本文介绍了一种非侵入性监测方法，该方法涉及在多种乳腺癌细胞系中表达荧光素酶和绿色荧光蛋白。本方案提供了一种在小鼠体内实时监测肿瘤形成和转移定植的技术。
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本文内容
摘要
摘要
乳腺癌是一种常见的异质性恶性肿瘤，也是女性死亡的第二大原因，主要归因于远处器官转移。目前已建立了多种动物模型，包括广泛使用的原位小鼠模型，即将癌细胞注射到乳腺脂肪垫中。然而，这些模型无法帮助监测肿瘤生长动力学和转移定植过程。用于在小鼠体内实时监测癌细胞的前沿技术将显著推动对肿瘤生物学的理解。
在此，建立了稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP）的乳腺癌细胞系。该技术具体包含两个连续步骤，首先通过检测荧光素酶活性开始 体外 随后将癌细胞植入非肥胖型糖尿病-重度联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠的乳腺脂肪垫中。注射后，通过非侵入性生物发光成像系统实时监测肿瘤生长和转移定植情况。随后，利用荧光显微镜检测肺组织中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转移灶，以验证生物发光成像结果。该复杂系统结合了荧光素酶和荧光检测技术，用于评估癌症转移 体内 在乳腺癌治疗和疾病管理方面具有巨大应用潜力。
引言
乳腺癌是全球常见的癌症类型，在美国每年约有25万例新诊断病例1。尽管其发病率较高，但一系列新型抗癌药物已显著改善了乳腺癌患者的预后2。然而，目前的治疗手段仍不充分，许多患者会出现疾病复发并发生向重要器官的转移性扩散2，而转移是导致患者发病和死亡的主要原因。因此，乳腺癌研究面临的主要挑战之一是鉴定调控远处转移形成的分子机制，以开发抑制转移发生的新方法。
癌症转移是一个动态过程，其中细胞从原发性肿瘤脱落，并通过血液循环侵入邻近组织。因此，细胞经历类似转移级联过程的动物模型有助于揭示调控该过程的机制3,4此外，这些 体内 模型对于开发乳腺癌治疗药物至关重要5,6然而，这些原位模型无法反映肿瘤实际的生长动力学，因为其效应只能在实验终点进行评估。因此，我们建立了一种基于荧光素酶的工具，用于实时检测肿瘤的发生及转移定植。此外，这些细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），可用于检测转移灶。该方法相对简便，且不涉及任何侵入性操作3因此，结合荧光素酶与荧光检测是一....
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方案
所有小鼠实验均在希伯来大学机构动物护理和使用委员会批准的方案 MD-21-16429-5 下进行。此外，希伯来大学已获得实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的认证。
1. 细胞系的维持
注意：本方案中使用了人乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-468 和 MDA-MB-231）。
- 在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、加湿、5% CO2培养箱中培养所有乳腺癌细胞系。
注意：定期检查细胞密度；当细胞融合度达到70%时，进行传代并扩增以供后续使用。
2. 病毒制备
- 用 1 mL 胰蛋白酶处理 HEK293T 细胞，直至细胞脱落。
- 加入 10 mL DMEM（含 10% FBS）以中和胰蛋白酶活性，并将细胞悬液转移至新的 15 mL 离心管中。
- 在 150 × g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。离心后弃去上清液，加入 1 mL 新鲜 DMEM 培养基。
- 测定细胞浓度，并以每孔 1.2 × 106 个细胞的密度接种至六孔板中。
- 次日，提前预热所有所需试剂，包括转染试剂....
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结果
我们构建了表达GFP和荧光素酶载体的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-468）。具体方法为连续感染：首先，用表达荧光GFP的慢病毒载体感染乳腺癌细胞系，筛选出GFP阳性细胞（GFP+感染后2天进行分选（图1A，B）并用 pLX304 Luciferase-V5 载体感染。随后使用杀稻瘟菌素筛选以获得荧光素酶表达，从而生成指定的（GFP+，Luc+) 细胞。为了验证该结果 体外 荧光素酶活性，我们证明了荧光素酶活性水平随细胞数量增加而升高（图1C此外，荧光素酶活性与细胞数量之间存在线性相关性（图1D).
为确认小鼠中荧光素酶的检测效果，将三种GFP+、Luc+乳腺癌细胞系分别注射至雌性NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。.......
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讨论
动物实验是癌症研究的必要手段7,8,9，事实上已有许多相关实验方案被开发出来3,6,10,11,12,13,14。然而，大多数研究仅在实验结束时评估生物学效应，因此对肿瘤生长动力学或转移灶定植的影响仍不明确。本文中，我们提供了一种非侵入性的双荧光素酶成像方法，即将表达GFP和荧光素酶的细胞接种至乳腺脂肪垫。利用这一强大工具，可在活体小鼠中实时监测肿瘤的发生与发展及转移过程
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披露
所有作者均已声明不存在任何利益冲突。
致谢
我们感谢Y.D.S.实验室的成员。我们感谢耶路撒冷哈达萨医学中心Wohl转化医学研究所提供小动物成像设施。本研究得到了以下资助： 研究职业发展奖 来自以色列癌症研究基金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 离心管 | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL 吸头 | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL 吸头 | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL 离心管 | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL 吸头 | Lifegene | LRT200 | |
| 6 孔细胞培养板 | COSTAR | 3516 | |
| 96 孔黑色平底板 | Bar Naor | BN30496 | |
| 全自动细胞计数仪 | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III 分选仪 | BD | ||
| BD Microlance 3 针头 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak 注射器 1 mL × 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm × 20 mm 培养皿 | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm × 20 mm 培养皿 | CORNING | 430599 | |
| Countess 细胞计数板载玻片 | Thermofisher | C10228 | |
| DMEM 高糖培养基（不含谷氨酰胺） | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i 显微镜 | Nikon | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R 离心机 | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| 胎牛血清（FBS） | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | 由耶路撒冷希伯来大学 Yossi Buganim 博士实验室惠赠 | ||
| HEK293T | 由耶路撒冷希伯来大学 Lior Nissim 博士实验室惠赠 | ||
| 异氟烷，USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum 活体成像系统 | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-谷氨酰胺溶液 | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image 软件 | PerkinElmer | 用于生物发光检测 | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| 巴斯德吸管 | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | 由美国波士顿怀特黑德研究所 David M. Sabatini’s 实验室提供 |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | 由美国波士顿怀特黑德研究所 David M. Sabatini’s 实验室提供 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Biological Industries | 03-031-1B | |
| 90 mm 培养皿（90×15） | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| 10 mL 移液管 | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| 25 mL 移液管 | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| 5 mL 移液管 | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast 质粒 | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| 试剂储液槽 | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 体视显微镜 | Nikon | ||
| 氯化钠 | Bio-Lab | 190359400 | |
| 注射器滤器 | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| 0.5% 台盼蓝溶液 | Biological industries | 03-102-1B | |
| 胰蛋白酶 EDTA 溶液 B（0.25%），EDTA（0.05%） | Biological Industries | 03-052-1a | |
| 真空驱动滤器 | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | 消毒剂 | ||
| VivoGlo 荧光素，活体级 | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA 转染试剂 | Sigma Aldrich | #6366236001 |
参考文献
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, Suppl 1 23-34 (2015).
- Saha, D., et al.
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