小鼠原发性肝正弦内皮细胞的分离与表征

摘要

在这里，我们概述并演示了原代小鼠肝脏正弦内皮细胞（LSEC）分离方案。该方案基于肝胶原酶灌注、低速离心纯化非实质细胞和CD146磁珠选择。我们还使用流式细胞术和扫描电子显微镜对这些分离的LSECs进行表型和表征。

摘要

肝正弦内皮细胞（LSECs）是位于循环和肝实质之间界面的特化内皮细胞。LSECs具有独特的形态，其特征在于存在开窗和没有基底膜。LSECs在肝脏的许多病理性疾病中起着至关重要的作用，包括代谢失调，炎症，纤维化，血管生成和癌变。然而，关于LSEC的分离和表征的出版物很少。在这里，该协议讨论了从健康和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠中分离LSAC。该方案基于小鼠肝脏的胶原酶灌注和磁珠阳性选择非实质细胞以纯化LSECs。本研究通过流式细胞术使用特异性标记物表征LSECs，并通过扫描电子显微镜鉴定特征性表型特征。按照该协议分离的LSECs可用于功能研究，包括粘附和渗透性测定，以及特定目标途径的下游研究。此外，这些LSECs可以合并或单独使用，允许多组学数据生成，包括RNA-seq本体或单细胞，蛋白质组学或磷酸 - 蛋白质组学，以及使用测序（ATAC-seq）进行转座酶可及染色质的测定等。该方案对于研究LSECs与其他肝细胞在健康和疾病中的通讯的研究者非常有用，并允许深入了解LSECs在急性和慢性肝损伤致病机制中的作用。

引言

肝正弦内皮细胞（LSECs）排列在肝窦壁上，是肝脏中最丰富的非实质细胞¹。LSECs与身体其他毛细血管内皮细胞的区别在于存在开窗和缺乏经典的基底膜或隔膜^2，3。因此，LSECs具有独特的表型和结构特征，可增强其通透性和内吞能力，以消除各种循环大分子，包括脂质和脂蛋白。LSECs在实质细胞和非实质细胞（如星状细胞和免疫细胞）之间的串扰中起着关键作用。LSECs通过保持星状细胞和Kupffer细胞处于静止状态来维持肝脏稳态的关键⁴。LSECs通过介导循环白细胞的粘附和经内皮迁移来调节肝免疫细胞群的组成^5，6。在急性和慢性肝损伤⁷ 期间，包括缺血再灌注损伤 （IRI）⁸、非酒精性脂肪性肝炎 （NASH）⁹ 和肝细胞癌 （HCC），LSECs 会发生表型改变，称为毛细血管形成，其特征为防御和基底膜¹⁰ 形成。LSECs 的这些表型变化与 LSECs 功能障碍以及获得血栓前、促炎和促纤维化特性有关。

已经开发了几种从小鼠肝脏中分离LSECs^的方法11。一些技术依赖于分离非实质和实质细胞，然后进行密度梯度离心以从非实质部分纯化LSECs。该方法的局限性在于LSECs分离的最后步骤中存在污染巨噬细胞，这可能会影响分离的LSECs¹²的纯度。该方案基于小鼠肝脏的胶原酶灌注和CD146 ⁺ 磁珠阳性选择非实质细胞以纯化LSECs。使用这种方法分离的LSECs显示出高纯度和保留的形态和活力。这些 LSEC 是功能研究的最佳选择，包括渗透性和粘附测定，以及目标途径的下游研究。此外，随着人们对在临床研究和发现科学中生成大数据集的兴趣日益浓厚，这些从患有非酒精性脂肪性肝炎（NASH）或其他疾病的健康和患病肝脏中分离出来的高质量LSECs可以合并或单独使用，从而可以生成多组学数据并比较健康与疾病^13，14.此外，分离的LSECs可用于开发二维和三维体外模型，如类器官，以破译LSECs中激活的信号通路及其在不同有害刺激下与其他肝细胞的细胞间通讯，并响应各种治疗干预。

方案

动物协议是经梅奥诊所的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的。从杰克逊实验室购买了八周龄的C57BL / 6J雄性小鼠。将小鼠饲养在温度控制的12:12-h明暗循环设施中，并可自由获得饮食。

