的接触表面，且相比手动吸除组织，对周围组织造成的损伤更小23。因此，该步骤在使用直径相对较大的GRIN透镜（例如1 mm）时具有明显优势。然而，对于直径较小的GRIN透镜（0.5 mm或0.25 mm），组织吸除可能并非必要，此时可直接沿30 G针头建立的引导通道植入透镜21。
除了上述两个关键步骤外，成功实施手术还需仔细考虑许多其他因素。（1）所有接触脑组织的器械均应灭菌，以防止感染。（2）所有手术操作均需尽量减少对脑组织的损伤，以避免进一步引发炎症和过度瘢痕组织形成。（3）手术过程中初始给予及维持使用的麻醉剂量，特别是腹腔注射的麻醉剂，需谨慎确定。根据不同的小鼠品系，麻醉剂量可能需要调整，因为某些品系可能更为敏感。（4）手术期间需持续监测小鼠的生理状况。最后，（5）术后需对小鼠进行定期监测，因为手术后可能发生多种并发症。
尽管在GRIN透镜植入过程中会单侧移除一部分脑组织，但我们并未观察到明显的行为缺陷7,12。微型显微镜的重量约为2克，所使用的电缆经过定制设计，以减轻重量并确保小鼠能够轻松携带。微型显微镜和电缆仅在 in vivo 成像前连接到动物身上，并在成像结束后拆除。整个成像过程通常不超过30分钟。因此，这些装置不会妨碍小鼠自由活动。微型显微镜的安装与拆卸需要短暂使用异氟烷进行麻醉（少于2分钟），以固定动物。我们通常让小鼠在短暂暴露于异氟烷后恢复30分钟，再进行 in vivo 成像。我们已每周进行一次微型显微镜 in vivo 钙成像，持续数周，未发现对小鼠健康或社会行为产生任何影响12。
当前微型显微镜记录系统的一个主要局限是需要通过电缆连接显微镜以进行数据采集。电缆的存在有时会限制小鼠的任务表现，并且每次只能记录一只动物。最近，一种无线微型显微镜已被开发出来25,26。这将拓展动物行为任务的应用范围，并实现对群体中多只动物同时进行体内成像。此外，开发具有光谱可分离波长的更高灵敏度基因编码钙指示剂（GECI），并结合双色微型显微镜，将为神经科学研究带来更多令人期待的可能性。
披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为5P20GM121310、R61NS115161和UG3NS115608。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.6 mm 和 1.2 mm 钻头 | KF technology | 8000037800 | 用于开颅手术 |
| 27 号和 30 号针头 | BD PrecisionGlide Needle | REF 305109 和 REF 305106 | 两种手术均使用 |
| 45° 角镊子 | Fine Science tools | 11251-35 | 用于手术 |
| 7.5% 聚维酮碘溶液（贝塔碘） | Purdue Products L.P. | NDC 67618-151-17 | 表面消毒剂 |
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 179124-1L | GRIN 镜头清洁剂 |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539-25G | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 抗生素软膏 | HeliDerm Technology | 81073087 | 用于病毒注射 |
| 抗炎药物（布洛芬） | Johnson & Johnson Consumer Inc | 30043308 | 术后镇痛 |
| AutoStereota | NIDA/IRP | github.com/liang-bo/autostereota | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 行为记录软件（Point Grey FlyCap2） | Point Grey | Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C | 用于行为记录 |
| 黄铜六角螺母 | McMASTER-CARR | 92736A112 | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 丁丙诺啡 | Par Pharmaceuticals | NDC 4202317905 | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 氯化钙 | Sigma | 10043-52-4 | 用于配制 aCSF |
| 换向器 | NIDA/IRP | 定制设计 | 图像采集系统的组件 |
| 压缩氧气和二氧化碳气罐 | Rocky Mountain Air Solutions | BI-OX-CD5C-K | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 压缩氧气气罐 | Rocky Mountain Air Solutions | OX-M-K | 用于病毒注射 |
| 无线微型钻机 | KF technology | 8000037800 | 用于开颅手术 |
| 氰基丙烯酸酯胶 | Henkel Coorporation | # 1811182 | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 数据采集控制器 | NIDA/IRP | 定制设计 | 图像采集系统的组件 |
| 数据传输电缆 | NIDA/IRP | 定制设计 | 图像采集系统的组件 |
| 牙科水泥套装 | C&B Metabond 和 Catalyst | A00253revA306 和 A00168revB306 | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 牙科水泥套装 | Duralay | 2249D | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 地塞米松 | VETone | NDC 1398503702 | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 葡萄糖 | Sigma | 50-99-7 | 用于配制 aCSF |
| 凝胶饲料 | Clear H20 | 72-06-5022 | 小鼠营养补充剂 |
| GRIN 镜头 | GRINTECH | NEM-100-25-10-860-S | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 加热垫 | Physitemp Instruments LLC. | #10023 | 手术期间维持小鼠体温 |
| 异氟烷 | VETone | V1 502017 | 麻醉剂 |
| 氯胺酮 | VETone | V1 501072 | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 利多卡因 | WEST-WARD | NDC 0143-9575-01 | 局部麻醉 |
| 六水合氯化镁 | Sigma | 7791-18-6 | 用于配制 aCSF |
| 微量注射器（Hamilton） | Hamilton | 7653-01 | 用于病毒注射 |
