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方法文章

利用生物发光技术监测小鼠体内乳腺癌生长及转移灶形成

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DOI：

10.3791/63060

⸱

2021年11月5日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Institute for Medical Research Israel-Canada, The Hebrew University-Hadassah Medical School

本文内容

摘要

本文介绍了一种非侵入性监测方法，该方法涉及在多种乳腺癌细胞系中表达荧光素酶和绿色荧光蛋白。本方案提供了一种在小鼠体内实时监测肿瘤形成和转移定植的技术。

摘要

乳腺癌是一种常见的异质性恶性肿瘤，也是女性死亡的第二大原因，主要归因于远处器官转移。目前已建立了多种动物模型，包括广泛使用的原位小鼠模型，即将癌细胞注射到乳腺脂肪垫中。然而，这些模型无法帮助监测肿瘤生长动力学和转移定植过程。用于在小鼠体内实时监测癌细胞的前沿技术将显著推动对肿瘤生物学的理解。

在此，建立了稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP）的乳腺癌细胞系。该技术具体包含两个连续步骤，首先通过检测荧光素酶活性开始 体外 随后将癌细胞植入非肥胖型糖尿病-重度联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠的乳腺脂肪垫中。注射后，通过非侵入性生物发光成像系统实时监测肿瘤生长和转移定植情况。随后，利用荧光显微镜检测肺组织中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转移灶，以验证生物发光成像结果。该复杂系统结合了荧光素酶和荧光检测技术，用于评估癌症转移 体内 在乳腺癌治疗和疾病管理方面具有巨大应用潜力。

引言

乳腺癌是全球常见的癌症类型，在美国每年约有25万例新诊断病例1。尽管其发病率较高，但一系列新型抗癌药物已显著改善了乳腺癌患者的预后2。然而，目前的治疗手段仍不充分，许多患者会出现疾病复发并发生向重要器官的转移性扩散2，而转移是导致患者发病和死亡的主要原因。因此，乳腺癌研究面临的主要挑战之一是鉴定调控远处转移形成的分子机制，以开发抑制转移发生的新方法。

癌症转移是一个动态过程，其中细胞从原发性肿瘤脱落，并通过血液循环侵入邻近组织。因此，细胞经历类似转移级联过程的动物模型有助于揭示调控该过程的机制3,4此外，这些 体内 模型对于开发乳腺癌治疗药物至关重要5,6然而，这些原位模型无法反映肿瘤实际的生长动力学，因为其效应只能在实验终点进行评估。因此，我们建立了一种基于荧光素酶的工具，用于实时检测肿瘤的发生及转移定植。此外，这些细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），可用于检测转移灶。该方法相对简便，且不涉及任何侵入性操作3因此，结合荧光素酶与荧光检测是一种推动乳腺癌治疗及疾病管理临床前研究的有效策略。

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方案

所有小鼠实验均在希伯来大学机构动物护理和使用委员会批准的方案 MD-21-16429-5 下进行。此外，希伯来大学已获得实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的认证。

1. 细胞系的维持

注意：本方案中使用了人乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-468 和 MDA-MB-231）。

  1. 在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、加湿、5% CO2培养箱中培养所有乳腺癌细胞系。
    ​注意：定期检查细胞密度；当细胞融合度达到70%时，进行传代并扩增以供后续使用。