1.胶原包被培养皿或培养盘的制备

1. 要制成50 mL 0.02 mol/L乙酸，在49.4 mL H₂O中加入0.6 mL冰醋酸。
2. 在0.02摩尔/升乙酸中制作50μg/ mL I型胶原蛋白。稀释取决于批次的浓度。
3. 用3毫升胶原蛋白溶液涂覆10厘米培养皿。在室温（RT）下孵育1小时。
   注意:当使用不同的培养皿或板进行培养时，需要根据培养面积调整包衣溶液的体积，通常使用6-10μg/ cm²。
4. 从涂层表面除去多余的液体，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤3次。让盘子风干。
5. 如果胶原蛋白溶液不是无菌的，通过在无菌组织培养罩中暴露于紫外线（UV）光下对胶原蛋白涂层的培养皿进行灭菌10分钟。

2. 设备设置

1. 设置加热加湿的再循环灌注装置，如图 1B所示。
2. 使用10%漂白剂冲洗灌注系统5分钟，然后用无菌水再冲洗10分钟。
3. 在灌注胶原酶溶液之前，请尽可能多地沥干冲洗液。
4. 通过灌注系统注入胶原酶溶液（如图 1B所示）以在37°C下预热。 将泵速设置为速度 1，如速度控制拨盘上所示（等于 40 mL/min）。
5. 在整个过程中保持此速度不变。在LSEC分离的白天，重复使用在闭合回路中运行的胶原酶溶液。
   注:泵转速固定在 1，以避免可能扰乱 LSECs 生物条件的机械压力。

3. 外科手术

1. 称量鼠标重量。
2. 腹膜注射90毫克/千克体重的氯胺酮和10毫克/千克体重的甲苯噻嗪（IP）。
3. 一旦小鼠对疼痛刺激无反应，将小鼠固定在手术表面上，如图 1B所示。
4. 用70%乙醇喷洒小鼠腹部。使用手术剪刀，从腹部下部开始到xiphoid过程，做一个约5厘米长的切口。
5. 接下来，在腹部两侧使用小虹膜剪刀进行两次横向切口，以完全暴露腹部器官。
6. 将静脉注射（IV）导管的鞘放在动物的背部下方，以抬起并平整腹部。
7. 使用常规的弯曲敷料镊子，轻轻地将肠道和胃拉到动物的左侧。
8. 将5-0手术缝线放在暴露的左肾正下方的下腔静脉（IVC）下。在缝合线中系上松散的挂钩。
9. 在肝门静脉 （PV） 周围放置另一个 5-0 手术缝合线，该缝线正好位于肝 PV 的脾静脉分支点上方。在缝合线中系上松散的挂钩。
10. 使用PV缝合线作为张力，将20G静脉导管插入肝PV下方1厘米处，使其向右和左肝PV分支。
11. 将导管向上滑动静脉，但将其保持在分支区域下方。让血液沿着导管向动，直到它开始滴出。
12. 将一些缓冲液A（表1）放在手术区域上方的静脉注射（IV）瓶中，使用IV线，并将其连接到导管上。用这种溶液冲洗肝脏，同时避免空气进入系统。
13. 将缝合线绑在肾脏下方的下腔静脉周围。这将使肝脏向后灌注。
14. 将IVC切入缝合线下方，让动物流血。
    注意:此步骤必须快速执行，以避免肝脏充血。
15. 用PV缝合线固定静脉导管。
16. 灌注后，切除胃，肠，脾脏和附着在肝脏上的其他内脏。
17. 从胸腔切除隔膜和主要血管。从动物身上取出肝脏并将其放在灌注盘上。
18. 小心地取出静脉输液管线，并将胶原酶溶液连接到再循环室中。
    注意:步骤3.16-3.18需要在5分钟内完成，因此缓冲液A不会灌注肝脏太长时间。
19. 让肝脏灌注，直到胶囊变得斑驳并出现糊状（10-15分钟或更长时间，周期因胶原酶的不同而变化）。
20. 当肝脏灌注时，确保动物已经死亡，然后再将其放入尸检袋中。
21. 消化后，从腔室中取出肝脏并将其置于10厘米的培养皿中，其中含有约20毫升无血清的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）。
22. 用几个移液器吸头轻轻挑开肝脏，丢弃胆道树。
23. 通过70μm细胞过滤器将肝脏悬浮液过滤到50mL锥形管中。
24. 在室温下以50× g 离心细胞悬浮液2分钟，收集含有非实质肝细胞的上清液。
    注意:肝细胞沉淀在沉淀中，其可以使用梯度离心进一步纯化，如前所述¹⁵。

