一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

摘要

在心脏病学领域，细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非兰格多夫技术进行的改进，用于分离小鼠心肌细胞。

摘要

获得可重复且技术简便的高质量心肌细胞制备方法，对于心脏生物学研究至关重要。在心肌细胞上进行的细胞和分子功能实验（例如收缩、电生理、钙循环等）是揭示疾病机制的金标准。小鼠是功能实验的首选物种，而本方法专门用于小鼠心肌细胞的分离。以往依赖兰格多夫（Langendorff）装置的方法需要对主动脉进行插管，操作要求高超的技术和精确性，常导致缺血。目前研究领域正转向无需兰格多夫装置的分离方法，这类方法操作简单、可重复性强，并能获得可用于生理数据采集和培养的活心肌细胞。与主动脉插管相比，这些方法显著缩短了缺血时间，能够稳定地获得心肌细胞。我们对无兰格多夫装置方法的改进包括：首先使用冰冻的灌流清洗液进行初始灌注，采用稳定平台以确保灌注过程中针头稳固，以及增加消化步骤，以确保稳定获得适用于功能检测和培养的心肌细胞。该方法操作简便、快速，对技术要求较低。

引言

几十年来，心脏生物学文献中的一个核心概念是作用的分子机制。要发表可靠的研究，必须明确其作用机制。确定分子机制的一个成熟策略是分离心肌细胞研究，而该方法需要高质量的心肌细胞以获得可信的数据。在心肌细胞上进行的细胞和分子实验，用于阐明作用机制，是研究心肌收缩¹、电生理学²、钙（Ca²⁺）循环³、肌丝对Ca²⁺的敏感性⁴、细胞骨架⁵、代谢⁶、激素作用⁷、信号分子⁸以及药物研究⁹等领域的金标准。由于小鼠易于进行遗传操作、体型小、寿命相对较短且成本低等优势¹⁰，已成为大多数心脏生物学实验的首选物种。然而，利用现有技术可靠地分离出高质量的小鼠心肌细胞并非易事。

实验室分离心肌细胞已有近70年历史¹¹几乎所有分离心肌细胞的技术都依赖于对心脏的消化处理 通过 各种酶（胶原酶、蛋白酶、胰蛋白酶等）。在早期（1950年代至1960年代），采用组织块法，即将心脏取出后切成更小的组织块，置于含有胶原酶/蛋白酶/胰蛋白酶的溶液中孵育¹²20世纪70年代，实验室采用了改良的“Langendorff”方法¹³，该方法采用基于冠状动脉灌流的分离技术（通过朗格多夫装置进行酶的逆向灌流）来分离心肌细胞；约50年后的今天，该技术仍是该领域中心肌细胞分离的主要方法^14,15,16最近的研究已转向心脏插管技术 体内 以限制缺氧时间和缺血性损伤，从而获得更优质的 cardiomyocyte 分离效果（更高的得率和更佳的质量）¹⁷最近，这已发展为进行 体内无兰格多夫装置的心脏灌流^{18,19,20,21,22}我们基于Ackers-Johnson等人的方法，改进了无Langendorff装置的心肌细胞分离技术。¹⁸ 技术并借鉴了此前多种分离技术中的各个组分。这些关键改进包括注入冰冻的清除缓冲液，以及引入一个支撑平台以稳定针头，从而减少对心脏的操作。本技术中还详细描述了  注入缓冲液的温度控制（37 °C），可缩短两次之间的间隔时间 体内 注射和消化效果较差，原因是EDTA灌注减少，如先前发表的研究所示¹⁸通过减少对心脏的操作，从而最大限度地缩小穿刺部位的尺寸，实现冠状动脉的充分且持续的灌注。我们还采用二次组织块消化法对这一技术进行了优化。 注射的透明化缓冲液中EDTA的含量，并改变了pH值。我们所描述的技术更为可靠、高效，且与使用Langendorff装置相比，无需 extensive training/practice。表1).

