一种持续分离小鼠心肌细胞的简单有效的方法

Summary

心脏病学细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非朗根道夫技术分离小鼠心肌细胞的适应性。

Abstract

对产生高质量心肌细胞的可重复但技术上简单的方法的需求对于心脏生物学研究至关重要。心肌细胞的细胞和分子功能实验（例如收缩、电生理学、钙循环等）是建立疾病机制的金标准。小鼠是功能实验的首选物种，所描述的技术专门用于分离小鼠心肌细胞。以前需要朗根道夫器械的方法需要高水平的训练和主动脉插管的精度，通常会导致缺血。该领域正在转向无Langendorff的分离方法，这些方法简单，可重复，并产生用于生理数据采集和培养的活肌细胞。与主动脉插管相比，这些方法大大减少了缺血时间，并导致可靠地获得心肌细胞。我们对无Langendorff方法的适应包括使用冰冷的清除溶液进行初始灌注，使用稳定平台以确保灌注过程中针头稳定，以及额外的消化步骤，以确保可靠地获得用于功能测量和培养的心肌细胞。这种方法简单快捷，几乎不需要技术技能。

Introduction

几十年来，心脏生物学文献中的一个重要思想是分子作用机制。必须建立作用机制才能发表可靠的研究。确定分子机制的成熟策略是分离的心肌细胞研究，这需要高质量的心肌细胞才能获得可靠的数据。对心肌细胞进行的细胞和分子实验以确定作用机制是研究收缩¹、电生理学²、钙 （Ca 2+） 循环³、肌纤维^{Ca 2+} 敏感性⁴、细胞骨架⁵、代谢⁶、激素的影响⁷、信号分子⁸、药物研究⁹ 的金标准等。小鼠因其易于基因操作、体积小、寿命相对较短、成本低等优点，成为大多数心脏生物学实验的首选物种¹⁰。然而，高质量小鼠心肌细胞的可靠分离在目前的技术中并非易事。

实验室分离心肌细胞已有近70年的历史¹¹。几乎所有分离心肌细胞的技术都依赖于通过各种酶（胶原酶、蛋白酶、胰蛋白酶等）对心脏的消化。在早期（1950 年代至 1960 年代），采用了块法，其中包括取出心脏，切成更小的碎片并与胶原酶/蛋白酶/胰蛋白酶¹² 在溶液中孵育。在 1970 年代，实验室实施了改进的"Langendorff"方法¹³，该方法使用基于冠状动脉灌注的分离技术（通过 Langendorff 装置用酶逆行灌注）分离心肌细胞;该技术仍然是今天该领域肌细胞分离的主要方法，~50年后¹⁴，^15，16。最近的工作已转向在体内插管心脏，以限制缺氧时间和缺血损伤，从而获得卓越的心肌细胞分离（更好的产量和更高的质量）¹⁷。最近，这已经演变成在体内进行无朗根多夫的心脏灌注¹⁸，^19，20，^21，22。我们已经在Ackers-Johnson等人¹⁸技术的基础上发展了无Langendorff心肌细胞分离技术，并从以前的许多分离技术中采用了各种组件。这些关键的适应措施包括注射冰冷的清除缓冲液和结合支撑平台以稳定针头，从而减少对心脏的操作。该技术还详细介绍了注射缓冲液的温度控制（37°C），由于EDTA灌注较少，因此减少了体内注射和消化之间的时间，如先前发表的¹⁸所示。通过减少心脏的操作，从而最小化穿刺部位的大小，可以获得冠状动脉的彻底和持续灌注。我们还通过二次块法消化、注射的清除缓冲液中的EDTA量以及改变pH值来改进该技术。与使用Langendorff设备相比，我们描述的技术更可靠，更高效，并且不需要大量的培训/实践（表1）。