4. 非实质肝细胞的分离和LSECs的纯化

注意:按照制造商的说明，使用免疫磁珠纯化CD146 ⁺ LSECs。

1. 在4°C下以300× g 离心上清液5分钟。
2. 收集细胞沉淀并重悬于1 mL分离缓冲液中（表1），按照制造商的说明使用自动细胞计数器测定细胞数。
3. 在4°C下以300× g 离心细胞悬浮液10分钟，完全吸出上清液。
4. 用每10个⁷ 个总细胞中90μL分离缓冲液重悬沉淀。
5. 每10个⁷ 个细胞中加入10μLCD146磁珠。充分混合并在4°C下孵育15分钟。
6. 洗涤细胞，每10个⁷ 个细胞加入1-2mL分离缓冲液，以300× g 离心10分钟，然后完全吸出上清液。
7. 在500μL分离缓冲液中重悬多达10个⁹ 个细胞（表1）。
   注意:对于更高的细胞数量，请相应地增加缓冲液体积。
8. 准备分离柱，用3 mL分离缓冲液冲洗。
9. 将细胞悬浮液施加到与70μm预分离过滤器堆叠的柱上。
10. 用3 mL分离缓冲液洗涤色谱柱3次。
    注意:洗涤色谱柱时，一旦色谱柱储液槽为空，应立即添加隔离缓冲液。
11. 从分离器中取出色谱柱，并将其放在 15 mL 离心管上。将5 mL分离缓冲液移液到色谱柱上。
12. 要恢复标记的磁珠细胞，请用力将柱塞推入柱中以冲洗出细胞。
13. 在4°C下以300× g 离心5分钟，LSECs准备好进行显微镜检查和下游分析。

5. 液态细胞免疫表型和流式细胞术纯度评估

1. 按照制造商的说明，使用自动电池计数器确定隔离液化EC的电池数量。
2. 将细胞以300× g 离心5分钟，完全吸出上清液。
3. 取1×10⁶ 个细胞/管，用90μL染色缓冲液重悬（表1）。
4. 加入10μL/管小鼠FcR块和1μL活性染料，在4°C下孵育10分钟。
5. 用CD45，CD146和稳定素-2抗体的组合用染色缓冲液在1:50稀释细胞。在4°C下孵育20分钟。
6. 用5mL染色缓冲液洗涤细胞，并以300× g 离心10分钟，然后完全吸出上清液。
7. 用300μL染色缓冲液重悬细胞并通过流式细胞仪。

6. 伦敦经济交流中心培养和考试

1. 将1×10⁶ 个细胞/孔接种在6孔板中，并用由5%胎牛血清（FBS），1%内皮细胞生长补充剂和1%白蛋白溶液组成的内皮细胞生长培养基培养。
2. 通过光学显微镜检查分离的LSECs。以 10 倍放大倍率采集明场图像。

7. LSECs形态学和开窗扫描电镜检查

1. 用胶原蛋白溶液预涂覆细胞培养插入物（3μm孔径）。
2. 在37°C温暖和加湿气氛的24孔板中用内皮细胞生长培养基在插入片段上培养分离的LSECs（120，000个细胞）。让细胞沉降并粘附2小时。
3. 对于细胞固定，在37°C下加入等量的预热特朗普固定剂到细胞培养基中。
4. 孵育10分钟后，用未稀释的特朗普固定剂代替50%稀释的特朗普固定剂。
5. 将细胞固定在特朗普固定剂中2小时，然后在1%四氧化二锇中孵育1小时。
6. 继续进行样品脱水，在临界点干燥装置中干燥，安装，溅射涂层，并使用扫描电子显微镜进行检查。

结果

实验示意图及设备设置:
在该方案中，使用封闭的灌注回路消化小鼠肝脏，然后通过以50× g 低速离心2分钟分离非实质细胞和肝细胞。使用从非实质部分选择的CD146磁珠分离原代LSECs。实验原理图如图 1A所示。套管通过PV放置，而下腔静脉被绑起来以确保胶原酶通过肝脏的单向灌注（图1B）。内部灌注室配有加热和加湿系统，以确保37-40°C的温暖和加湿设备空气。灌注的胶原酶通过封闭系统循环，并且可以在隔离日内重复用于两到三只小鼠，以使分离更具成本效益。