2. 病毒制备

  1. 用 1 mL 胰蛋白酶处理 HEK293T 细胞，直至细胞脱落。
  2. 加入 10 mL DMEM（含 10% FBS）以中和胰蛋白酶活性，并将细胞悬液转移至新的 15 mL 离心管中。
  3. 在 150 × g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。离心后弃去上清液，加入 1 mL 新鲜 DMEM 培养基。
  4. 测定细胞浓度，并以每孔 1.2 × 106 个细胞的密度接种至六孔板中。
  5. 次日，提前预热所有所需试剂，包括转染试剂、无血清 DMEM、包膜质粒（VSV-G）、慢病毒包装质粒（ΔVPR）以及 pLX304 Luciferase-V5 blast 质粒或 FUW GFP 质粒。
  6. 在 1.5 mL 经高压灭菌的离心管中，将 50 µL 无血清 DMEM 与 0.3 µg VSV-G 质粒、1 µg ΔVPR 质粒以及 1.2 µg pLX304 Luciferase-V5 blast 质粒或 FUW GFP 质粒混合。
  7. 将上述质粒与培养基充分混匀后，加入 5 µL 转染试剂，轻轻混匀，并在室温下孵育 15 分钟。
  8. 孵育结束后，将混合液逐滴加入 HEK293T 细胞中。
  9. 24 小时后，更换为 2 mL 含 30% FBS 的 DMEM 培养基。次日（转染后 48 小时），收集含有病毒的培养上清（"pLX304 Luciferase-V5 或 FUW GFP 病毒"）。
    注意：使用 30% FBS 可提高病毒产量。
  10. 为避免残留 HEK293T 细胞，将含病毒的培养基通过 0.45 µm 注射器滤器过滤，或在 150 × g 条件下离心 5 分钟后收集上清液。
    注意：如需长期保存，应将病毒工作分装液置于 -80 °C 保存。

3. 建立稳定表达GFP和荧光素酶（"GFP  + Luc+细胞"）的细胞系

  1. 在感染细胞前一天，将 8 × 105 个细胞接种至六孔板的每个孔中。
  2. 过夜培养后，弃去原培养基，更换为含有 8 µg/mL 多聚素（polybrene）的新鲜培养基，并将 200 µL FUW GFP 病毒液逐滴加入细胞中。
  3. 可选步骤：为提高病毒感染效率，可将六孔板在 37 °C 条件下以 560 × g 离心 30 分钟（即旋转感染，spin infection）。
  4. 继续培养细胞 48 小时，通过荧光显微镜检测 GFP 表达情况。
  5. 利用荧光激活细胞分选技术（FACS）对表达 GFP 的细胞进行分选（GFP+）（图 1A）。
  6. 按照步骤 3.2 的方法，用 pLX304 Luciferase-V5 blast 病毒感染经 GFP 分选后的细胞。
  7. 感染后 30 小时，用含 10 µg/mL 灭瘟素（blasticidin）的培养基处理细胞，以富集表达 pLX304 Luciferase-V5 blast 的细胞（GFP+, Luc+ 细胞）。此后每隔两天更换含灭瘟素的新鲜培养基。同时，作为对照，将未感染的 naïve 细胞培养于相同含灭瘟素的培养基中。
    注意：在使用灭瘟素处理数天后，应能明显观察到感染组与对照组细胞之间的差异。该效应依赖于细胞系，通常需要约 8–10 天。若细胞存活率过低，则提示病毒产量不足。此时应重新制备一批病毒，因低效病毒可能影响后续实验结果。

4. 验证 体外 荧光素酶活性

  1. 培养表达 GFP 的 MCF-7、MDA-MB-468 和 MDA-MB-231 细胞+ Luc+ 在15 cm培养皿中将细胞培养至80%融合度。按照步骤2.1-2.2所述方法，用胰酶消化法收集细胞。
  2. 在每个孔中接种数量递增的细胞（0.1、0.5、1、2、3、4 × 10）4) 加入黑色96孔板中。
    注意：黑色96孔板更适合用于检测荧光素酶水平，因为白色或透明孔板会产生自发光信号。作为对照，可在其中一个孔中仅加入磷酸盐缓冲液（PBS），以确保PBS本身不产生自发光信号。
  3. 用 100 µL DMEM 填充所有孔，于 16–24 小时内孵育。
  4. 用PBS将30 mg/mL的荧光素原液稀释至1.5 mg/mL，配制荧光素溶液。分装荧光素原液，于-20 °C保存。
  5. 用 PBS 轻柔洗涤细胞一次，每孔加入 100 µL 荧光素溶液，孵育 2 min。最后，利用生物发光法检测所有乳腺癌细胞中的荧光素酶活性。
    注意：检查 体外 在动物实验之前，检测GFP和荧光素酶的表达至关重要。此外，需使用空白孔扣除背景值。

