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提高可重复性以符合《2018年细胞外囊泡研究最低信息标准》中的纳米颗粒追踪分析指南

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DOI：

10.3791/63059

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2021年11月17日

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1Department of Anatomy and Physiology, Kansas State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

本文内容

摘要

纳米颗粒追踪分析（NTA）是一种广泛用于表征细胞外囊泡的方法。本文重点介绍了NTA实验参数与对照，以及分析和表征样品及稀释液的统一方法，这些内容是对MISEV2018和EV-TRACK指南的必要补充，以实现实验室间的可重复性。

摘要

自2006年以来，纳米颗粒追踪分析（NTA）已成为细胞外囊泡（EV）研究中多种表征方法之一。许多人认为，NTA仪器及其配套软件在经过最少培训后即可轻松使用，且尺寸校准可在实验室内自行完成。由于NTA的数据采集和软件分析均属于EV表征的一部分，因此在《细胞外囊泡研究最小信息标准2018》（MISEV2018）中对此进行了阐述。此外，透明报告与细胞外囊泡研究知识集中平台（EV-TRACK）也对这些方法进行了监控，以提高EV实验的稳健性（例如，尽量减少由未受控因素引起的实验变异）。

尽管已有努力推动研究方法和对照的报告，但许多已发表的研究论文仍未能报告重现原始纳米颗粒追踪分析（NTA）观测结果所需的关键参数。很少有论文报告阴性对照或稀释液的NTA表征，显然假设市售产品（如磷酸盐缓冲液或超纯蒸馏水）不含颗粒物。同样，研究人员很少报告使用阳性对照或尺寸标准品来验证颗粒尺寸测定的准确性。斯托克斯-爱因斯坦方程通过引入样品黏度和温度变量来确定颗粒的布朗运动位移，因此，在整个样品视频采集过程中报告稳定的激光腔温度，是实现准确重复实验的关键对照措施。样品或稀释液的过滤操作也未被常规报告，即使提及，也很少包括滤膜的具体信息（如生产厂家、膜材料、孔径大小）以及储存条件。国际细胞外囊泡学会（ISEV）所规定的可接受实验细节最低标准中，应包含一份详细记录的NTA操作流程，用于细胞外囊泡（EVs）的表征。以下实验表明，研究人员需自行建立NTA分析方案，并将其纳入发表文献的方法部分，作为满足MISEV2018单囊泡表征要求的可选手段之一。

引言

对细胞外囊泡（EV）及其他纳米级颗粒进行准确且可重复的分析，在科研与工业领域均面临诸多挑战。由于数据采集相关参数的报告缺乏统一标准，EV研究的重复性一直较为困难。为解决这些问题，国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出了一套行业指南，作为EV研究人员应遵循的最低限度的生化、生物物理和功能标准，并以立场声明的形式发布，通常称为MISEV20141。随着EV研究进展的加快，亟需更新指南内容，因此“MISEV2018：国际细胞外囊泡学会的立场声明” 在MISEV2014的基础上进行了扩展2。MISEV2018论文包含了表格、建议的实验方案提纲，以及用于记录特定EV相关表征的具体步骤。为进一步促进实验结果的解读与重复，EV-TRACK被开发为一个众包型知识库（http://evtrack.org），以推动EV生物学及其研究成果所用方法的更透明化报告3。尽管已有这些标准化报告建议，该领域在重复和验证已发表结果方面仍持续面临困境。

为响应美国国立卫生研究院（NIH）和国家科学基金会（NSF）对质量评估工具的倡导，本文提出国际细胞外囊泡学会（ISEV）应要求对方法和细节进行标准化报告，以便应用数据评估工具，实现不同实验室间结果的重复验证。报告细胞来源、细胞培养程序以及细胞外囊泡（EV）分离方法，是明确定义EV群体特性的关键因素。在纳米颗粒追踪分析（NTA）仪器中，检测参数设置、载液折射率、导致多分散性的异质性颗粒群体、缺乏标准化报告要求，以及缺少实验内和实验间观测者测量结果的一致性，使得不同实验室间的NTA结果难以或无法进行比较。

