方法文章

顺磁弛豫增强，用于检测和表征固有无序蛋白质的自缔合

DOI：

10.3791/63057

⸱

2021年9月23日

 , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology and Greehey Children’s Cancer Research Institute, The University of Texas Health Science Center at San Antonio

本文内容

摘要

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提出了一种应用顺磁弛豫增强核磁共振波谱来检测固有无序蛋白质中弱和瞬态分子间和分子内相互作用的方案。

摘要

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蛋白质中的内在无序蛋白质和内在无序区域构成了人类蛋白质组的重要组成部分。这些序列的高度灵活性使它们能够与不同的生物分子伙伴形成弱的、长距离的和短暂的相互作用。特异性但低亲和力的相互作用促进混杂结合，并使单个固有无序片段与多个靶位点相互作用。由于这些相互作用的瞬时性质，它们很难通过依赖蛋白质形成单一主要构象的结构生物学方法进行表征。顺磁弛豫增强核磁共振是识别和定义弱相互作用和瞬态相互作用的结构基础的有用工具。描述了使用顺磁弛豫增强来表征固有无序蛋白质与其蛋白质、核酸或其他生物分子伙伴之间形成的低人口遭遇复合物的详细协议。

引言

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内在疾病 （ID） 描述了蛋白质 （IDP） 或蛋白质中的区域 （IDR），它们不会自发折叠成稳定的二级或三级结构，但具有生物活性。通常，IDP / IDR的功能是在生理条件下促进与生物分子的特定但可逆的相互作用1。因此，IDP 和 IDR 参与一系列细胞功能，包括多蛋白复合物的募集、组织和稳定，例如剪接体2 的组装和活性、DNA 损伤位点组件的募集和组织3、转录复合物4 或染色质重塑剂 BAF5 的募集的组织和稳定.此外，IDP存在于信号连接处，它们对不同结合伴侣的混杂性使它们能够通过细胞蛋白网络介导信息传递6。最近的工作还揭示了IDR区域通过液-液相分离过程自缔合形成生物分子冷凝物的倾向7。许多涉及ID的上述功能现在也被认为涉及冷凝水形成8的某些方面。尽管ID对于生物分子复合物组装，稳定，支架和信号转导很重要，但它们特定相互作用的原子细节很难识别，因为IDP和IDR通常不适合使用X射线晶体学或低温电子显微镜进行结构研究。

核磁共振（NMR）是研究ID的理想技术，因为它不依赖于刚性或均匀结构集合的....

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方案

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协议的一般要求:蛋白质纯化设施、紫外-可见光谱仪、高场核磁共振波谱仪和操作软件、后处理分析软件包括;NMRPipe 32，Sparky33（或CCPN分析34，或NMRViewJ35）。

1. 用于 PRE 测量的蛋白质的重组表达和纯化

  1. 为目标蛋白设计表达构建体，以便存在单个半胱氨酸残基。需要多个突变才能在感兴趣的蛋白质的不同位置引入游离半胱氨酸36。
  2. 使用已建立的方案表达和纯化目标蛋白质的天然丰度（14N）或 15N标记样品37。
    注意: 大肠杆菌 表达系统为重组蛋白表达提供了经济高效且稳健的方法，因为 15N的同位素富集是生物分子异核NMR波谱的最低要求。典型的步骤是在最小培养基中表达、色谱纯化和去除亲和纯化标签。该协议假设已经建立了稳健的表达和纯化方案，可以产生足够质量的蛋白质用于核磁共振研究。
    1. 在所有纯化步骤中，在缓冲液中维持 1 mM 还原剂（DTT 或 TCEP），以防止游离半胱氨酸的反应和 IDP 分子间二硫键的形成。
      注意:某些系....