方案

本研究中进行的所有实验程序均经俄亥俄州立大学机构动物照护与使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南要求。

1. 溶液配制

注意：缓冲液浓度请参见表2。

1. 分离前准备（心肌细胞分离前最多提前两周）
   1. 灌流缓冲液基础液：在1 L超纯18.2 MΩ·cm H₂O中配制1 L灌流缓冲液基础液（含NaCl、KCl、NaH₂PO₄、HEPES、葡萄糖和BDM）。在经0.22 µm无菌过滤前调节pH至7.4。4 °C保存至分离当天。
   2. 清洗缓冲液：在1 L超纯18.2 MΩ·cm H₂O中配制1 L清洗缓冲液（含NaCl、KCl、NaH₂PO₄、HEPES、葡萄糖、EDTA和BDM）。在经0.22 µm无菌过滤前调节pH至7.4。4 °C保存至分离当天。
   3. 100 mM CaCl₂储备液：称取1.11 g CaCl₂，溶于100 mL超纯18.2 MΩ·cm H₂O中。室温保存至分离当天。
   4. Liberase分装液：将5 mg消化酶溶解于5 mL无菌、无RNase的水中。分装为0.8 mL每份，-20 °C保存至分离当天。
   5. 包被培养皿：向无菌玻璃底30 mL培养皿中加入100 µL浓度为40 µg/mL的小鼠层粘连蛋白溶液。静置30分钟，吸除多余层粘连蛋白。将包被后的培养皿置于室温下经紫外照射孵育30分钟。4 °C保存至分离当天（包被的培养皿最多可使用两周）。
   6. DMEM培养基：在生物安全柜中，向46 mL DMEM中加入2.5 mL FBS、0.5 mL青霉素-链霉素（50 U/mL-50 µg）和1 mL 500 mM BDM。4 °C保存至分离当天（培养基最多可使用两周）。
   7. M199培养基：在1 L超纯18.2 MΩ·cm H₂O中配制1 L M199培养基（含NaHCO₃、HEPES、L-谷胱甘肽、M199、BDM和BSA）。在无菌过滤（0.22 µm滤膜）前调节pH至7.4。4 °C保存至分离当天。
   8. 500 mM BDM储备液：将0.5 g BDM加入10 mL超纯18.2 MΩ·cm H₂O中。4 °C保存至分离当天。
   9. 稳定平台制作：将橡皮泥围绕固定在鲁尔接头上的针头基部塑形。将橡皮泥塑形至可固定盛放心脏的培养皿，并确保针头高度适合心室注射（约高于皿底5 mm）。
2. 分离当天
   1. 灌流缓冲液：在分离当天，向100 mL灌流缓冲液基础液中加入9.5 mg MgCl₂。待完全混匀后，取出30 mL完全配制的灌流缓冲液，转移至洁净、广口、带螺旋盖的100 mL玻璃瓶中（作为消化缓冲液）。
      ​注：这些添加物可在分离当天加入，无需额外调节pH，因其对pH的影响可忽略不计。
      1. 取出12 mL灌流缓冲液并留置一旁（作为终止缓冲液）。将剩余的58 mL灌流缓冲液倒入另一洁净、广口、带螺旋盖的100 mL玻璃瓶中。在整个分离过程中将剩余的灌流缓冲液置于37 °C保存。
   2. 消化缓冲液：向30 mL灌流缓冲液中加入7.5 µL 100 mM CaCl₂，终浓度为25 µM。在开始分离前立即向消化缓冲液中加入770 µL Liberase，终浓度为26 µg/mL。
   3. 终止缓冲液：将240 mg BSA溶解于12 mL灌流缓冲液中。在整个分离过程中置于37 °C保存。
   4. 清洗缓冲液：用清洗缓冲液填充一支3 mL注射器，并排除针头中的气泡。冰上保存至分离开始。