自2006年起投入使用，纳米颗粒追踪分析（NTA）是一种广泛用于测定纳米颗粒尺寸和浓度的方法，目前约80%的细胞外囊泡（EV）研究人员正在使用该方法4。MISEV2018指南要求采用两种单囊泡分析方法，其中NTA是常用选项之一。由于其设备普及性高、单个样品检测成本低以及理论基础简单（基于斯托克斯-爱因斯坦方程），NTA在EV表征中持续被广泛使用。通过NTA对EV进行评估时，利用激光光散射和布朗运动分析生成颗粒尺寸分布及浓度估算结果，其检测下限由EV的折射率决定。当使用已知黏度和温度的液体样品时，通过追踪EV的运动轨迹，测定其在二维空间中的均方位移，从而计算出颗粒的扩散系数，并利用修正的斯托克斯-爱因斯坦方程将其转换为等效球形的流体动力学直径5,6,7。与其他表征方法相比，NTA的逐颗粒分析在异质性EV群体中受聚集体或较大颗粒的干扰更小7。尽管少数较大颗粒对尺寸测定准确性影响较小，但即使存在微量的大尺寸、强光散射颗粒，也会因软件对EV的检测与追踪能力下降，显著降低对较小颗粒的检出率8。作为一种测量技术，NTA通常被认为不会偏向于检测较大颗粒或颗粒聚集体，并且能够通过单颗粒分析分辨出不同尺寸的颗粒亚群9。由于该方法依赖颗粒的光散射特性，其局限性之一是：任何在折射率和尺寸特性上与EV相似的微粒（如灰尘、塑料碎屑或粉末）均无法通过此方法与真实的EV区分开来。

NanoSight LM10（纳米颗粒尺寸分析仪）和LM14（激光模块）自2006年起开始销售，尽管该仪器已推出更新的型号，但此特定型号仍广泛存在于许多核心设施中，并被视为可靠的主力设备。为了对粒径和浓度进行高分辨率测量，需要经过培训以正确优化NTA的设置。实现最佳视频录制的两个关键设置是：（1）相机水平和（2）检测阈值。这些参数必须由操作人员根据样品的特性进行设定。NTA分析的一个主要限制是建议样品浓度范围在107至109颗粒/mL之间，为此可能需要对样品进行稀释10。用于稀释的溶液（如磷酸盐缓冲盐水、0.15 M生理盐水或超纯水）很少能完全不含粒径小于220 µm的颗粒，这些颗粒可能会影响NTA的测量结果。应对所用稀释液在与分析纳米颗粒样品相同的相机水平和检测阈值下进行NTA表征。在涉及细胞外囊泡（EV）的NTA分析研究中，很少有文献会报告用于EV样品稀释的稀释剂中存在的纳米颗粒的尺寸和浓度。

本方案采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）对合成的类似细胞外囊泡（EV）的脂质体进行分析，通过设定不同的相机水平、检测阈值以及对样品进行机械过滤，系统研究相机水平、检测阈值或样品过滤对NTA数据集的影响。脂质体的合成方法见补充文件 S1。本实验选用合成脂质体，因其粒径均一、物理特性明确，且在4 °C储存时稳定性良好。尽管也可使用实际的EV样品，但EV在储存过程中存在的异质性和不稳定性可能使本研究及其结果解释更为复杂。NTA分析结果在（A）脂质体与（B）EV之间具有相似性，表明本文中在脂质体上揭示的系统性影响很可能同样适用于EV的表征（图1）。综上，这些发现支持以下观点：关键软件参数的完整报告，以及对样品处理过程（如稀释液、稀释倍数和过滤）的详细描述，对NTA数据的可重复性具有重要影响。

本文的目的是证明，改变NTA设置（温度、相机水平和检测阈值）以及样品制备方法会影响所获得的结果：在粒径和浓度上均观察到系统性且显著的差异。由于NTA是满足MISEV2018表征标准的常用方法之一，这些结果凸显了报告样品制备过程和NTA设置参数的重要性，以确保实验的可重复性。

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图1：NTA检测报告代表性示例，用于比较脂质体与细胞外囊泡（EVs）。（A）脂质体：2020年3月12日通过NTA表征的未过滤样品。（B）细胞外囊泡（EVs）：2021年8月26日通过NTA表征的未过滤样品。缩写：NTA = 纳米颗粒追踪分析；EVs = 细胞外囊泡。请点击此处查看该图的高清版本。