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结果

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分子内 1H N-Γ2 PRE 记录在源自 RNA 结合蛋白 EWSR142 的低复杂性结构域的自缔合、固有无序片段（残基 171-264）上（图 3）。与自旋标记附着点非常接近的残基（例如，图3中的残基178或260）预计将显着展宽，并且在光谱中无法检测到。从附着点依次间隔的残基显示出增强Γ 2在空间上接近自旋标记（10-35 Å）。在EWSR1 171-264的情况下，归因于PRE效应的来源是复杂的，因为它可能来自残渣间和残基内接触的组合，并且取决于从原子核到顺磁中心的距离，该构象的数量以及连接电子和核自旋的矢量的动力学。此外，分子内接触产生的PRE的大小不依赖于浓度，而分子间接触产生的PRE取决于浓度以及蛋白质分子之间结合的动力学和动力学。

对这些数据的可能解释是，IDP集成采样的构象比扩.......

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讨论

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已经提出了一种使用PRE表征固有无序蛋白质和各种结合伴侣之间在低群体中存在的瞬时相互作用的方法。在所示的示例中，蛋白质是自缔合的，因此PRE可能来自分子间和分子内相互作用的组合。该方法很容易扩展到异质样品，其中可以表征两种不同蛋白质之间的相互作用。通过将自旋标记放置在蛋白质内的不同位置，可以获得有关蛋白质不同区域如何相互作用的补充信息。此外，通过在NMR活性（15N）和NMR非活性（14N）物种之间交替自旋标记，观察到的PRE的分子内和分子间来源可以相互区分，从而提供有关遭遇复合物的信息。这里概述的实验可以报告遇到的复杂相互作用，即使它们发生在微秒的时间尺度上13。

该方法的核心是通过附着在半胱氨酸残基上将自旋标记标签掺入感兴趣的蛋白质中。一些蛋白质可能含有适合（不参与二硫键，表面暴露）用于连接自旋标记的天然半胱氨酸。对于国内流离失所者来说，半胱氨酸的溶剂暴露通常不是问题。在大多数情况下，希望使用定点诱变引入半胱氨酸作为保守突变（丝氨酸到半胱氨酸或其他不带电荷的极性氨基酸到半胱氨酸）

