提高可重复性以符合《2018年细胞外囊泡研究最低信息标准》中的纳米颗粒追踪分析指南

摘要

纳米颗粒追踪分析（NTA）是一种广泛用于表征细胞外囊泡的方法。本文重点介绍了NTA实验参数与对照，以及分析和表征样品及稀释液的统一方法，这些内容是对MISEV2018和EV-TRACK指南的必要补充，以实现实验室间的可重复性。

摘要

自2006年以来，纳米颗粒追踪分析（NTA）已成为细胞外囊泡（EV）研究中多种表征方法之一。许多人认为，NTA仪器及其配套软件在经过最少培训后即可轻松使用，且尺寸校准可在实验室内自行完成。由于NTA的数据采集和软件分析均属于EV表征的一部分，因此在《细胞外囊泡研究最小信息标准2018》（MISEV2018）中对此进行了阐述。此外，透明报告与细胞外囊泡研究知识集中平台（EV-TRACK）也对这些方法进行了监控，以提高EV实验的稳健性（例如，尽量减少由未受控因素引起的实验变异）。

尽管已有努力推动研究方法和对照的报告，但许多已发表的研究论文仍未能报告重现原始纳米颗粒追踪分析（NTA）观测结果所需的关键参数。很少有论文报告阴性对照或稀释液的NTA表征，显然假设市售产品（如磷酸盐缓冲液或超纯蒸馏水）不含颗粒物。同样，研究人员很少报告使用阳性对照或尺寸标准品来验证颗粒尺寸测定的准确性。斯托克斯-爱因斯坦方程通过引入样品黏度和温度变量来确定颗粒的布朗运动位移，因此，在整个样品视频采集过程中报告稳定的激光腔温度，是实现准确重复实验的关键对照措施。样品或稀释液的过滤操作也未被常规报告，即使提及，也很少包括滤膜的具体信息（如生产厂家、膜材料、孔径大小）以及储存条件。国际细胞外囊泡学会（ISEV）所规定的可接受实验细节最低标准中，应包含一份详细记录的NTA操作流程，用于细胞外囊泡（EVs）的表征。以下实验表明，研究人员需自行建立NTA分析方案，并将其纳入发表文献的方法部分，作为满足MISEV2018单囊泡表征要求的可选手段之一。

引言

对细胞外囊泡（EVs）及其他纳米级颗粒进行准确且可重复的分析，在科研与工业领域均面临诸多挑战。由于数据采集相关参数的报告缺乏统一标准，EV研究的重复性一直较为困难。为解决这些问题，国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出了一套行业指南，作为EV研究人员应遵循的最低限度的生化、生物物理和功能标准，并以立场声明的形式发布，通常称为MISEV2014¹。随着EV研究进展的加快，亟需更新指南内容，因此“MISEV2018：国际细胞外囊泡学会的立场声明”对MISEV2014指南进行了扩展²。MISEV2018论文包含了表格、建议的实验方案提纲，以及用于记录特定EV相关表征的具体步骤。为进一步促进实验结果的解读与重复，EV-TRACK被开发为一个众包知识库（http://evtrack.org），以提高EV生物学研究及其发表成果所用方法的透明度³。尽管已有这些标准化报告建议，该领域在重复和验证已发表结果方面仍持续面临困难。

本文响应美国国立卫生研究院（NIH）和国家科学基金会（NSF）对质量评估工具的倡导，提出国际细胞外囊泡学会（ISEV）应要求对方法和细节进行标准化报告，以便应用数据评估工具，实现不同实验室间结果的可重复性。报告细胞来源、细胞培养流程以及细胞外囊泡（EV）分离方法，是定义EV群体特性的关键因素。在纳米颗粒跟踪分析（NTA）仪器中，检测....