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方案

1. 通用实验方案指南

  1. 将显微镜置于隔振台或至少置于无振动的实验台上。确保尽量减少外界振动（例如踩踏地板、触碰实验台、关门动作、实验室人员走动等）。
  2. 在所有视频记录过程中，将激光模块的温度设定并维持在恒定温度。
    注意：选择25 °C是因为纳米颗粒分析仪在此温度下进行了校准。因此，所有仪器使用者必须知晓并使用该已校准的温度。室温不是一个可接受的设置，因其可能发生变化。
  3. 确保所有稀释液（也称为阴性对照，例如杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）、超纯蒸馏水[DW]）均使用与待测纳米颗粒样品相同的相机增益水平和检测阈值进行NTA表征。使用已表征的DPBS冲洗激光模块及稀释样品。若阴性对照DPBS中的污染物水平显著，应在样品结果中予以校正。
  4. 在检测前将样品储存在4 °C环境中，切勿冷冻，以免造成脂质体样品降解。分析前将样品、标准品和稀释液在室温下平衡30分钟。
    注意：样品处理方法取决于所检测材料的特性。
  5. 使用快速测量模式检测样品和标准品，以确定合适的稀释倍数，使颗粒浓度达到107至109 particles/mL（约每NTA视频画面50至100个颗粒），该范围被确定为NTA分析的最佳条件。
    注意：作者发现，该浓度范围高端的颗粒浓度可产生更一致且可重复的结果。
  6. 在SOP选项卡的快速和标准测量中，填写采集框内所有相关字段，包括所用的稀释倍数和稀释液。

2. 50 nm和100 nm尺寸校准标准品的制备

注意：参见材料表。

  1. 50 nm 尺寸传递标准品，稀释比例为 1:5,000
    1. 将 2 µL 的 50 nm 标准品加入到 9,998 µL 经 0.22 µm 滤膜过滤的含 10 mM 氯化钾（KCl）/0.03% Tween 20 的超纯水中，置于已用超纯水冲洗两次的 15 mL 圆锥形离心管中。稀释后的 50 nm 标准品可于 4 °C 保存长达一年。
  2. 100 nm 尺寸传递标准品，稀释比例为 1:333
    1. 将 30 µL 的 100 nm 标准品加入到 9,970 µL 经 0.22 µm 滤膜过滤的含 10 mM KCl/0.03% Tween 20 的超纯水中，置于已用超纯水冲洗两次的 15 mL 圆锥形离心管中。稀释后的 100 nm 标准品可于 4 °C 保存长达一年。

3. 激光模块的清洁与组装

  1. 目视检查激光模块和流动池盖板窗口是否有划痕或缺陷。
    注意：如果任一玻璃表面有划痕，可能会影响成像。
  2. 使用优质镜头清洁剂和镜头纸轻轻清洁两个玻璃表面。请勿使用纸巾或纸巾擦拭玻璃表面。
  3. 在组装前，确保O形圈密封圈已正确嵌入流动池盖板的凹槽内。
  4. 将流动池盖板安装到激光模块上，确保电极接触点方向正确。将4个带弹簧的蝶形螺钉穿过流动池板，并旋入激光模块的螺纹孔中，但暂不单独拧紧。
  5. 对流动池盖板施加均匀向下的压力，以对角交替的方式均匀拧紧蝶形螺钉，直至紧密贴合。仅需用手拧紧即可，切勿过度拧紧。
    注意：蝶形螺钉拧紧不均可能导致激光模块表面破裂。新型设计的蝶形螺钉在达到适当压力时会“触底”，从而避免过度拧紧。