| 微量注射泵控制器 | World Precision Instrument | #178647 | 用于病毒注射 |
| 微型显微镜 | NIDA/IRP | 定制设计 | 用于成像 |
| 微型显微镜底座 | Protolabs | 定制设计 | 用于安装底座 |
| 微型显微镜固定臂 | NIDA/IRP | 定制设计 | 用于安装底座 |
| 微型显微镜保护帽 | Protolabs | 定制设计 | 用于保护微型显微镜 |
| 电动控制器 | Thorlabs | KMTS50E | 用于安装底座 |
| NeuView | NIDA/IRP | https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 | 用于活体成像 |
| 眼科软膏 | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | 眼科用药 |
| PCR 管 | Thermo Scientific | AB-0622 | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 夹钳 | World Precision Instrument | 14040 | 用于夹紧管路 |
| 聚四氟乙烯（PTFE）胶带 | TegaSeal PTFE Tape | A-A-58092 | 用于将微型显微镜固定到底座 |
| 氯化钾 | Sigma | 7447-40-7 | 用于配制 aCSF |
| 机械臂 | NIDA/IRP | 定制设计 | 用于 GRIN 镜头植入 |
| 生理盐水 | Hospira | RL 7302 | 两种手术均使用 |
| 紧定螺钉 | DECORAH LLC. | 3BT-P9005-00-0025 | 用于将黄铜六角螺母拧入微型显微镜底座 |
| 硅胶管，内径 0.062”，外径 1/8” | McMaster | 2124T3 | 用于 aCSF 灌注 |
| 碳酸氢钠 | Sigma | 144-55-8 | 用于配制 aCSF |
| 氯化钠 | Sigma | 7647-14-5 | 用于配制 aCSF |
| 磷酸二氢钠 | Sigma | 7558-80-7 | 用于配制 aCSF |
| 立体定位仪 | KOPF | Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic | 两种手术均使用 |
| 无菌棉签 | Puritan | REF 806-WC | 两种手术均使用 |
| 手术器械 | Fine Science tools | 11251-35 | 用于手术 |
| 缝合线 | Sofsilk | REF SS683 | 用于病毒注射 |
| 注射器滤器（0.22 µm） | Millex | SLGVR33RS | 用于 GRIN 镜头植入过程中过滤 aCSF |
| 病毒悬液（AAV1-CamKII-GCamp6f） | Addgene | 100834-AAV1 | 用于病毒注射 |
| 滴度：2.8 × 10^13 GC/ml | |||
| 赛拉嗪 | VETone | V1 510650 | 用于 GRIN 镜头植入 |
参考文献
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
- Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex. Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Komiyama, T., et al. Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice. Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).
- Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. Reorganization of corticospinal output during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).
- Barbera, G., et al. Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information. Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987(2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Jacob, A. D., et al. A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).
- Liang, B., et al. Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration. Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).
- Liberti, W. A., et al. Unstable neurons underlie a stable learned behavior. Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Bassett, J. J., Monteith, G. R. Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery. Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators. Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).
- Moore, D. T. Gradient-index optics: A review. Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).
- Yang, Y., et al. A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging. Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).
- Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173(2019).
- Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).
- Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome. Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).
- McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 5/05/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.
