纳米颗粒追踪分析(NTA)是一种广泛用于表征细胞外囊泡的方法。本文重点介绍了NTA实验参数与对照,以及分析和表征样品及稀释液的统一方法,这些内容是对MISEV2018和EV-TRACK指南的必要补充,以实现实验室间的可重复性。
纳米颗粒追踪分析(NTA)是一种广泛用于表征细胞外囊泡的方法。本文重点介绍了NTA实验参数与对照,以及分析和表征样品及稀释液的统一方法,这些内容是对MISEV2018和EV-TRACK指南的必要补充,以实现实验室间的可重复性。
自2006年以来,纳米颗粒追踪分析(NTA)已成为细胞外囊泡(EV)研究中多种表征方法之一。许多人认为,NTA仪器及其配套软件在经过最少培训后即可轻松使用,且尺寸校准可在实验室内自行完成。由于NTA的数据采集和软件分析均属于EV表征的一部分,因此在《细胞外囊泡研究最小信息标准2018》(MISEV2018)中对此进行了阐述。此外,透明报告与细胞外囊泡研究知识集中平台(EV-TRACK)也对这些方法进行了监控,以提高EV实验的稳健性(例如,尽量减少由未受控因素引起的实验变异)。
尽管已有努力推动研究方法和对照的报告,但许多已发表的研究论文仍未能报告重现原始纳米颗粒追踪分析(NTA)观测结果所需的关键参数。很少有论文报告阴性对照或稀释液的NTA表征,显然假设市售产品(如磷酸盐缓冲液或超纯蒸馏水)不含颗粒物。同样,研究人员很少报告使用阳性对照或尺寸标准品来验证颗粒尺寸测定的准确性。斯托克斯-爱因斯坦方程通过引入样品黏度和温度变量来确定颗粒的布朗运动位移,因此,在整个样品视频采集过程中报告稳定的激光腔温度,是实现准确重复实验的关键对照措施。样品或稀释液的过滤操作也未被常规报告,即使提及,也很少包括滤膜的具体信息(如生产厂家、膜材料、孔径大小)以及储存条件。国际细胞外囊泡学会(ISEV)所规定的可接受实验细节最低标准中,应包含一份详细记录的NTA操作流程,用于细胞外囊泡(EVs)的表征。以下实验表明,研究人员需自行建立NTA分析方案,并将其纳入发表文献的方法部分,作为满足MISEV2018单囊泡表征要求的可选手段之一。
对细胞外囊泡(EV)及其他纳米级颗粒进行准确且可重复的分析,在科研与工业领域均面临诸多挑战。由于数据采集相关参数的报告缺乏统一标准,EV研究的重复性一直较为困难。为解决这些问题,国际细胞外囊泡学会(ISEV)提出了一套行业指南,作为EV研究人员应遵循的最低限度的生化、生物物理和功能标准,并以立场声明的形式发布,通常称为MISEV20141。随着EV研究进展的加快,亟需更新指南内容,因此“MISEV2018:国际细胞外囊泡学会的立场声明” 在MISEV2014的基础上进行了扩展2。MISEV2018论文包含了表格、建议的实验方案提纲,以及用于记录特定EV相关表征的具体步骤。为进一步促进实验结果的解读与重复,EV-TRACK被开发为一个众包型知识库(http://evtrack.org),以推动EV生物学及其研究成果所用方法的更透明化报告3。尽管已有这些标准化报告建议,该领域在重复和验证已发表结果方面仍持续面临困境。
为响应美国国立卫生研究院(NIH)和国家科学基金会(NSF)对质量评估工具的倡导,本文提出国际细胞外囊泡学会(ISEV)应要求对方法和细节进行标准化报告,以便应用数据评估工具,实现不同实验室间结果的重复验证。报告细胞来源、细胞培养程序以及细胞外囊泡(EV)分离方法,是明确定义EV群体特性的关键因素。在纳米颗粒追踪分析(NTA)仪器中,检测参数设置、载液折射率、导致多分散性的异质性颗粒群体、缺乏标准化报告要求,以及缺少实验内和实验间观测者测量结果的一致性,使得不同实验室间的NTA结果难以或无法进行比较。
自2006年起投入使用,纳米颗粒追踪分析(NTA)是一种广泛用于测定纳米颗粒尺寸和浓度的方法,目前约80%的细胞外囊泡(EV)研究人员正在使用该方法4。MISEV2018指南要求采用两种单囊泡分析方法,其中NTA是常用选项之一。由于其设备普及性高、单个样品检测成本低以及理论基础简单(基于斯托克斯-爱因斯坦方程),NTA在EV表征中持续被广泛使用。通过NTA对EV进行评估时,利用激光光散射和布朗运动分析生成颗粒尺寸分布及浓度估算结果,其检测下限由EV的折射率决定。当使用已知黏度和温度的液体样品时,通过追踪EV的运动轨迹,测定其在二维空间中的均方位移,从而计算出颗粒的扩散系数,并利用修正的斯托克斯-爱因斯坦方程将其转换为等效球形的流体动力学直径5,6,7。与其他表征方法相比,NTA的逐颗粒分析在异质性EV群体中受聚集体或较大颗粒的干扰更小7。尽管少数较大颗粒对尺寸测定准确性影响较小,但即使存在微量的大尺寸、强光散射颗粒,也会因软件对EV的检测与追踪能力下降,显著降低对较小颗粒的检出率8。作为一种测量技术,NTA通常被认为不会偏向于检测较大颗粒或颗粒聚集体,并且能够通过单颗粒分析分辨出不同尺寸的颗粒亚群9。由于该方法依赖颗粒的光散射特性,其局限性之一是:任何在折射率和尺寸特性上与EV相似的微粒(如灰尘、塑料碎屑或粉末)均无法通过此方法与真实的EV区分开来。