样品前及样品间激光模块的冲洗程序

  1. 使用新开封的 DPBS 容器，并分装至经三次冲洗的 15 mL 聚丙烯管中。确保用于冲洗或稀释样本的试剂在使用前已通过 NTA 表征（参见步骤 1.3）。
  2. 用1 mL DPBS将两个带有滑动锁接头的1 mL结核菌素注射器冲洗3次，以去除任何颗粒残留物。可任选一个端口作为输入端，但在实验过程中需始终使用同一端口。禁止使用更大的注射器，以免因注射器重量和体积增加而导致注射器端口破裂。
  3. 从1中取出并丢弃柱塞st 结核菌素注射器并插入剩余的端口，作为废液稀释剂/样本储液池。
    注意：未取出柱塞将导致样品室压力升高，并在密封圈周围发生泄漏。
  4. 填充 2nd 用1 mL DPBS的注射器连接至流室盖的入口端口。
  5. 将激光模块倾斜持握，使出口处的注射器接口抬高，以便在将DPBS缓慢注入激光模块时，使腔室内的空气得以排出。
  6. 通过向进样口注入1 mL空气，将激光模块中残留的DPBS冲洗干净。重复此冲洗步骤2次。
  7. 最后一次冲洗后，尽可能完全排空激光模块。
    ​注意：在完成50 nm标准品的NTA分析后，必须对系统进行彻底、仔细的冲洗，因为这些颗粒会残留在激光模块中。激光模块现已准备就绪，可供使用。

5. 将激光模块放置在显微镜载物台上

  1. 找到显微镜臂上的激光模块调焦对准指南（图2），并使用调焦旋钮对其进行对准。

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图2：激光模块聚焦对准指南。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 面对显微镜，将激光模块放入带槽的载物台上，并轻轻向右滑动至最远位置。
    注意：若操作得当，样品之间的光路准直和聚焦光斑将更容易定位。
  2. 打开激光控制盒上的摇杆开关。

6. 激光模块的聚焦与定位

注意：此步骤必须在腔室内有液体的情况下进行。

  1. 加载 NTA 软件（参见 材料表）从桌面。
    注意：可能会出现错误， "在 COM3 上未找到温度硬件。" 只需关闭并重新打开软件即可修复。
  2. 点击 启动相机 在……之下 捕获 左上角方框中的标签。如果摄像头在5分钟后自动关闭，只需单击 启动相机 再次重启。
  3. 在同一标签页中，调整 相机水平 到 14 至 16 以增强激光线亮度并简化粒子识别与聚焦。
  4. 通过推入或拉出目镜筒左侧上方的滑块，将相机的图像转至目镜。
  5. 密度增加的区域，通常称为 指纹将指纹在视野中垂直居中并调焦。
    注意：激光线将位于指纹的左侧。调暗房间有助于定位指纹并聚焦于激光线。
  6. 将激光线置于视野中央；根据计算机屏幕上的观察结果，移动顶部滑块以将光线引导至相机。
    注意：屏幕上现在可见的激光线是目镜视野的镜像；在目镜中左侧的位置在计算机屏幕上会显示在右侧。
  7. 使用调焦旋钮调整焦距，使屏幕上单个运动颗粒的图像更清晰。
    注意：由于景深的限制，并非所有颗粒都能完全聚焦，这是可接受的。即使略微失焦的颗粒也会被相机捕获并由软件分析。

7. 将标准品/样品/稀释液加入激光模块以进行纳米颗粒追踪分析（NTA）

  1. 用已冲洗的1 mL结核菌素注射器吸取1 mL标准品/样品/稀释液，并将其连接至流式池盖的进样口。推动活塞，直至连接在出样口的开放注射器中可见液体流出。
  2. 在相机视野中，向激光线右侧移动至颗粒数量均匀的区域。如有必要，调整垂直方向，使水平光带居中。重新对焦，直至视野中颗粒数量最多。确保在后续所有测量中尽可能保持此位置不变。
  3. 调节Camera Level，使相机视图右上角的Dark信息图标间歇性闪烁。
    注意：这有助于确保在每次数据采集系列中，均在最低灵敏度水平下一致地选择相机水平。
    注意：Camera Level在采集过程中不可更改。

8. 校准的验证

注意：建议在进行样品分析之前，使用尺寸标准品（参见第2节）验证模块校准。常规验证对于确保测量结果的准确性至关重要。在多用户实验室中，不同用户对软件配置参数的修改可能会无意中导致数据采集不准确。对于关键数据的采集，每日验证是良好实验室规范的基本要求。验证结果的日间重复性应包含在报告的结果中。通常情况下，校准参数由技术人员设定，普通用户无法调整，除非该用户具有管理员权限。此措施可防止用户未经授权对系统进行重新配置。