5. 向小鼠注射GFP+ Luc+细胞

  1. 转移 5 × 106 （MCF-7 和 MDA-MB-468）或 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ 分别将细胞重悬于200 µL或100 µL PBS中。
  2. 注射前，用5%消毒液清洁无菌生物安全柜（参见 材料表然后，使用含4%异氟烷的过滤空气（0.2 µm滤膜过滤），以1 L/min的气流速度麻醉小鼠，持续2−3分钟。
    注意：必须确认小鼠已正确麻醉；可轻捏小鼠脚趾，观察是否有反应。
  3. 将麻醉后的小鼠置于仰卧位，在其头部放置一个鼻罩。在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间眼睛干燥。
  4. 用棉签蘸取乙醇擦拭小鼠乳腺上方的腹部区域，并提起第4对乳腺th 用镊子夹住乳腺组织。
  5. 将27 G × 3/4（0.4 × 19 mm）针头插入脂肪垫下方，缓慢注射100 µL细胞悬液。
    注意：皮肤下会出现圆形隆起。此外，注射不当可能导致同一实验组中肿瘤生长速率出现偏差或无法形成肿瘤。
  6. 注射操作完成后，将小鼠移出超净台，转入新笼具中。持续观察小鼠，直至其恢复意识。
    ​注意：所有使用过的针头和注射器均须丢弃至锐器盒中。

6. 检测GFP+ Luc+小鼠中荧光素酶的水平

  1. 在进行生物发光检测之前，用左手固定清醒的小鼠颈部。然后将手向左侧倾斜，使小鼠面部朝上，下半身呈仰卧位。
  2. 使用1.0 mL注射器（针头规格为27 G x 3/4（0.4 x 19 mm）），将100 µL荧光素酶底物（30 mg/mL）注射至小鼠左下腹部区域的腹腔内。
    注意：针尖插入腹壁的深度不应超过3–5 mm，以免刺穿内脏器官。此外，建议在无麻醉状态下进行腹腔注射，因为麻醉小鼠体内荧光素的分布速度较清醒小鼠慢。因此，在清醒小鼠中监测荧光素酶水平的操作更为快速。
  3. 注射后让小鼠保持清醒状态7分钟，随后将其置于麻醉舱中3分钟，再开始测量肿瘤动力学。
    注意：孵育时间因不同实验、细胞系及物种而异。因此，建议在正式实验开始前优化并校准孵育时间。
  4. 按照步骤5.2–5.3所述方法对小鼠进行麻醉。
  5. 在孵育期间打开软件（材料表），初始化成像系统，并点击初始化按钮。
    注意：相机冷却至-90 °C大约需要10分钟。此外，作为背景对照，应测量未处理小鼠（即注射了不表达荧光素酶基因细胞的GFP+小鼠）中的荧光素酶水平。
  6. 将系统设置为自动曝光模式，参数如下：曝光时间自动，60 s；中等 binning，光圈F/Stop 1；激发滤光片阻断；发射滤光片打开。当初始化完成后，选择成像向导 | 生物发光，然后点击下一步 | 打开滤光片 | 在图像对象中选择小鼠。
  7. 在视野中选择C级载物台（10 cm），并设置样本高度为1.50 cm。
  8. 点击图像设置载物台至C，在点击采集按钮前，确保小鼠已正确放置于载物台上并保持仰卧位。
  9. 关闭成像舱门，点击采集按钮，并等待图像出现在屏幕上。
    注意：使用自动曝光模式时，强信号的采集时间为5–20 s（取决于信号强度）；弱信号则大约需要60 s。
  10. 对其他小鼠重复此步骤。
  11. 为检测肺转移灶，使用厚的黑色卡纸遮盖原发肿瘤的强信号区域，仅使肺部腹侧暴露于相机视野中。使用上述相同参数采集图像。

