利用顺磁弛豫增强技术检测和表征内在无序蛋白的自关联行为

摘要

本文介绍了一种应用顺磁弛豫增强核磁共振波谱法检测内在无序蛋白中弱且瞬时的分子间和分子内相互作用的实验方案。

摘要

内在无序蛋白以及蛋白质中的内在无序区域构成了人类蛋白质组中一个庞大且具有重要功能的部分。这些序列高度灵活的特性使其能够与多种生物大分子伴侣形成微弱、长程且瞬时的相互作用。特异但低亲和力的相互作用促进了广泛的结合，使得单个内在无序区段能够与多个靶标位点发生作用。由于这些相互作用具有瞬时性，利用依赖蛋白质形成单一主导构象的结构生物学方法对其进行表征往往较为困难。顺磁弛豫增强核磁共振（paramagnetic relaxation enhancement NMR）是一种用于识别和界定弱相互作用与瞬时相互作用结构基础的有效工具。本文详细描述了一种利用顺磁弛豫增强技术来表征内在无序蛋白与其蛋白、核酸或其他生物大分子伴侣之间形成的低占有率碰撞复合物的实验方案。

引言

内在无序（intrinsic disorder, ID）描述的是一类蛋白质（IDPs）或蛋白质中的区域（IDRs），它们不会自发折叠成稳定的二级或三级结构，但仍具有生物学活性。通常，IDP/IDRs的功能是在生理条件下促进与生物大分子之间特异且可逆的相互作用¹。因此，IDPs和IDRs参与多种细胞功能，包括多蛋白复合物的招募、组织和稳定，例如剪接体的组装与活性调控²、DNA损伤位点处组分的招募与组织³、转录复合物的组织与招募稳定⁴，或染色质重塑复合物BAF的调控⁵。此外，IDPs常见于信号转导枢纽，因其可与多种结合伙伴发生相互作用，从而介导细胞内蛋白质网络中的信息传递⁶。近期研究还发现，IDR区域倾向于通过液-液相分离过程发生自缔合，形成生物分子凝聚体⁷。目前认为，上述许多涉及ID的功能也与凝聚体的形成密切相关⁸。尽管ID在生物大分子复合物的组装、稳定、支架作用及信号转导中具有重要意义，但由于IDPs和IDRs通常不适合采用X射线晶体学或低温电子显微镜进行结构解析，其特异性相互作用的原子级细节仍难以确定。

方案

本实验方案的通用要求：蛋白质纯化设施、紫外-可见光谱仪、高场核磁共振波谱仪及配套操作软件，以及数据后处理分析软件，包括 NMRPipe³²、Sparky³³（或 CCPN Analysis³⁴，或 NMRViewJ³⁵）。

1. 用于 PRE 测量的蛋白质的重组表达与纯化

1. 为感兴趣的蛋白质设计表达载体，使其仅含有一个半胱氨酸残基。需要进行多个突变，以便在目标蛋白的不同位置引入游离半胱氨酸³⁶。
2. 采用已建立的方案表达并纯化天然丰度（¹⁴N）或¹⁵N标记的目标蛋白样品³⁷。
   注意：E. coli表达系统为重组蛋白表达提供了经济高效且可靠的方法，因为生物大分子异核NMR谱学所需的同位素标记仅需最低限度的¹⁵N富集即可实现。典型步骤包括在最低培养基中表达、色谱纯化以及去除亲和纯化标签。本方案假设已建立可靠的表达与纯化流程，能够获得足量且适用于NMR研究的高质量蛋白。
   1. 在所有纯化步骤的缓冲液中维持1 mM还原剂（DTT或TCEP），以防止IDP....