  1. 将稀释的标准品（见第2节）在室温下温育30分钟。
  2. 短暂涡旋振荡标准品，然后按照第7节所述方法上样。
  3. 按照第10节所述方法进行样品纳米颗粒追踪分析（NTA），并记录数值用于后续计算变异系数，若校准正确，变异系数应小于2%。

9. 优化 NTA 样本浓度

注意：当相机水平和样品浓度调节适当时，屏幕上应包含 50 到 100 个可测量的颗粒。如果对样品的颗粒数量是否合适存在疑问，此时可对该样品进行一次快速测量（参见步骤 9.1 至 9.7），用于在进行较长视频采集前快速评估样品特性。快速测量选项卡位于底部中间区域的SOP选项卡内。

  1. 将捕获时长设置为30 s。
  2. 接受现有的默认文件名，或通过点击...标签指定新的数据存储位置以输入新文件名。
  3. 勾选目标温度复选框，并输入所需的温度值。
  4. 按照前述方法加载样品（步骤 7.1），然后点击创建并运行脚本。
  5. 30 s 视频采集完成后，等待视频画面右下角显示每帧的粒子数量。如果粒子数超过 100，需对激光模块冲洗 3 次（如步骤 4.6 中所述）。
  6. 使用已知特性的稀释液将样品稀释至所需浓度范围。
  7. 将适当稀释后的样品注入已冲洗的激光模块中，运行快速测量以确认样品处于可接受范围内。

10. 样品NTA

注意：标准测量选项卡位于底部中间框内的SOP选项卡中，用于常规样品分析（见步骤 10.1 至 10.12）。

  1. 设置持续时间为 30 或 60 s 以及视频的数量 5.
  2. 接受现有基础文件名，或通过点击输入新的文件名 ... 用于存储生成数据的新存储位置的标签
  3. 选中该复选框 目标温度 并输入所需温度。
  4. 点击 创建脚本 以重复使用此 标准测量.
  5. 样品按第7节所述加载且实验准备就绪后，点击 创建并运行脚本.
  6. 填写以下字段中的信息 设置报告详情 包含操作人员、样本描述、样本稀释倍数及所用稀释液信息的弹出窗口。
    注意：此信息将被记录并打印在最终的实验报告中。
  7. 当所有所需字段填写完毕后，点击 好的 运行脚本。
    注意：如果 目标温度 已选择加热器将 将样品在激光模块中稳定至所需位置 温度保持5秒后，程序将继续进行测量。屏幕左下角的诊断面板将显示“HEATER ON”并呈现样品温度。
  8. 每次视频采集前，请留意提示 前进 手动推动活塞。将约 0.05 mL 样品注入激光腔室，使颗粒达到平衡状态 "休息" （即，不流动），然后点击 好的.
  9. 等待 设置确认 5 完成后出现的框th 视频采集和用于 流程框 闪烁。设置 检测阈值 通过手动逐帧从视频屏幕底部向前推进，记录屏幕上标记颗粒的蓝色叉号数量，以对样品进行处理。如果随着帧的推进，每个屏幕上的蓝色叉号标记颗粒超过3-4个，则增加 检测阈值.
    注意：单个颗粒上的蓝色十字类似于 "群集" 在流式细胞术中会产生影响，应尽量减少以确保数据采集的最佳准确性和可重复性。
  10. 点击 设置 确认 当检测阈值可接受时。
  11. 等待视频自动处理完成，并显示结果直方图及完成提示对话框后，再进行点击 OK.
  12. 一旦 导出设置 出现对话框后，单击保存结果 导出.
    注意：所有来自视频和分析的结果将存储在步骤 10.2 中定义的目标文件中。这需要大量存储空间。请根据需要监控并转移至辅助存储设备。