2. 多通管路的准备

1. 使用新配制的灌流缓冲液冲洗温控多通管，注意确保无气泡残留。使用鲁尔锁接头旋紧一根27 G针头，并排除气泡。清除气泡的多通管是成功分离的关键。

3. 动物准备

1. 在分离操作前，立即按照 100 mg/kg 体重剂量通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮，并以 20 mg/kg 体重剂量注射赛拉嗪。本实验使用一只雄性、4 月龄的 C57Bl/6 小鼠。
2. 如有需要，将小鼠置于加热的手术垫上以促进镇静。将小鼠四肢展开，并用胶带将四肢及尾部基部固定在蓝色实验用吸水垫上。通过脚趾夹捏反射的消失确认动物已完全麻醉 。 在手术区域周围覆盖无菌手术巾。

4. 心肌细胞分离步骤

1. 暴露小鼠胸骨，在中线外侧沿肋骨向近端及腋窝方向剪开。轻轻完全剪断膈肌，注意切口要浅，避免损伤心脏。用止血钳夹住胸骨，将肋骨向后折叠，以暴露胸腔。
2. 轻轻去除心脏表面的心包膜，并在靠近心脏远端处完全剪断下腔静脉。使用装有27 G针头的3 mL注射器，在1分钟内快速将3 mL冰冻澄清缓冲液注入右心室。
3. 用镊子轻轻夹住心脏并稍向外牵拉，尽可能暴露主动脉。使用止血钳夹闭升主动脉，注意避免夹到心房，随后将心脏从胸腔中完整切除。
4. 迅速将夹闭的心脏转移至聚丙烯培养皿盖中，其中预先加入约10 mL温热灌注缓冲液。将夹闭的心脏置于支撑平台上，使用连接在多通管上的固定式27 G针头，在5分钟内向左心室注入10 mL温度控制在37 °C的灌注缓冲液。
5. 将夹闭的心脏及其支撑平台转移至含有约5 mL消化缓冲液的培养皿中。更换输入端注射器，换用装有25 mL消化缓冲液的50 mL注射器。
6. 在注射前清除多通管中的气泡及残留灌注缓冲液。小心地将针头重新插入左心室心尖的相同位置。
7. 使用灌注泵，通过50 mL注射器在15分钟内将温度控制在37 °C的消化缓冲液注入左心室。通过预先校准的水浴夹套控制溶液温度，确保针头末端释放的溶液温度为37 °C。
8. 将心室与心房分离后转移至10 mL烧杯中。向烧杯中加入3 mL消化缓冲液，使用锋利的剪刀将心室组织剪成较大块状。用铝箔覆盖烧杯，并置于预热至37 °C的振荡水浴中孵育5分钟。
9. 弃去上清液，注意避免丢失组织块。将组织块用3 mL消化缓冲液重悬，并吹打约4分钟，直至形成均匀混悬液。
10. 通过70 µm尼龙细胞筛过滤细胞，收集至50 mL聚丙烯离心管中。
11. 将滤液转移至14 mL圆底聚丙烯离心管中，以100 rpm离心1分钟。弃去上清液，将沉淀用3 mL终止缓冲液重悬。
12. 向重悬的细胞中加入54 µL 100 mM CaCl₂储备液，使最终CaCl₂浓度达到1.8 mM。此步骤也可分步进行，以提高细胞得率。
13. 让活细胞在重力作用下静置沉降10分钟，随后小心移除含有死细胞的上清液。将沉淀用保存液（含200 µM CaCl₂的灌注液）重悬。这些细胞现在可用于功能实验（如钙成像/收缩分析、膜片钳等）、培养等。
    ​注意：细胞也可根据实验室或实验需求重悬于其他特定溶液中。

