基于面积的图像分析算法，用于巨噬细胞-成纤维细胞共生群的定量

Summary

我们提出了一种方法，该方法利用可推广的基于区域的图像分析方法来识别细胞计数。对不同细胞群的分析利用了自适应算法中不同细胞类型之间显着的细胞高度和结构差异。

Abstract

细胞定量对于广泛的生物学和生化研究是必要的。传统的细胞图像分析通常采用荧光检测方法，例如免疫荧光染色或使用荧光蛋白或边缘检测技术转染，由于图像背景中的噪声和其他非理想性，这些方法通常容易出错。

我们设计了一种新算法，可以准确地计数和区分巨噬细胞和成纤维细胞，这些巨噬细胞和成纤维细胞是不同表型的细胞，通常在组织再生过程中共定位。MATLAB用于实现该算法，该算法根据背景的高度差异来区分不同的细胞类型。使用基于面积的方法开发了一种主要算法，以考虑细胞大小/结构和高密度接种条件的变化。

利用内部参数（例如使用给定细胞类型的实验数据计算的细胞覆盖率）的二次迭代算法来解释细胞结构中的非理想性。最后，采用分离算法对共生环境进行分析，该算法根据对图像内相对高度差异的评估，选择性地排除了各种细胞类型。发现这种方法可以准确计数单培养细胞的5%误差范围内的细胞，以及共培养细胞的10%误差范围内的细胞。

Introduction

在图像分析技术过程中定期实施软件，以确保结果是准确，高效和无偏的。对于基于细胞的检测，一个常见的问题是细胞的错误识别。具有不正确的焦距和对比度设置的图像可能导致细胞模糊，其中单个细胞的边界变得难以识别¹。存在无关的图像特征（如毛孔、气泡或其他不需要的物体）会减慢计数过程并导致错误识别，从而妨碍计数过程。此外，细胞计数可能很繁重，并且计数数百个重复可能非常耗时。此外，在手动计数过程中存在固有的主观偏见，因此有关细胞鉴定的决策通常不准确²。自动化软件提供了令人兴奋的潜力，通过快速准确地将细胞与无关的物体区分开来，包括远远超出人类精确检测能力的物体，基于明确定义的识别标准，减少研究者偏见的影响，从而绕过所有这些问题。使用自动化软件识别细胞的常用技术涉及两种主要方法:分割和阈值³。在本文中，我们展示了一种可推广的基于区域的方案，该协议可在广泛访问的软件框架内实现快速，准确和廉价的细胞计数。

分割技术，如边缘检测，试图通过利用图像中的强度差异来分离单个细胞。将细胞与图像其余部分区分开来的强度变化通常由亮度的急剧变化组成⁴.边缘检测涉及正则滤波步骤，然后是检测强度变化的微分步骤。分化过程识别高强度变化图像中的边缘和轮廓，这些边缘和轮廓与细胞存在相关。虽然有噪声的图像可以通过去噪算法

Protocol

1. 细胞培养和图像采集

1. 在37°C和5%CO₂ 下在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中培养RAW264.7巨噬细胞，并补充10%胎牛血清（FBS），1%青霉素 - 链霉素，1.5g / L碳酸氢钠和5μM β巯基乙醇。
   1. 对于单培养成像，在装有1 mL培养基的5 mL细胞培养瓶中以²⁵ ，000个细胞/ cm 2的密度培养RAW264.7细胞。
2. 在37°C下培养NIH / 3T3细胞，在DMEM中培养5%CO₂ ，补充10%胎牛血清和1%青霉素 - 链霉素¹¹。
3. 对于共培养成像，以不同的比例将RAW264.7巨噬细胞和NIH / 3T3成纤维细胞一起培养，总密度为25，000个细胞/ cm²。使用 1 份 RAW264.7 培养基（DMEM 补充 10% FBS、1% 青霉素-链霉素、1.5 g/L 碳酸氢钠和 5 μM β-巯基乙醇）和 1 份 NIH/3T3 培养基（DMEM 补充 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）的共培养基。
4. 接种后，将细胞在37°C和5%CO₂ 下孵育，以达到80%细胞汇合的活细胞密度。
5. 使用配备40x物镜的倒置显微镜对细胞进行成像。获取灰度格式的所有图像，并....

Results

非球茎RAW264.7巨噬细胞的分析在25，000个细胞^{/ cm 2}的单培养环境中进行。在ImageJ中转换为8位tiff后，从细胞培养物中拍摄代表性图像并在MATLAB中处理。在整个过程中的算法输出被记录下来并记录在 图2 中，用于代表性图像。在该图像中，该算法对226个细胞进行了计数，并通过与识别241个细胞（6.2%误差）的手动计数进行比较来验证该图像计数。对于至少10张RAW264.7细胞计数图像的算法输出，平均误差为4.5±1.9%。

使用迭代算法对球状RAW264.7巨噬细胞进行分析。在大多数图像中，观察到的球状效应主要是由于聚焦在焦平面上的结果，该焦平面略高于细胞贴壁的基质的焦平面。因此，大多数图像都是以非球状形式获得的，因此分析要容易得多。分析球状图像所需的算法是为由于半月板效应或其他光学干扰而无法避免次优的情况而开发的。图 3记录了整个过程的典型算法输出。在这个具有代表性的图像分析中，该算法对图像中的221个细胞进行了计数，.......

Discussion

我们设计了一种基于区域的通用程序，可以根据细胞高度准确有效地计数细胞，即使在共培养系统中也能对细胞进行无染色定量。该程序的关键步骤包括实施相对强度系统，通过该系统可以区分细胞。使用相对高度分析有两个目的:不需要外部参数，因为给定的像元类型和参数的相对参数是恒定的，并且不需要为每个图像输入绝对亮度/对比度级别。此外，使用基于百分位数的系统可以分析同一图像中的多种细胞类型，前提是不同的细胞类型位于图像中的独特高度。

基于百分位数的系统被定义为与最大像素值与平均值的差异。这样做是为了防止基于平均强度值的算法偏斜，该值取决于图像中存在的细胞的数量和汇合度。此外，还实施了"最大相关像素"，以防止最大强度异常值显着影响数据 - 最大相关像素需要代表至少0.5%的人口 - 一个实验值。其他步骤包括使用基于面积的量化系统，而不是计算单个实体。这确保了在计数细胞时将细胞碎片化或错误的二值化降至最低，因为与细胞面积相比，总受影响面积最小。

在此算法中实现了各种故障排除方法。量化细胞单一培养图像的最初努力需要准确识别球状细胞和非球状细胞的方法。在球.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 倒置显微镜	蔡	1028290770
&β;-巯基乙醇	Life Technologies	21985023
细胞刮刀	CellTreat	229310
Dublecco 改良 Eagle 培养基	Fisher Scientific	12430047
Dublecco PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB 软件	MathWorks	2021A
NIH/3T3 细胞	ATCC	ATCC CRL - 1658
青霉素–链霉素	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 细胞	ATCC	ATCC TIB - 71
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 细胞培养瓶	康宁	CLS3814-24EA