我们提出一种方法，该方法利用一种可推广的基于区域的图像分析方法来识别细胞数量。对不同细胞群体的分析利用了不同细胞类型之间显著的细胞高度和结构差异，并通过自适应算法实现。
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本文内容
摘要
摘要
细胞定量对于广泛的生物学和生物化学研究是必要的。传统的细胞图像分析通常采用荧光检测方法，例如免疫荧光染色或转染荧光蛋白，或采用边缘检测技术，但由于图像背景中的噪声和其他非理想因素，这些方法往往容易产生误差。
我们设计了一种新算法，能够准确计数并区分巨噬细胞和成纤维细胞，这两种不同表型的细胞在组织再生过程中常发生共定位。该算法采用 MATLAB 实现，通过细胞与背景高度的差异来区分不同的细胞类型。主算法基于面积的方法开发，以应对细胞大小/结构的变异以及高密度接种条件。
利用基于特定细胞类型实验数据计算得到的细胞覆盖率等内部参数，通过二次迭代算法对细胞结构中的非理想因素进行了校正。最后，采用一种隔离算法分析共培养环境，该算法根据图像中相对高度差异的评估结果选择性地排除不同类型的细胞。该方法在单细胞培养中的细胞计数准确度误差控制在5%以内，在共培养条件下的误差控制在10%以内。
引言
在图像分析技术中，通常会使用软件以确保结果的准确性、高效性和无偏性。对于基于细胞的检测，一个常见问题是细胞的误识别。当图像的焦距和对比度设置不当时，可能导致细胞模糊，使得单个细胞的边界难以辨认1。图像中若存在无关特征，如孔隙、气泡或其他不需要的物体，可能干扰计数过程，减慢计数速度并导致误识别。此外，细胞计数工作可能十分繁重，对数百个重复样本进行计数极为耗时。更重要的是，人工计数过程中存在固有的主观偏差，因此在细胞识别方面的决策往往不够准确2。自动化软件具有突破上述所有问题的巨大潜力，它可根据明确定义的识别标准，快速而精确地区分细胞与无关物体，甚至能检测到远超人类识别能力的微小结构，从而降低研究者主观因素的影响。利用自动化软件识别细胞的常用技术主要包括两种方法：分割（segmentation）和阈值化（thresholding）3。本文展示了一种可广泛适用的基于区域的实验方案，可在一种广泛可及的软件框架内实现快速、准确且低成本的细胞计数。
分割技术（如边缘检测）通过利用图像内的强度差异来分离单个细胞。将细胞与图像其余部分区分开的强度变化通常表现为亮度的急剧变化4。边缘检测包括一个正则化滤波步骤，随后是一个检测强度变化的微分步骤。该微分过程可识别图像中高强度变化的边缘和轮廓，并将这些边缘和轮....
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方案
1. 细胞培养与图像采集
- 在37 °C、5% CO2条件下，使用添加了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、1.5 g/L碳酸氢钠和5 µM β-巯基乙醇的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养RAW264.7巨噬细胞。
- 进行单层培养成像时，将RAW264.7细胞以25,000个细胞/cm2的密度接种于含1 mL培养基的5 mL细胞培养瓶中进行培养。
- 在37 °C、5% CO2条件下，使用添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养NIH/3T3细胞11。
- 进行共培养成像时，将RAW264.7巨噬细胞与NIH/3T3成纤维细胞按不同比例共同培养，总细胞密度为25,000个细胞/cm2。使用共培养基，其成分为1份RAW264.7培养基（含10% FBS、1%青霉素-链霉素、1.5 g/L碳酸氢钠和5 µM β-巯基乙醇的DMEM）与1份NIH/3T3培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM）混合而成。
- 接种后，在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞，使其达到80%汇合度的活细胞密度。
- 使用配备40倍物镜的倒置显微镜对细胞进行成像。所有图像以灰度模式采集，并以原....
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结果
在单培养条件下对非球状 RAW264.7 巨噬细胞进行了分析，细胞密度为 25,000 个细胞/cm2。对细胞培养物拍摄了代表性图像，并在 ImageJ 中将其转换为 8 位 tiff 格式后，使用 MATLAB 进行处理。整个过程中算法的输出结果已在 图 2 中针对该代表性图像进行了记录和展示。在此图像中，算法计数结果为 226 个细胞，通过与手动计数结果（241 个细胞）进行比对验证，误差为 6.2%。对至少 10 张 RAW264.7 细胞图像进行算法计数，其平均误差为 4.5 ± 1.9%。
使用迭代算法对呈膨胀状的RAW264.7巨噬细胞进行了分析。在大多数图像中，观察到的膨胀效应主要是由于对焦平面略高于细胞所贴附的基底平面所致。因此，大多数图像均以非膨胀形态采集，此类图像的分析显著更为简便。针对因弯月面效应或其他光学干扰而无法避免采集次优图像的情况，开发了用于分析膨胀状图像的算法。整个过程中典型的算法输出结果已记录并展示于图3中。.......
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讨论
我们设计了一种基于面积的通用方法，可根据细胞高度准确且高效地计数细胞，从而实现在共培养体系中无需染色即可对细胞进行定量分析。该方法的关键步骤包括建立相对强度系统，以区分不同细胞。采用相对高度分析具有两个优势：一是无需引入外部参数，因为相对参数对于特定细胞类型和参数而言是恒定的；二是无需为每幅图像单独设置绝对的亮度/对比度水平。此外，基于百分位数的系统使得在同一图像中可同时分析多种细胞类型，前提是不同细胞类型在图像中处于不同的高度位置。
基于百分位数的系统定义为与最大像素值的差异，而不是与平均值的差异。这样做是为了避免算法因平均强度值而产生偏差，因为平均强度值依赖于图像中细胞的数量和融合程度。此外，引入了“最大相关像素”以防止最大强度异常值显著影响数据——最大相关像素需要至少代表0.5%的群体，这是一个实验确定的数值。其他步骤包括使用基于面积的定量系统，而非计数单个实体。这确保了在计数细胞时，细胞碎片化或错误的二值化会被最小化，因为受影响的总面积与单个细胞的面积相比非常小。
该算法中实施了多种故障排除方法。最初对单层细胞图像进行.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（R01 AR067247）资助，部分由特拉华州INBRE项目资助，该项目由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（NIGMS）（P20 GM103446）以及特拉华州政府提供的资助支持。本手稿内容不一定反映资助机构的观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Axio Observer 7 倒置显微镜 | Zeiss | 1028290770 | |
| β-巯基乙醇 | Life Technologies | 21985023 | |
| 细胞刮刀 | CellTreat | 229310 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Fisher Scientific | 12430047 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB 软件 | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 细胞 | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| 青霉素–链霉素 | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 细胞 | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 细胞培养瓶 | Corning | CLS3814-24EA |
参考文献
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A.
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重印与许可