方案

1. 通用实验方案指南

1. 将显微镜放置在气浮台或至少无振动的实验台上。确保尽量减少外界振动（例如踩踏地板、触碰实验台、关门、实验室人员走动）的影响。
2. 在所有视频记录过程中，将激光模块的温度设定并维持在恒定温度。
   注：选择25 °C是因为纳米颗粒分析仪在此温度下进行了校准。因此，所有仪器使用者都必须知晓并使用该校准温度。室温不是可接受的设置，因其可能波动。
3. 确保所有稀释液（也称为阴性对照，如杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）、超纯蒸馏水[DW]）均使用与待测纳米颗粒样品相同的相机增益和检测阈值进行NTA表征。使用已表征的DPBS冲洗激光模块并稀释样品。若阴性对照DPBS中的污染物水平显著，应在样品结果中予以校正。
4. 样品在评估前应于4 °C保存，切勿冷冻，以免破坏脂质体样品。分析前将样品、标准品和稀释液在室温下复温30分钟。
   注：样品处理方式针对所检测材料的具体特性而定。
5. 使用快速测量模式检测样品和标准品，以确定合适的稀释倍数，使浓度达到10⁷至10⁹颗粒/mL（约每NTA视频画面50至100个颗粒），该范围被确定为NTA分析的最佳条件。
   注：作者发现，该范围内较高浓度的颗粒可产生更一致且可重复的结果。
6. 在SOP选项卡的快速

结果

表1包含了脂质体样品（18个过滤样品和18个未过滤样品）以及代表性DPBS稀释液的NTA视频分析结果。本文中，对两组样品的比较均不考虑相机灵敏度水平或检测阈值的影响。过滤样品的平均粒径为108.5 nm，粒径众数为86.2 nm，浓度为7.4 × 10⁸ 粒子/mL。相比之下，未过滤样品的平均粒径为159.1 nm，粒径众数为105.7 nm，浓度为7.6 × 10⁸ 粒子/mL。无论相机灵敏度水平或检测阈值如何，过滤与未过滤样品在平均粒径和粒径众数上的差异均具有统计学意义（p < 0.05）。而两组样品在浓度上的差异，无论相机灵敏度水平或检测阈值如何，均无统计学意义（p = 0.86）。

过滤样品与未过滤样品的比较

样品

讨论

目前有多种方法可用于估算纳米颗粒的尺寸和浓度¹¹。这些方法包括基于群体分析以获得尺寸估算值的集合方法，如动态光散射（DLS）、离心沉降法，以及在单颗粒水平上进行分析的方法，如电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、原子力显微镜和可调电阻脉冲传感技术。其中，DLS和NTA是基于理想介质中布朗运动的常用非破坏性尺寸与浓度测量方法。DLS依赖于光的散射，其散射光强度与颗粒体积的平方成正比。因此，相较于NTA，DLS对大颗粒、聚集体或粒径分布不均的颗粒群体更为敏感。

NTA 通过测量单个粒子在连续视频帧中的运动路径长度来计算其扩散系数。NTA 的主要局限性在于其可检测的粒子浓度范围较窄，相较于动态光散射（DLS）及其他测量方法，必须确保单个粒子的路径长度处于显微镜的衍射极限以及追踪软件的能力范围之内。由于 DLS 和 NTA 均依赖于布朗运动，因此在单分散体系中两者通常表现出良好的粒径一致性；但在多分散体系或含有聚集体的样品中，结果则会出现偏差。后者会使 DLS 失效，并显著增大 NTA 的粒径估算值^12<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动移液器
离心管，锥形，Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
吸水纸（Kimwipes）
镜头清洁剂
镜头纸
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 激光模块	Malvern Panalytical
NanoSight NTA 软件版本 3.2	Malvern Panalytical
纸巾
移液器吸头，1–200 µL，带滤芯，无菌，低吸附	BioExpress	P -3243-200X
移液器吸头，50–1,000 µL，带滤芯，无菌	BioExpress	P-3243-1250
杜氏磷酸盐缓冲盐水（不含钙或镁）	Gibco	14190-144
标准品，乳胶微球转移标准品，100 nm（3 mL）	Malvern	NTA4088
标准品，乳胶微球转移标准品，50 nm （3 mL）	Malvern	NTA4087
注射器滤器，33 mm，0.22 µm，MCE 材质，无菌	Fisher brand	09-720-004
结核菌素注射器，1 mL，滑动式针头接口	Becton Dickinson	309659
废液收集容器