Protocol

本研究中执行的所有程序均由俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会根据NIH指南批准。

1. 溶液制备

注意:缓冲液浓度请参见 表2 。

1. 预隔离（最多在肌细胞分离前 2 周）
   1. 灌注缓冲液基质:在 1 L 超纯 18.2 MΩ·cm H 2 O 中制备 1L 灌注缓冲液碱（NaCl、KCl、NaH₂PO 4、HEPES、葡萄糖和 BDM），在 0.22 μm 无菌过滤之前调节至 pH_7.4。储存在4°C直至隔离日。
   2. 清除缓冲液:在 1 L 超纯 18.2 MΩ·cm H 2 O 中制备 1L 清除缓冲液（NaCl、KCl、NaH₂PO 4、HEPES、葡萄糖、EDTA 和 BDM），在 0.22 μm 无菌过滤之前调节至 pH_7.4。储存在4°C直至隔离日。
   3. 100 mM CaCl 2储备溶液:称取1.11 g CaCl 2，溶解到100 mL超纯18.2 MΩ·cm H₂ O中，室温储存至分离之日。
   4. 自由酶等分试样:将 5 毫克消化酶溶解在 5 毫升无菌、无 RNase 的水中。准备0.8mL等分试样，并在-20°C下储存直至分离。
   5. 层压培养皿:将 100 μL 40 μg/mL 小鼠层粘连蛋白涂于无菌玻璃底 30 mL 培养皿中。静置30分钟，去除多余的层粘连蛋白。将层粘连蛋白放在培养皿上，在室温下紫外线孵育30分钟。储存在4°C直至分离日（层压培养皿可以使用长达2周）。
   6. DMEM 培养基:在生物安全柜中，将 2.5 mL FBS、0.5 mL 青霉素-链霉素 （50 U/mL-50 μg） 和 1 mL 500 mM BDM 加入 46 mL DMEM 中。储存在4°C直至分离日（培养基可使用长达2周）。
   7. M199培养基:在1升超纯18.2MΩ·cm H₂O中制备1升M199培养基（NaHCO₃，HEPES，L-谷胱甘肽，M199，BDM和BSA）。储存在4°C直至隔离日。
   8. 500 mM BDM 储备液:将 0.5 g BDM 加入 10 mL 超纯 18.2 MΩ·cm H₂O 中，储存在 4 °C 直至分离。
   9. 稳定平台创建:将橡皮泥围绕拧入鲁尔旋塞阀的针底部。模塑到将包含心脏的培养皿上，并确保针头处于适当的高度以进行心室注射（培养皿底部上方~5毫米）。
2. 隔离之日
   1. 灌注缓冲液:在分离当天，向100 mL灌注缓冲液基质中加入9.5 mg MgCl₂ 。在取出 30 mL 完成的灌注缓冲液之前，让其完全混合，并放入带有螺旋盖的干净、宽口、100 mL 玻璃瓶（消化缓冲液）中。
      注意:这些添加可以在分离当天进行，无需额外的pH调整，因为它们的添加对pH值的改变可以忽略不计。
      1. 取出 12 mL 灌注缓冲液并置于侧面（停止缓冲液）。将剩余的 58 mL 灌注缓冲液倒入另一个带螺旋盖的干净、宽口、100 mL 玻璃瓶中。在整个分离过程中将剩余的灌注缓冲液储存在37°C。
   2. 消化缓冲液:加入 7.5 μL 100 mM CaCl₂ 至 30 mL 灌注缓冲液，最终浓度为 25 μM。 在分离前，向消化缓冲液中加入 770 μL Libase 中，使终浓度为 26 μg/mL。
   3. 停止缓冲液:将 240 mg BSA 溶解在 12 mL 灌注缓冲液中。在整个隔离过程中储存在37°C。
   4. 清除缓冲液:准备 3 mL 透明缓冲液注射器并清除针头上的气泡。存放在冰上直至隔离。

2. 歧管准备

1. 用新鲜制备的灌注缓冲液清除温控歧管，小心确保没有气泡残留。使用鲁尔锁连接器，拧入 27 G 针，清除气泡。清除歧管对于成功隔离至关重要。

3. 动物制备

1. 在分离前立即腹膜内注射100mg / kg氯胺酮和20mg / kg甲苯噻嗪（按体重计）。该程序使用雄性，4个月大的C57Bl / 6小鼠。
2. 如果需要，将鼠标放在加热的手术垫上以促进镇静。撑起鼠标的手臂，并将四肢和尾巴的底部粘在蓝色的实验室尿布上。确保动物通过趾夹反射的撤回完全麻醉。在手术区域周围涂抹无菌窗帘。

4. 心肌细胞分离程序

1. 暴露小鼠的胸骨，并在中线的侧面，通过肋骨和腋窝近端切开。轻轻地完全切开横膈膜，确保浅切口以避免心脏。用止血器夹住胸骨，并将肋骨向后折叠以露出胸腔。
2. 轻轻地从心脏上取出心包，并完全切开下腔静脉，立即远端到心脏。使用带有 27 G 针头的 3 mL 注射器在 1 分钟内将 3 mL 冰冷的清除缓冲液快速注入心脏右心室。
3. 用镊子轻轻握住心脏，然后从身体上拉开，尽可能多地露出主动脉。使用止血器夹住升主动脉，注意不要夹住心房，并从胸部切除心脏。
4. 快速将夹紧的心脏转移到聚丙烯培养皿的盖子上，并加入约10 mL温热的灌注缓冲液。将夹紧的心脏放入支撑平台，并使用连接到歧管的稳定27G针头在5分钟内将10mL温控37°C灌注缓冲液注入左心室。
5. 将夹紧的心脏和支持平台转移到具有约5 mL消化缓冲液的培养皿中。将进样注射器更换为 50 mL 注射器与 25 mL 消化缓冲液。
6. 注射前清除歧管中的任何气泡和剩余的灌注缓冲液。小心地将针头更换到左心室心尖的相同针头位置。
7. 使用灌注泵使用50mL注射器将温控37°C消化缓冲液注射到左心室15分钟。用先前校准的水套控制溶液的温度，以在针头末端喷射37°C溶液。
8. 从心房取出心室并转移到 10 mL 烧杯中。向烧杯中加入 3 mL 消化缓冲液，并使用锋利的剪刀将心室切成大块。用铝箔覆盖烧杯，并置于预热至37°C的振荡水浴中5分钟。
9. 丢弃上清液，小心避免去除任何组织块。将组织块重悬于3mL消化缓冲液中，并研磨约4分钟或直到获得均匀的混合物。
10. 通过 70 μm 尼龙细胞过滤器将细胞过滤到 50 mL 聚丙烯管中。
11. 将滤液返回到14mL圆底聚丙烯管中，并以100rpm离心1分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于3mL终止缓冲液中。
12. 向重悬细胞中加入 54 μL 100 mM CaCl 2 储备液，使最终 CaCl₂ 浓度为 1.8 mM。此步骤也可以逐步执行以提高细胞产量。
13. 让活细胞在重力下沉降10分钟，然后除去含有死细胞的上清液。将沉淀重悬于储存溶液（灌注溶液与200μM CaCl₂）中。这些细胞现在可用于功能实验（即钙成像/收缩、膜片钳等）、培养等。
    注意:细胞也可以重悬于实验室或实验依赖的溶液中。