5. 细胞培养

1. 使用血细胞计数板或带网格的盖玻片通过视野计数法对细胞进行计数。由于心肌细胞体积较大，使用血细胞计数板计数并不总是准确，此步骤仅用于大致估算分离得到的细胞数量。
2. 用DMEM培养基将细胞稀释至约25,000个细胞/mL。向每孔加入1 mL细胞悬液。
3. 在37 °C、95% O₂、5% CO₂条件下孵育2小时。
4. 轻轻吸去各孔中的DMEM培养基，每孔加入2 mL M199培养基。
5. 在37 °C、95% O₂、5% CO₂条件下继续孵育最多24小时。

结果

在判断分离效果是否成功时，需考察几个关键因素。首先，心肌细胞应呈杆状，且无细胞膜出泡现象，例如成功分离的细胞所示。 图1典型的分离可获得约80%的杆状心肌细胞。若分离得到的杆状细胞比例低于50%，则视为分离失败，此类心肌细胞不予使用。最后，心肌细胞应处于静息状态。自发收缩的心肌细胞表明其对Ca2+不耐受，将产生不可靠的数据。采用上述技术进行的所有分离中，几乎全部被视为成功。培养的心肌细胞若呈杆状、无膜泡形成、边缘不圆缩且存活率高，则视为培养成功图2).

表1. 我们的方法、Langendorff 方法以及先前发表的非 Langendorff 法分离小鼠心肌细胞之间的主要差异比较。 请点击此处下载该表格。

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讨论

我们这种无需兰格多夫（Langendorff）装置的心肌细胞分离技术的主要优势在于，无需将心脏插管连接至兰格多夫装置，从而限制了缺氧和缺血时间。与经典的兰格多夫技术相比，后者通常需要数分钟时间来取出、清洗并悬挂心脏，常导致心肌细胞发生缺血性损伤，而我们的方法包括 体内 血液清除 通过 冰冷的透明溶液。该冰冷透明缓冲液含有乙二胺四乙酸（EDTA），可不可逆地螯合二价阳离子，有效去除钙离子，因此具有良好的抗凝作用，从而抑制收缩²³使用冰冻的溶液可通过减缓离子交换和细胞代谢速率来抑制收缩，从而防止缺血引起的损伤²⁴通过免去主动脉插管的步骤，无Langendorff法能够获得更稳定的心肌细胞，从而制备出更为可靠的心肌细胞样本，获得可信的数据，而传统的Langendorff分离方法并不总能达到这一效果。

这是一种先前发表的无Langendorff法离体分离技术的改良版本¹⁸ 如所强调部分所示进行了调整

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cc BD Luer-Lok 注射器	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex 低型烧杯	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL 聚丙烯盖玻璃培养基储存瓶	DWK Life Sciences	UX-34523-00
带盖 14 mL 圆底聚丙烯试管	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-丁二酮单肟	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok 注射器	Fisher Sci	14-823-435
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL 无针 BD 注射器	Fisher Sci	13-689-8
50 mL 圆锥形离心管	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel 加热垫	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G × 1/2" 皮下注射针头	Becton Dickinson	305109
牛血清白蛋白	Sigma	A3803	热激组分，冻干粉末，基本无脂肪酸，>98%
氯化钙二水合物	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7021	适用于细胞培养，>99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm 经组织培养处理的细胞培养皿	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp 加热浸入式循环水浴器	Fisher Sci	13-874-432
Hartman 蚊式止血钳	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite 计数板套装	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
标签胶带	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 注射泵	kdScientific	788100
L-谷胱甘肽	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH 研究级酶	Sigma	5401135001	高热蛋白酶浓度
M199	Fisher Sci	MT10060CV
氯化镁	Invitrogen	AM9530G
小鼠层粘连蛋白	Corning	354232
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Fisher Sci
氯化钾	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital 往复式水浴摇床	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
碳酸氢钠	Sigma	S5761	适用于细胞培养
氯化钠	Sigma	S5886	>99%
磷酸二氢钠	Sigma	S5011	>99%
70 µm 无菌细胞滤网	Fisher Sci	22-363-548
学生用精细剪刀	Fine Science Tools	91460-11
VWR 吸水垫	Fisher Sci	NC9481815