7. 采集 离体 利用生物发光和荧光进行成像

  1. 使用干燥器中的二氧化碳（CO2）吸入法处死小鼠，并使用高压灭菌的剪刀和镊子解剖小鼠。
  2. 用0.9%生理盐水灌注小鼠，取出器官，并用1×PBS冲洗以去除器官上的血迹。
  3. 将冲洗后的器官转移至培养皿中，放入生物发光成像仪的载物台上。采用与步骤6.2–6.6中所述相同的生物发光设置。
    注意：由于荧光素酶信号会随时间减弱，此步骤具有时间限制。因此，在处死小鼠后应立即进行器官的生物发光成像。
  4. 对于GFP图像，采用与步骤6.3中所述相同的设置，但将生物发光模式替换为荧光GFP滤光片。
  5. 使用体视显微镜拍摄肺部图像，以检测GFP+克隆的存在情况。

8. 生物发光数据的分析

  1. 双击软件并选择 开放 来自 文件 菜单
  2. 打开所有文件并将其最小化。确保所有单位均为 辐射度（光子）。此外，单击 全部应用 以保持所有图像参数一致。
  3. 来自 查看 菜单，选择 工具面板，这将打开一个新窗口。
  4. 从 工具面板 窗口，选择 ROI 工具 标签和在 类型，选择 平均背景 ROI.
  5. 从 ROI 工具，选择 圆形，并在小鼠的胸部区域画一个小圆圈。
  6. 双击圆圈，选择 用作未来感兴趣区域的背景 选项从 背景 ROI 标签，然后单击 完成.

9. 测量总通量

  1. 从 工具面板 窗口，选择 ROI 工具 标签和在 类型，选择 ROI 的测量.
  2. 从 ROI 工具，选择 圆，并在小鼠的原发肿瘤上画一个大圆圈。
  3. 右键单击 复制感兴趣区域 并右键单击 粘贴感兴趣区域 到每只小鼠的各个单独文件中。
  4. 点击 测量感兴趣区域 来自 ROI 工具 标签，将打开一个名为 ROI 测量. 在此选项卡中，保留 测量类型 作为 辐射度（光子） 和 图像属性 作为 所有已填充的值.
  5. 将文件导出为 测量文件 (*.txt) 或 Csv (*.csv) 格式.
  6. 在电子表格中打开导出的数据并进行 总通量（光子/秒） 以及各周的数值。
    注意：此步骤可用于测量不同组别。例如，经溶剂处理的小鼠 与 那些经药物处理的
  7. 生成一个 XY 散点图，其中 时间 呈现在X轴上 总通量（p/s） 沿Y轴。每周，取 总通量（p/s） 每个样本组的参数，并使用非参数 Student's 检验确定任何显著性差异 t-测试。

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结果

我们构建了表达GFP和荧光素酶载体的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-468）。具体方法为连续感染：首先，用表达荧光GFP的慢病毒载体感染乳腺癌细胞系，筛选出GFP阳性细胞（GFP+感染后2天进行分选（图1A，B）并用 pLX304 Luciferase-V5 载体感染。随后使用杀稻瘟菌素筛选以获得荧光素酶表达，从而生成指定的（GFP+，Luc+) 细胞。为了验证该结果 体外 荧光素酶活性，我们证明了荧光素酶活性水平随细胞数量增加而升高（图1C此外，荧光素酶活性与细胞数量之间存在线性相关性（图1D).

为确认小鼠中荧光素酶的检测效果，将三种GFP+、Luc+乳腺癌细胞系分别注射至雌性NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。...