5. 细胞培养

1. 使用血细胞计数器或使用网格盖玻片通过现场视图计数对细胞进行计数。由于肌细胞非常大，使用血细胞计数器计数并不总是准确的。这用于了解从分离中获得的大约多少细胞。
2. 用DMEM培养基将细胞稀释至~25，000个细胞/mL。向每个孔中加入 1 mL 细胞溶液。
3. 在37°C，95%O 2，5%CO₂下孵育2小时。
4. 从每个孔中轻轻吸出 DMEM 培养基，并加入 2 mL M199 培养基。
5. 在37°C，95%O 2，5%CO₂下孵育长达24小时。

Results

在确定隔离是否成功时，有几个要素需要检查。首先，心肌细胞必须是杆状的，没有膜泡，例如 图1中分离的细胞。典型的分离将产生~80%的肌细胞呈杆状。如果分离产生的杆状细胞低于50%，则认为分离不成功，不使用心肌细胞。最后，心肌细胞应该是静止的。自发收缩的肌细胞表现出 Ca2+ 不耐受，并且会产生不可靠的数据。在使用上述技术进行的所有分离中，几乎所有分离都被认为是成功的。如果培养的心肌细胞呈杆状，没有膜泡或圆角边缘且存活率高，则认为它们是成功的（图2）。

表 1.我们的方法，Langendorff方法和以前发表的无Langendorff分离小鼠心肌细胞的方法之间存在差异的表格。请按此下载此表格。

...

Discussion

我们的无朗根多夫心肌细胞分离技术的主要优点是，它不需要插管朗根道夫器械，从而限制缺氧和缺血时间。与经典的朗根道夫技术不同，通常需要几分钟才能去除，清洁和悬挂心脏，通常会导致心肌细胞缺血性损伤，我们的方法包括通过冰冷的清除溶液进行体内血液清除。冰冷的清除缓冲液含有乙二胺四乙酸（EDTA），不可逆地螯合二价阳离子以有效去除钙，使其成为极好的抗凝剂，因此停止收缩²³。使用冰冷溶液通过减缓离子交换和细胞代谢率来抑制收缩，防止缺血造成的损害²⁴。通过消除对主动脉插管的需要，无Langendorff技术产生健壮的心肌细胞，从而产生更可靠的制备以产生可靠的数据，而Langendorff分离方法并不总是如此。

这是先前发表的无朗根多夫分离技术¹⁸ 的变体，其调整如 表1所示。最重要的是，这种技术引入了一个稳定平台，限制了必须从心脏移除和更换针头的次数。插入心室时引入针头的任何不必要的运动...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc BD Luer-Lok 注射器	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex 低型烧杯	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL 聚丙烯盖玻璃培养基储存瓶	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL 圆底聚丙烯试管，带盖	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-丁二酮一肟	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok 注射器	Fisher Sci	14-823-435
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD 注射器，无针	Fisher Sci	13-689-8
50 mL 锥形离心管	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS 太空凝胶加热垫	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" 皮下注射针	Becton Dickinson	305109
牛血清白蛋白	Sigma	A3803	热休克分数，冻干粉，基本上不含脂肪酸，>98%
氯化钙二水合	物 Sigma	C7902	>99%
D-（+）-葡萄糖	Sigma	G7021	适用于细胞培养，>99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC 处理的细胞培养皿	康宁	353003
FBS	R&D Systems （Bio-techne）	S11195
Fisherbrand Isotemp 加热浸没式循环器	Fisher Sci	13-874-432
Hartman 蚊式止血钳	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite 计数室套装	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
标记胶带	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 注射泵	kdScientific	788100
L-谷胱甘肽	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH 研究级	Sigma	5401135001	高嗜热菌蛋白酶浓度
M199	Fisher Sci	MT10060CV
氯化	镁Invitrogen	AM9530G
小鼠层粘连蛋白	康宁	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
氯化钾	Sigma	P5405	>99%
精密数字往复式水浴	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
氢钠	Sigma	S5761	适用于细胞培养
物 氯化钠	Sigma	S5886	>99%
磷酸二钠	Sigma	S5011	>99%
无菌细胞过滤器 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
学生精细剪刀	精细科学工具	91460-11
VWR 吸收性垫	子 Fisher Sci	NC9481815