NanoSight LM10(纳米颗粒尺寸分析仪)和LM14(激光模块)自2006年起开始销售,尽管该仪器已推出更新的型号,但此特定型号仍广泛存在于许多核心设施中,并被视为可靠的主力设备。为了对粒径和浓度进行高分辨率测量,需要经过培训以正确优化NTA的设置。实现最佳视频录制的两个关键设置是:(1)相机水平和(2)检测阈值。这些参数必须由操作人员根据样品的特性进行设定。NTA分析的一个主要限制是建议样品浓度范围在107至109颗粒/mL之间,为此可能需要对样品进行稀释10。用于稀释的溶液(如磷酸盐缓冲盐水、0.15 M生理盐水或超纯水)很少能完全不含粒径小于220 µm的颗粒,这些颗粒可能会影响NTA的测量结果。应对所用稀释液在与分析纳米颗粒样品相同的相机水平和检测阈值下进行NTA表征。在涉及细胞外囊泡(EV)的NTA分析研究中,很少有文献会报告用于EV样品稀释的稀释剂中存在的纳米颗粒的尺寸和浓度。
本方案采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)对合成的类似细胞外囊泡(EV)的脂质体进行分析,通过设定不同的相机水平、检测阈值以及对样品进行机械过滤,系统研究相机水平、检测阈值或样品过滤对NTA数据集的影响。脂质体的合成方法见补充文件 S1。本实验选用合成脂质体,因其粒径均一、物理特性明确,且在4 °C储存时稳定性良好。尽管也可使用实际的EV样品,但EV在储存过程中存在的异质性和不稳定性可能使本研究及其结果解释更为复杂。NTA分析结果在(A)脂质体与(B)EV之间具有相似性,表明本文中在脂质体上揭示的系统性影响很可能同样适用于EV的表征(图1)。综上,这些发现支持以下观点:关键软件参数的完整报告,以及对样品处理过程(如稀释液、稀释倍数和过滤)的详细描述,对NTA数据的可重复性具有重要影响。
本文的目的是证明,改变NTA设置(温度、相机水平和检测阈值)以及样品制备方法会影响所获得的结果:在粒径和浓度上均观察到系统性且显著的差异。由于NTA是满足MISEV2018表征标准的常用方法之一,这些结果凸显了报告样品制备过程和NTA设置参数的重要性,以确保实验的可重复性。

图1:NTA检测报告代表性示例,用于比较脂质体与细胞外囊泡(EVs)。(A)脂质体:2020年3月12日通过NTA表征的未过滤样品。(B)细胞外囊泡(EVs):2021年8月26日通过NTA表征的未过滤样品。缩写:NTA = 纳米颗粒追踪分析;EVs = 细胞外囊泡。请点击此处查看该图的高清版本。
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1. 通用实验方案指南
2. 50 nm和100 nm尺寸校准标准品的制备
注意:参见材料表。
3. 激光模块的清洁与组装
样品前及样品间激光模块的冲洗程序
5. 将激光模块放置在显微镜载物台上

图2:激光模块聚焦对准指南。请点击此处查看此图的放大版本。
6. 激光模块的聚焦与定位
注意:此步骤必须在腔室内有液体的情况下进行。
7. 将标准品/样品/稀释液加入激光模块以进行纳米颗粒追踪分析(NTA)
8. 校准的验证
注意:建议在进行样品分析之前,使用尺寸标准品(参见第2节)验证模块校准。常规验证对于确保测量结果的准确性至关重要。在多用户实验室中,不同用户对软件配置参数的修改可能会无意中导致数据采集不准确。对于关键数据的采集,每日验证是良好实验室规范的基本要求。验证结果的日间重复性应包含在报告的结果中。通常情况下,校准参数由技术人员设定,普通用户无法调整,除非该用户具有管理员权限。此措施可防止用户未经授权对系统进行重新配置。
9. 优化 NTA 样本浓度
注意:当相机水平和样品浓度调节适当时,屏幕上应包含 50 到 100 个可测量的颗粒。如果对样品的颗粒数量是否合适存在疑问,此时可对该样品进行一次快速测量(参见步骤 9.1 至 9.7),用于在进行较长视频采集前快速评估样品特性。快速测量选项卡位于底部中间区域的SOP选项卡内。
10. 样品NTA
注意:标准测量选项卡位于底部中间框内的SOP选项卡中,用于常规样品分析(见步骤 10.1 至 10.12)。
11. 在不同检测阈值下对当前样本进行重新分析
注意:在完成纳米颗粒追踪分析(步骤 10)后,可使用不同的检测阈值设置对数据进行重新分析。但是,相机水平 在图像采集完成后无法更改。
12. 归档文件的分析
注意:如果先前分析的实验未保存,或需要对这些样品进行额外分析,可将各个文件重新载入NTA软件,以进行额外的检测阈值评估。采集完成后无法修改相机水平设置。
13. 激光模块的清洁与拆卸
14. 样品分析方案
15. NTA 结果的统计分析