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披露

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所有作者均已阅读并批准该稿件。不声明任何利益冲突。

致谢

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我们感谢应金发博士和克里斯汀·卡诺博士的有益讨论和技术援助。DSL是圣鲍德里克学者，并感谢圣鲍德里克基金会（634706）的支持。这项工作得到了韦尔奇基金会（AQ-2001-20190330）对DSL的部分支持，Max and Minnie Tomerlin Voelcker基金（Voelcker基金会青年研究员资助DSL），UTHSA启动基金DSL，以及Greehey儿童健康研究生奖学金CNJ。这项工作基于在结构生物学核心设施中进行的研究，这是德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心机构研究核心的一部分，由研究副总统办公室和梅斯癌症中心药物发现和结构生物学共享资源（NIH P30 CA054174）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 和微量;m 和 0.22 µm 针头过滤器Millipore SigmaSLHVM33RS
SLGVR33RS		过滤裂解物，在第一次纯化步骤和尺寸排阻色谱之前。
100 mm 培养皿FisherFB0875713琼脂板用于细菌转化。
14N 氯化铵Sigma Aldrich576794在 M9 培养基中使用 15N 会产生 NMR 可见蛋白， 14N 会产生 NMR 不可见蛋白
15 氯化铵Sigma Aldrich299251在 M9 培养基中使用 15N 会产生 NMR 可见蛋白， 14N 会产生 NMR 不可见蛋白
3 L Fernbach 带挡板培养康宁431523细菌表达培养物
3-Maleimido-ProxylSigma Aldrich253375硝氧化物离心标记
50 mL 锥形离心管Thermo Fisher14-432-22溶液/蛋白质储存
Amicon 离心过滤器Millipore SigmaUFC900308蛋白质浓度
氨蓿Sigma AldrichA5354抗生素 用于选择性标记物，确切的选择取决于表达 构建体 质粒
分析天平Oahus30061978Explorer Pro，用于称量试剂
抗坏血酸Sigma AldrichAX1775减少氮氧化物旋转标记
高压灭菌器 对玻璃器皿和培养基进行消毒
氯化钙Sigma AldrichC4901M9 培养基成分
离心瓶Thermo Fisher010-1459蛋白表达后收获大肠杆菌细胞
离心机，手摇Thomas Scientific0241C68Boekel 手动低速离心机，带 15 mL 吊篮，可容纳 NMR 管
Chelex 100Sigma AldrichC7901从缓冲溶液中去除污染性顺磁性化合物
计算机工作站Linux 或 Mac OS 与 NMRPipe 和 Sparky
Deuterium oxideSigma Aldrich151882NMR 锁定信号需要
葡萄糖Sigma AldrichD9434M9 培养基成分
磷酸氢钠Sigma AldrichS5136M9 培养基成分
Ellman 试剂（5,5-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）Thermo Fisher22582游离胱氨酸残留的定量
高速离心管Thermo Fisher3114-0050用于清除细菌裂解物。
高场核磁共振仪器 （600 - 800 MHz）布鲁克配备多通道低温探头和温度控制
IMAC 色谱柱 HisTrap FFCytvia17528601粗细菌裂解物
异丙基 B-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）Sigma AldrichI6758诱导 lac作员 LB 琼脂控制下的基因的蛋白表达
Fisher22700025项目用于转化大肠杆菌以表达目标蛋白质，用类似产品替代这些项目中的任何一个都是可以接受的。
LB 肉汤Thermo Fisher12780052
低压层析系统Bio-Rad7318300BioRad BioLogic 用于低压层析仪，例如运行 IMAC 色谱柱
硫酸镁Sigma AldrichM7506M9 介质组件
中压层析系统Bio-Rad7880007BioRad NGC 配备多波长检测器、pH 值和电导率监测器以及自动馏分收集器
MEM 维生素溶液Sigma AldrichM6895M9 培养基成分
微流化器AvestinEmulsiFlex-C3提供快速高效的细菌细胞裂解
微量移液器Thermo Fisher校准的微量移液器套件，带有合适的一次性吸头（可从多家制造商处获得，例如 Eppendorf）磷酸
二氢钾Sigma Aldrich1551139M9 介质成分
NMR 移液器Sigma Aldrich255688从 NMR 管中取出样品
NMR 样品管NewEraNE-SL5适用于高场 NMR 波谱仪
制备离心机Beckman CoulterAvanti J-HC蛋白表达后收获大肠杆菌
圆底聚苯乙烯离心管康宁352057透明细菌裂解物
振荡培养箱EppendorfS44I200005大肠杆菌发酵剂和表达培养物的温度控制生长
氯化钠Sigma AldrichS5886M9 填料组件
超声处理水浴和真空源Thomas Scientific用于对缓冲溶液进行脱气
仪Thermo FisherFB505110用于细菌细胞裂解或剪切细菌 DNA
分光光度计ImplenOD600 稀释光度计监测大肠杆菌蛋白表达培养物的生长
Superdex 200 16/600 大小剥落columCytvia28989333最终蛋白质纯化步骤
Topspin 软件，版本 3.2 或更高版本布鲁克NMR 仪器作软件
转化感受态大肠杆菌细胞Thermo FisherC600003One Shot BL21 Star （DE3） 化学感受态大肠杆菌，其他菌株可能兼容
Tris（2-carboxyethyl）phosphine （TCEP）ThermoFisher20490还原剂与一些巯基反应偶联物兼容
紫外-可见分光光度计ImplenNP80测量蛋白质浓度。
水浴，温控ThermoFisherFSGPD25用于细菌转化的热休克步骤
酵母提取物Sigma AldrichY1625用于补充 M9 培养基（如果需要
瓶 糖 重组 等 NMR 数据处理和分析软件包兼容 重组细胞 超声）

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
  2. Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology<....

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