通过流式细胞术评估分离的 LSECs 纯度和表面标志物:
通过使用表征良好的特异性LSEC表面标记CD146和稳定素-2 16^，17，18来评估分离的LSECs的纯度。

讨论

在目前的手稿中，我们描述了一种从小鼠肝脏中分离LSEC的方案，包括两步胶原酶灌注和随后的磁活化细胞分选（MACS）。该方案包括以下三个步骤:（1）用无钙缓冲液灌注PV，然后用含胶原酶的缓冲液实现肝细胞分散;（2）低速离心排除肝细胞;和（3）使用抗CD146磁珠从非实质细胞（NPC）中选择性基于MACS的LSECs阳性选择。整个过程可以在3小时内完成。此外，该程序的成本（包括所有耗材）约为每只鼠标150美元，这表明这种LSEC隔离方法总体上是有效且具有成本效益的。我们使用步骤（1）和（2）来分离原代小鼠肝细胞，这超出了当前手稿的范围。

门静脉插管和肝灌注有几个关键步骤:（i）导管定位:导管尖端应放置在成年小鼠PV分叉的远端不少于3mm处，这通常在肝脏的肺门中识别。导管尖端在PV中的深部放置将损害肝脏某些叶的灌注。肺叶灌注不良表现为肺叶无颜色变化，如果通过导管轻微重新定位到远端 PV 中立即注意到，可以纠正。这种操作可能会优化肺叶灌注。（ii）气泡:泵和PV之间的输液路线应保持完全没有气泡。进入PV的微小空气会引起空气栓塞，从而导致肝脏灌注不完全。为了在取出内针后消除导管中的空气，在将...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.0 英寸 20 G 静脉内 （IV） 导管	Terumo，新泽西州，美国新泽西	SR-OX2051CA
2–3 英寸填充托盘，中心			孔，定制;自制
405/520 活性染料	Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国	130-110-205
4 英寸规则弯曲的敷料钳	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand 丝绸缝合线	Ethicon，美国新泽西州拉里坦	A182H
抗稳定素-2（小鼠）mAb-Alexa Fluor&488	MBL International，美国马萨诸塞州沃本	D317-A48
BSA 原液	Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国	130-091-376
抗 CD146 （LSEC）-PE，抗小鼠	Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国	130-118-407
CD146 （LSEC） 微珠，小鼠	Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国	130-092-007
抗 CD45-Viogreen，抗小鼠	Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国	130-110-803
I 型胶原蛋白	Corning，美国纽约州	354236
胶原蛋白酶 II	Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	17101-015
内皮细胞生长培养基	ScienCell Research Laboratories，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德	211-500
FcR 封闭试剂，小鼠	Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国	130-092-575
FlowJo 软件，版本 10.6	Becton， Dickinson and Company
硬化精细剪刀	F.S.T， Foster city， CA， USA	14091-11
加热 （37 °C） 和加湿再循环灌注器，配备 10psi 的氧气注射。			定制;自制
Hitachi S 4700 扫描电子显微镜	Hitachi Inc， Pleasanton， CA， USA	SEM096
LS 色谱柱	Miltenyi， Bergisch Gladbach， Germany	130-042-401
MACS 预分离过滤器（70 &μ;m）	Miltenyi， Bergisch Gladbach， 德国	130-095-823
MACS 冲洗缓冲液	Miltenyi， Bergisch Gladbach， 德国	130-091-222
MACS 智能过滤器 （70 μm）	Miltenyi，德国 Bergisch Gladbach	130-098-462
MACSQunt 流式细胞仪	Miltenyi，德国 Bergisch Gladbach Millicell
细胞培养插入物	Millipore Sigma，美国马萨诸塞州伯灵顿	PITP01250
Nexcelom 细胞计数器	Nexcelom bioscience，美国马萨诸塞州劳伦斯	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare，美国伊利诺伊州芝加哥	17-0891-01
手术剪刀	FST，美国加利福尼亚州福斯特市	14001-12
非常小的弧形敷料钳	FST，美国加利福尼亚州福斯特市	11063-07