一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

摘要

在心脏病学领域，细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非兰格多夫技术进行的改进，用于分离小鼠心肌细胞。

摘要

获得可重复且技术简便的高质量心肌细胞制备方法，对于心脏生物学研究至关重要。在心肌细胞上进行的细胞和分子功能实验（例如收缩、电生理、钙循环等）是揭示疾病机制的金标准。小鼠是功能实验的首选物种，而本方法专门用于小鼠心肌细胞的分离。以往依赖兰格多夫（Langendorff）装置的方法需要对主动脉进行插管，操作要求高超的技术和精确性，常导致缺血。目前研究领域正转向无需兰格多夫装置的分离方法，这类方法操作简单、可重复性强，并能获得可用于生理数据采集和培养的活心肌细胞。与主动脉插管相比，这些方法显著缩短了缺血时间，能够稳定地获得心肌细胞。我们对无兰格多夫装置方法的改进包括：首先使用冰冻的灌流清洗液进行初始灌注，采用稳定平台以确保灌注过程中针头稳固，以及增加消化步骤，以确保稳定获得适用于功能检测和培养的心肌细胞。该方法操作简便、快速，对技术要求较低。

引言

几十年来，心脏生物学文献中的一个核心概念是作用的分子机制。要发表可靠的研究，必须明确其作用机制。确定分子机制的一个成熟策略是分离心肌细胞研究，而该方法需要高质量的心肌细胞以获得可信的数据。在心肌细胞上进行的细胞和分子实验，用于阐明作用机制，是研究心肌收缩¹、电生理学²、钙（Ca²⁺）循环³、肌丝对Ca²⁺的敏感性⁴、细胞骨架⁵、代谢⁶、激素作用⁷、信号分子⁸以及药物研究⁹等领域的金标准。由于小鼠易于进行遗传操作、体型小、寿命相对较短且成本低等优势¹⁰，已成为大多数心脏生物学实验的首选物种。然而，利用现有技术可靠地分离出高质量的小鼠心肌细胞并非易事。

实验室分离心肌细胞已有近70年历史¹¹几乎所有分离心肌细胞的技术都依赖于对心脏的消化处理 通过 各种酶（胶原酶、蛋白酶、胰蛋白酶等）。在早期（1950....

方案

本研究中进行的所有实验程序均经俄亥俄州立大学机构动物照护与使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南要求。

1. 溶液配制

注意：缓冲液浓度请参见表2。

1. 分离前准备（心肌细胞分离前最多提前两周）
   1. 灌流缓冲液基础液：在1 L超纯18.2 MΩ·cm H₂O中配制1 L灌流缓冲液基础液（含NaCl、KCl、NaH₂PO₄、HEPES、葡萄糖和BDM）。在经0.22 µm无菌过滤前调节pH至7.4。4 °C保存至分离当天。
   2. 清洗缓冲液：在1 L超纯18.2 MΩ·cm H₂O中配制1 L清洗缓冲液（含NaCl、KCl、NaH₂PO₄、HEPES、葡萄糖、EDTA和BDM）。在经0.22 µm无菌过滤前调节pH至7.4。4 °C保存至分离当天。
   3. 100 mM CaCl₂储备液：称取1.11 g CaCl₂，溶于100 mL超纯18.2 MΩ·cm H₂O中。室温保存至分离当天。
   4. Liberase分装液：将5 mg消化酶溶解于5 mL无菌、无RNa....

结果

在判断分离效果是否成功时，需考察几个关键因素。首先，心肌细胞应呈杆状，且无细胞膜出泡现象，例如成功分离出的细胞即具有此类形态特征 图1典型的分离结果中，约有80%的心肌细胞呈杆状。若分离所得杆状细胞比例低于50%，则视为分离失败，此类心肌细胞不予使用。最后，心肌细胞应处于静息状态。自发性收缩的心肌细胞表明其对Ca2+不耐受，将产生不可靠的数据。采用上述技术进行的所有分离操作中，几乎全部均被视为成功。培养的心肌细胞若呈杆状、无膜泡形成、边缘不圆缩且存活率高，则视为培养成功图2).

表1. 本方法、Langendorff法及先前发表的无Langendorff法在分离小鼠心肌细胞方面的显著差异比较。 请点击此处下载该表格。

讨论

我们这种无需兰格多夫（Langendorff）装置的心肌细胞分离技术的主要优势在于，无需将心脏插管连接至兰格多夫装置，从而限制了缺氧和缺血时间。与经典的兰格多夫技术相比，后者通常需要数分钟时间来取出、清洗并悬挂心脏，常导致心肌细胞发生缺血性损伤，而我们的方法包括 体内 血液清除 通过 冰冷的透明溶液。该冰冷透明缓冲液含有乙二胺四乙酸（EDTA），可不可逆地螯合二价阳离子，有效去除钙离子，因此具有良好的抗凝作用，从而抑制收缩²³使用冰冻的溶液可通过减缓离子交换和细胞代谢速率来抑制收缩，从而防止缺血引起的损伤²⁴通过免去主动脉插管的步骤，无Langendorff法能够获得更稳定的心肌细胞，从而制备出更为可靠的心肌细胞样本，获得可信的数据，而传统的Langendorff分离方法并不总能达到这一效果。

这是一种先前发表的无Langendorff法离体分离技术的改良版本¹⁸ 如所强调部分所示进行了调整

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cc BD Luer-Lok 注射器	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex 低型烧杯	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL 聚丙烯盖玻璃培养基储存瓶	DWK Life Sciences	UX-34523-00
带盖 14 mL 圆底聚丙烯试管	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-丁二酮单肟	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok 注射器	Fisher Sci	14-823-435
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL 无针 BD 注射器	Fisher Sci	13-689-8
50 mL 圆锥形离心管	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel 加热垫	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G × 1/2" 皮下注射针头	Becton Dickinson	305109
牛血清白蛋白	Sigma	A3803	热激组分，冻干粉末，基本无脂肪酸，>98%
氯化钙二水合物	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7021	适用于细胞培养，>99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm 经组织培养处理的细胞培养皿	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp 加热浸入式循环水浴器	Fisher Sci	13-874-432
Hartman 蚊式止血钳	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite 计数板套装	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
标签胶带	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 注射泵	kdScientific	788100
L-谷胱甘肽	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH 研究级酶	Sigma	5401135001	高热蛋白酶浓度
M199	Fisher Sci	MT10060CV
氯化镁	Invitrogen	AM9530G
小鼠层粘连蛋白	Corning	354232
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Fisher Sci
氯化钾	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital 往复式水浴摇床	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
碳酸氢钠	Sigma	S5761	适用于细胞培养
氯化钠	Sigma	S5886	>99%
磷酸二氢钠	Sigma	S5011	>99%
70 µm 无菌细胞滤网	Fisher Sci	22-363-548
学生用精细剪刀	Fine Science Tools	91460-11
VWR 吸水垫	Fisher Sci	NC9481815