11. 在不同检测阈值下对当前样本进行重新分析

注意：在完成纳米颗粒追踪分析（步骤 10）后，可使用不同的检测阈值设置对数据进行重新分析。但是，相机水平 在图像采集完成后无法更改。

  1. 在当前实验中列出的5个捕获视频全部选中。
  2. 点击处理选定文件，等待设置确认对话框出现，同时处理框闪烁，以调整检测阈值。
  3. 将检测阈值调节至所需水平，然后点击设置确定。
  4. 等待视频自动处理完成，结果直方图及完成提示对话框显示后，再点击确定。
  5. 点击导出设置。当对最近的样本进行额外评估时，务必在当前实验中点击导出结果框，因为在样本重新分析后，导出结果弹窗将不再显示。
    注意：由于系统不会提醒执行此操作，容易被忽略，导致分析结果丢失。但原始数据仍将保留，可后续重新分析。

12. 归档文件的分析

注意：如果先前分析的实验未保存，或需要对这些样品进行额外分析，可将各个文件重新载入NTA软件，以进行额外的检测阈值评估。采集完成后无法修改相机水平设置。

  1. 从桌面启动NTA软件。
  2. 在下方中间面板中点击 Analysis 选项卡。
  3. 点击 Open Experiment ，并导航至所需的 .nano 文件。
    注意：所选 .nano 实验关联的视频文件必须与主实验文件位于同一文件夹中；否则在处理文件时将出现错误。文件名的前6位数字为实验运行日期（xx-xx-xx），后6位数字为视频录制时间（xx-xx-xx）及单个视频的标识符。每次合并实验的PDF文件中列出了该分析所包含的所有 .nano 文件。
  4. 点击 Process Selected Files 以运行分析。
  5. 当 Process 对话框闪烁并允许更改 Detection Threshold 时，将阈值设置为所需水平，然后点击 OK。
  6. 等待视频自动处理完成，并显示结果直方图及完成提示对话框后，再点击 OK。
  7. 点击 Export Results。务必在 Current Experiment 中点击 Export Results 按钮，因为在重新分析后将不会弹出 Export Results 对话框。
    注意：由于系统不会提醒执行此操作，容易被忽略，导致分析结果丢失。

13. 激光模块的清洁与拆卸

  1. 关闭激光控制箱。
  2. 将激光模块中的全部样品冲洗出来，并妥善丢弃。
  3. 倾斜持握激光模块，使开口的注射器端口朝上，缓慢向激光模块内注入DPBS，同时从出口注射器端口排出液体，以排出腔体内的空气。
  4. 将激光模块中残留的DPBS冲洗干净并丢弃。
  5. 重复冲洗2次，最后一次冲洗后尽可能彻底排空激光模块。
  6. 均匀下压流路池盖板，以对角交替方式均匀松开手拧螺钉直至脱离螺纹，取下螺钉并存放于激光模块箱内。
  7. 从激光模块上取下流路池盖板。
  8. 使用高质量的镜头清洁剂和镜头纸轻轻清洁两块玻璃表面。切勿使用纸巾或纸巾类材料擦拭玻璃表面。
  9. 使用后，目视检查激光模块和流路池盖板的“窗口”是否存在划痕或缺陷，并向主管报告。
  10. 将激光模块和流路池盖板放回其存放箱中，以防止储存期间玻璃表面受损。

14. 样品分析方案

  1. 未过滤样品
    1. 上样前涡旋混匀样品，并按照上述方法在Camera Level 12和Detection Threshold Level 3条件下记录5段60秒视频。使用Detection Thresholds 2和5对这些视频重新进行分析。
    2. 在同一份样品上重复采集视频，分别在Camera Levels 13和14以及Detection Threshold Level 3条件下进行。使用Detection Thresholds 2和5对额外采集的2段视频进行重新分析。在SOP设置下，重复整个过程，采集5段30秒视频。
  2. 过滤样品
    1. 涡旋混匀样品后，立即通过注射器滤膜（0.22 µm）直接将样品加载并过滤至激光模块中。
      注：使用前，用相当于滤膜死体积2倍的样品冲洗滤膜，以去除残留微粒。所用注射器滤膜（见材料表）的实测死体积为0.5 mL，测量前用1.0 mL样品冲洗。在SOP数据字段中记录滤膜类型。过滤后的样品按照步骤14.1中所述未过滤样品的处理方法完全相同的方式进行处理。