结果

在源自RNA结合蛋白EWSR1低复杂性结构域的一个自缔合、内在无序片段（残基171-264）上记录了分子内¹H_N-Γ₂顺磁弛豫增强（PRE）效应⁴²（图3）。与自旋标记连接位点在序列上邻近的残基（例如图3中的残基178或260）预期会显著展宽，在谱图中无法检测到。那些在序列上与连接位点有一定距离但仍表现出增强的Γ₂的残基，则在空间上靠近自旋标记（距离为10-35 Å）。对于EWSR1 171-264片段，归因PRE效应的来源较为复杂，因为该效应可能来源于分子间和分子内残基接触的组合，并且依赖于原子核与顺磁中心之间的距离、该构象的占比，以及连接电子自旋与核自旋的矢量的动力学特性。此外，由分子内相互作用引起的PRE效应幅度与浓度无关，而由分子间相互作用引起的PRE效应则依赖于浓度以及蛋白质分子之间缔合的动力学和动态特性。

讨论

本文介绍了一种利用顺磁弛豫增强（PRE）来表征内在无序蛋白与多种结合伴侣之间低丰度瞬时相互作用的方法。在所示示例中，蛋白发生自关联，因此PRE信号可能来源于分子间和分子内相互作用的共同贡献。该方法可直接推广至异源样品，用于表征两种不同蛋白之间的相互作用。通过在蛋白的不同位点引入自旋标记，可以获得关于蛋白不同区域如何参与相互作用的互补信息。此外，通过在核磁共振活性（¹⁵N）和非活性（¹⁴N）物种之间交替标记自旋标签，可区分观测到的PRE信号的分子内与分子间来源，从而提供关于碰撞复合物的信息。此处所述实验能够检测到即使发生在微秒时间尺度上的碰撞复合物相互作用¹³。