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表1包含了脂质体样品(18个过滤样品和18个未过滤样品)以及代表性DPBS稀释液的NTA视频分析结果。本文中,对两组样品的比较均不考虑相机灵敏度水平或检测阈值的影响。过滤样品的平均粒径为108.5 nm,粒径众数为86.2 nm,浓度为7.4 × 108 个颗粒/mL。相比之下,未过滤样品的平均粒径为159.1 nm,粒径众数为105.7 nm,浓度为7.6 × 108 个颗粒/mL。无论相机灵敏度水平或检测阈值如何,过滤与未过滤样品在平均粒径和粒径众数上的差异均具有统计学意义(p < 0.05)。而两组样品在颗粒浓度上的差异,无论相机灵敏度水平或检测阈值如何,均无统计学意义(p = 0.86)。
| 过滤样品与未过滤样品的比较 | ||||||||||||
| ... | ||||||||||||
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目前有多种方法可用于估算纳米颗粒的尺寸和浓度11。这些方法包括基于群体分析以获得尺寸估算值的集合方法,如动态光散射(DLS)、离心沉降法,以及在单颗粒水平上进行分析的方法,如电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)、原子力显微镜和可调电阻脉冲传感技术。其中,DLS和NTA是基于理想介质中布朗运动的常用非破坏性尺寸与浓度测量方法。DLS依赖于光的散射,其散射光强度与颗粒体积的平方成正比。因此,相较于NTA,DLS对大颗粒、聚集体或粒径分布不均的颗粒群体更为敏感。
NTA 通过测量单个粒子在连续视频帧中的运动路径长度来计算其扩散系数。NTA 的主要局限性在于其可检测的粒子浓度范围较窄,相较于动态光散射(DLS)及其他测量方法,必须确保单个粒子的路径长度处于显微镜的衍射极限以及追踪软件的能力范围之内。由于 DLS 和 NTA 均依赖于布朗运动,因此在单分散体系中两者通常表现出良好的粒径一致性;但在多分散体系或含有聚集体的样品中,结果则会出现偏差。后者会使 DLS 失效,并显著增大 NTA 的粒径估算值12<...
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所有作者均无利益冲突。
本工作获得了堪萨斯州对中西部比较干细胞生物学研究所(MICSCB)的资助, 约翰逊癌症研究中心对 MLW 及美国国立卫生研究院(NIH) R21AG066488 至 LKC获得了MICSCB的GRA资助。作者感谢Santosh Aryal博士提供本项目中使用的脂质体,以及Weiss和Christenson实验室成员提供的有益讨论和反馈。感谢Hong He博士提供的技术支持。MLW感谢Betti Goren Weiss给予的支持与指导。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 自动移液器 | |||
| 离心管,锥形,Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| 吸水纸(Kimwipes) | |||
| 镜头清洁剂 | |||
| 镜头纸 | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 激光模块 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 软件版本 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| 纸巾 | |||
| 移液器吸头,1–200 µL,带滤芯,无菌,低吸附 | BioExpress | P -3243-200X | |
| 移液器吸头,50–1,000 µL,带滤芯,无菌 | BioExpress | P-3243-1250 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲盐水(不含钙或镁) | Gibco | 14190-144 | |
| 标准品,乳胶微球转移标准品,100 nm(3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| 标准品,乳胶微球转移标准品,50 nm (3 mL) | Malvern | NTA4087 | |
| 注射器滤器,33 mm,0.22 µm,MCE 材质,无菌 | Fisher brand | 09-720-004 | |
| 结核菌素注射器,1 mL,滑动式针头接口 | Becton Dickinson | 309659 | |
| 废液收集容器 |
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