15. NTA 结果的统计分析

  1. 在分析主效应或交互作用时，应先检验方差分析（ANOVA）的假设条件（正态性、单峰性、方差齐性），然后进行方差分析。若不满足ANOVA的假设条件，则采用Kruskal-Wallis秩和检验进行单因素方差分析。
  2. 当主效应显著时，使用Dunn法对预先设定的比较进行均值检验。双尾检验中以p值小于0.05为具有统计学意义。
    注：此处生成的数据文件可在签署材料转移协议后向作者索取。

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结果

表1包含了脂质体样品（18个过滤样品和18个未过滤样品）以及代表性DPBS稀释液的NTA视频分析结果。本文中，对两组样品的比较均不考虑相机灵敏度水平或检测阈值的影响。过滤样品的平均粒径为108.5 nm，粒径众数为86.2 nm，浓度为7.4 × 108 个颗粒/mL。相比之下，未过滤样品的平均粒径为159.1 nm，粒径众数为105.7 nm，浓度为7.6 × 108 个颗粒/mL。无论相机灵敏度水平或检测阈值如何，过滤与未过滤样品在平均粒径和粒径众数上的差异均具有统计学意义（p < 0.05）。而两组样品在颗粒浓度上的差异，无论相机灵敏度水平或检测阈值如何，均无统计学意义（p = 0.86）。

过滤样品与未过滤样品的比较
...

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讨论

目前有多种方法可用于估算纳米颗粒的尺寸和浓度11。这些方法包括基于群体分析以获得尺寸估算值的集合方法，如动态光散射（DLS）、离心沉降法，以及在单颗粒水平上进行分析的方法，如电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、原子力显微镜和可调电阻脉冲传感技术。其中，DLS和NTA是基于理想介质中布朗运动的常用非破坏性尺寸与浓度测量方法。DLS依赖于光的散射，其散射光强度与颗粒体积的平方成正比。因此，相较于NTA，DLS对大颗粒、聚集体或粒径分布不均的颗粒群体更为敏感。

NTA 通过测量单个粒子在连续视频帧中的运动路径长度来计算其扩散系数。NTA 的主要局限性在于其可检测的粒子浓度范围较窄，相较于动态光散射（DLS）及其他测量方法，必须确保单个粒子的路径长度处于显微镜的衍射极限以及追踪软件的能力范围之内。由于 DLS 和 NTA 均依赖于布朗运动，因此在单分散体系中两者通常表现出良好的粒径一致性；但在多分散体系或含有聚集体的样品中，结果则会出现偏差。后者会使 DLS 失效，并显著增大 NTA 的粒径估算值12<...

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披露

所有作者均无利益冲突。

致谢

本工作获得了堪萨斯州对中西部比较干细胞生物学研究所（MICSCB）的资助， 约翰逊癌症研究中心对 MLW 及美国国立卫生研究院（NIH） R21AG066488 至 LKC获得了MICSCB的GRA资助。作者感谢Santosh Aryal博士提供本项目中使用的脂质体，以及Weiss和Christenson实验室成员提供的有益讨论和反馈。感谢Hong He博士提供的技术支持。MLW感谢Betti Goren Weiss给予的支持与指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
自动移液器
离心管，锥形，Nunc 15 mLThermo Sci.339650
吸水纸（Kimwipes）
镜头清洁剂
镜头纸
NanoSight LM-10Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 激光模块Malvern Panalytical
NanoSight NTA 软件版本 3.2Malvern Panalytical
纸巾
移液器吸头，1–200 µL，带滤芯，无菌，低吸附BioExpressP -3243-200X
移液器吸头，50–1,000 µL，带滤芯，无菌BioExpressP-3243-1250
杜氏磷酸盐缓冲盐水（不含钙或镁）Gibco14190-144
标准品，乳胶微球转移标准品，100 nm（3 mL）MalvernNTA4088
标准品，乳胶微球转移标准品，50 nm （3 mL）MalvernNTA4087
注射器滤器，33 mm，0.22 µm，MCE 材质，无菌Fisher brand09-720-004
结核菌素注射器，1 mL，滑动式针头接口Becton Dickinson309659
废液收集容器

参考文献

  1. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
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