该方法的核心是通过将自旋标记标签连接到半胱氨酸残基上，从而将其引入目标蛋白中。某些蛋白质可能含有天然的半胱氨酸，适合用于连接自旋标签（不参与二硫键形成且位于蛋白表面）。对于内在无序蛋白（IDPs），半胱氨酸的溶剂可及性通常不是问题。在大多数情况下，期望通过定点突变引入半胱氨酸作为保守性替换（例如丝氨酸突变为半胱氨酸，或其他不带电荷的极.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 µm 和 0.22 µm 注射器滤器	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	在第一次纯化步骤之前以及尺寸排阻色谱之前过滤裂解液。
100 mm 培养皿	Fisher	FB0875713	用于细菌转化的琼脂平板。
14N 氯化铵	Sigma Aldrich	576794	在 M9 培养基中使用 15N 可产生核磁共振（NMR）可见的蛋白质，而使用 14N 则产生 NMR 不可见的蛋白质
15N 氯化铵	Sigma Aldrich	299251	在 M9 培养基中使用 15N 可产生核磁共振（NMR）可见的蛋白质，而使用 14N 则产生 NMR 不可见的蛋白质
3 L 带挡板的 Fernbach 三角烧瓶	Corning	431523	用于细菌表达培养。
3-马来酰亚胺基-邻近自由基（3-Maleimido-Proxyl）	Sigma Aldrich	253375	硝roxide 自旋标记物。
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher	14-432-22	用于溶液/蛋白质储存。
Amicon 离心滤器	Millipore Sigma	UFC900308	用于蛋白质浓缩。
氨苄青霉素（Ampicillan）	Sigma Aldrich	A5354	作为选择性标记的抗生素，具体选择取决于表达质粒构建体。
分析天平	Oahus	30061978	Explorer Pro，用于称量试剂。
抗坏血酸（Ascorbic acid）	Sigma Aldrich	AX1775	用于还原硝roxide 自旋标记物。
高压灭菌器（Autoclave）			用于玻璃器皿和培养基的灭菌。
氯化钙（Calcium chloride）	Sigma Aldrich	C4901	M9 培养基组分。
离心瓶	Thermo Fisher	010-1459	用于在重组蛋白表达后收获大肠杆菌（E. coli）细胞。
手摇离心机	Thomas Scientific	0241C68	Boekel 手动驱动低速离心机，配备可容纳 NMR 管的 15 mL 桶。
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	用于从缓冲液中去除污染性的顺磁性化合物。
计算机工作站			需兼容 Linux 或 Mac OS 操作系统，并支持 NMR 数据处理与分析软件包（如 NMRPipe 和 Sparky）。
重水（Deuterium oxide）	Sigma Aldrich	151882	用于提供 NMR 锁场信号。
葡萄糖（Dextrose）	Sigma Aldrich	D9434	M9 培养基组分。
磷酸氢二钠（Dibasic Sodium Phosphate）	Sigma Aldrich	S5136	M9 培养基组分。
Ellman 试剂（5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)）	Thermo Fisher	22582	用于游离半胱氨酸残基的定量。
高速离心管	Thermo Fisher	3114-0050	用于澄清细菌裂解液。
高场强核磁共振仪（600–800 MHz）	Bruker		配备多通道低温探头和温度控制系统。
IMAC 柱，HisTrap FF	Cytvia	17528601	用于粗制细菌裂解液的初步分级分离。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Sigma Aldrich	I6758	用于诱导受 lac 操纵子控制的基因表达。
LB 琼脂	Thermo Fisher	22700025	用于转化大肠杆菌以表达目标蛋白，可使用功能相似的替代产品。
LB 肉汤	Thermo Fisher	12780052
低压层析系统	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic 用于低压层析，例如运行 IMAC 柱。
硫酸镁（Magnesium sulfate）	Sigma Aldrich	M7506	M9 培养基组分。
中压层析系统	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC 配备多波长检测器、pH 和电导率监测仪以及自动馏分收集器。
MEM 维生素溶液	Sigma Aldrich	M6895	M9 培养基组分。
微流化仪（Microfluidizer）	Avestin	EmulsiFlex-C3	提供快速高效的细菌细胞裂解。
微量移液器（Micropipettes）	Thermo Fisher		校准过的微量移液器套装，配备合适的一次性吸头（可从多个制造商处获得，例如 Eppendorf）。
磷酸二氢钾（Monobasic potassium phosphate）	Sigma Aldrich	1551139	M9 培养基组分。
NMR 移液器	Sigma Aldrich	255688	用于从 NMR 管中取出样品。
NMR 样品管	NewEra	NE-SL5	适用于高场强核磁共振波谱仪。
制备型离心机	Beckman Coulter	Avanti J-HC	用于在重组蛋白表达后收获大肠杆菌（E. coli）细胞。
圆底聚苯乙烯离心管	Corning	352057	用于澄清细菌裂解液。
摇床培养箱	Eppendorf	S44I200005	用于温度控制的大肠杆菌起始培养和表达培养。
氯化钠（Sodium chloride）	Sigma Aldrich	S5886	M9 培养基组分。
超声水浴及真空源	Thomas Scientific		用于缓冲液的脱气处理。
超声破碎仪（Sonicator）	Thermo Fisher	FB505110	用于细菌细胞裂解或细菌 DNA 剪切。
分光光度计	Implen	OD600 Diluphotometer	用于监测大肠杆菌蛋白表达培养物的生长。
Superdex 200 16/600 尺寸排阻柱	Cytvia	28989333	蛋白质纯化的最后一步。
Topspin 软件，版本 3.2 或更高	Bruker		核磁共振仪器的操作软件。
转化用感受态大肠杆菌细胞	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) 化学感受态大肠杆菌，其他菌株也可能适用。
三(2-羧乙基)膦（TCEP）	ThermoFisher	20490	一种与某些巯基反应性偶联反应兼容的还原剂。
紫外-可见分光光度计（UV-Vis spectrophotometer）	Implen	NP80	用于测定蛋白质浓度。
控温水浴锅	ThermoFisher	FSGPD25	用于细菌转化过程中的热激步骤。
酵母提取物（Yeast extract）	Sigma Aldrich	Y1625	如需要，用于补充 M9 培养基。