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讨论

动物实验是癌症研究的必要手段7,8,9，事实上已有许多相关实验方案被开发出来3,6,10,11,12,13,14。然而，大多数研究仅在实验结束时评估生物学效应，因此对肿瘤生长动力学或转移灶定植的影响仍不明确。本文中，我们提供了一种非侵入性的双荧光素酶成像方法，即将表达GFP和荧光素酶的细胞接种至乳腺脂肪垫。利用这一强大工具，可在活体小鼠中实时监测肿瘤的发生与发展及转移过程

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披露

所有作者均已声明不存在任何利益冲突。

致谢

我们感谢Y.D.S.实验室的成员。我们感谢耶路撒冷哈达萨医学中心Wohl转化医学研究所提供小动物成像设施。本研究得到了以下资助： 研究职业发展奖 来自以色列癌症研究基金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.7 mL 离心管LifegeneLMCT1.7B-500
10 µL 吸头LifegeneLRT10
1000 µL 吸头LifegeneLRT1000
15 mL 离心管LifegeneLTB15-500
200 µL 吸头LifegeneLRT200
6 孔细胞培养板COSTAR3516
96 孔黑色平底板Bar NaorBN30496
全自动细胞计数仪ThermofisherA50298
BD FACSAria III 分选仪BD
BD Microlance 3 针头 27 G (3/4'')BD302200
BD Plastipak 注射器 1 mL × 120BD303172
Corning 100 mm × 20 mm 培养皿CORNING430167
Corning 150 mm × 20 mm 培养皿CORNING430599
Countess 细胞计数板载玻片ThermofisherC10228
DMEM 高糖培养基（不含谷氨酰胺）Biological Industries01-055-1A
Eclipse 80i 显微镜Nikon
Eppendorf Centrifuge 5810 R 离心机Sigma AldrichEP5820740000
胎牛血清（FBS）Biological Industries04-127-1A
FUW GFP由耶路撒冷希伯来大学 Yossi Buganim 博士实验室惠赠
HEK293T由耶路撒冷希伯来大学 Lior Nissim 博士实验室惠赠
异氟烷，USP TerrellPiramalNDC 66794-01-25
IVIS Spectrum 活体成像系统Perkin Elmer124262
L-谷氨酰胺溶液Biological industries03-020-1A
Living Image 软件PerkinElmer用于生物发光检测
MCF-7ATCCATCC HTB-22
MDA-MB-231ATCCATCC HTB-26
MDA-MB-468ATCCATCC HTB-132
巴斯德吸管NORMAX2430-475
PBSHylabsBP655/500D
pCMV-dR8.2-dvprAddgene#8455由美国波士顿怀特黑德研究所 David M. Sabatini’s 实验室提供
pCMV-VSV-GAddgene#8454由美国波士顿怀特黑德研究所 David M. Sabatini’s 实验室提供
青霉素-链霉素溶液Biological Industries03-031-1B
90 mm 培养皿（90×15）MINI PLAST820-090-01-017
10 mL 移液管LifegeneLG-GSP010010S
25 mL 移液管LifegeneLG-GSP010050S
5 mL 移液管LifegeneLG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast 质粒Addgene#98580
PolybreneSigma Aldrich#107689
Prism 9GraphPad
试剂储液槽Bar NaorBN20621STR200TC
SMZ18 体视显微镜Nikon
氯化钠Bio-Lab190359400
注射器滤器LifegeneLG-FPV403030S
0.5% 台盼蓝溶液Biological industries03-102-1B
胰蛋白酶 EDTA 溶液 B（0.25%），EDTA（0.05%）Biological Industries03-052-1a
真空驱动滤器SOFRA LIFE SCIENCESPE-22-500
Virusolve消毒剂
VivoGlo 荧光素，活体级PromegaP1043
X-tremeGENE HP DNA 转染试剂Sigma Aldrich#6366236001

参考文献

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