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方法文章

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

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DOI：

10.3791/63062

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2021年12月16日

 ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology & Hepatology, Mayo Clinic, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Mayo Clinic

本文内容

摘要

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。

摘要

肝窦内皮细胞（LSECs）是一类特殊的内皮细胞，位于血液循环与肝实质之间的界面。LSECs具有独特的形态特征，表现为存在窗孔结构且缺乏基底膜。LSECs在多种肝脏病理过程中发挥关键作用，包括代谢紊乱、炎症、纤维化、血管生成以及癌变。然而，关于LSECs的分离与鉴定方法，目前公开发表的研究仍较为有限。本文介绍了一种从健康小鼠及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠中分离LSECs的实验方案。该方案基于胶原酶灌注小鼠肝脏，并利用磁珠阳性筛选非实质细胞以纯化LSECs。本研究通过流式细胞术检测特异性标记物，并结合扫描电子显微镜观察其典型的表型特征，对分离所得LSECs进行鉴定。按照本方案分离的LSECs可用于功能研究，如细胞黏附和通透性检测，也可用于特定信号通路的下游分析。此外，这些LSECs可合并使用或单独使用，适用于多种组学数据的生成，包括RNA-seq（批量或单细胞）、蛋白质组学或磷酸化蛋白质组学，以及利用测序技术检测转座酶可及染色质（ATAC-seq）等。本方案将有助于研究者深入探究LSECs在生理和病理状态下与其他肝细胞之间的相互作用，并加深对LSECs在急性和慢性肝损伤致病机制中作用的理解。

引言

肝窦内皮细胞（LSECs）排列在肝窦壁上，是肝脏中最丰富的非实质细胞1。与其他部位的毛细血管内皮细胞相比，LSECs 的特征在于其具有窗孔结构，并且缺乏典型的基底膜或隔膜2,3。因此，LSECs 具有独特的表型和结构特征，可增强其通透性和内吞能力，从而清除多种循环大分子物质，包括脂质和脂蛋白。LSECs 在实质细胞与非实质细胞（如星状细胞和免疫细胞）之间的相互作用中发挥关键作用。LSECs 通过维持星状细胞和库普弗细胞处于静息状态，在维持肝脏稳态中起重要作用4。LSECs 还通过介导循环白细胞的黏附和跨内皮迁移，调节肝脏免疫细胞群体的组成5,6。在急性和慢性肝损伤7过程中，包括缺血-再灌注损伤（IRI）8、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）9以及肝细胞癌（HCC），LSECs 会发生称为毛细血管化的表型改变，其特征是窗孔消失和基底膜形成10。这些 LSECs 的表型变化与细胞功能障碍相关，并获得促血栓形成、促炎和促纤维化特性。

已开发出多种从小鼠肝脏中分离肝窦内皮细胞（LSECs）的方法11。一些技术依赖于将非实质细胞与实质细胞分离，随后通过密度梯度离心从非实质细胞组分中纯化LSECs。该方法的局限性在于LSECs分离的最后步骤中可能存在污染性巨噬细胞，从而影响所分离LSECs的纯度12。本实验方案基于胶原酶灌注小鼠肝脏，并利用CD146+磁珠对非实质细胞进行阳性筛选以纯化LSECs。采用该方法分离的LSECs具有高纯度，并保持良好的形态和活力。这些LSECs适用于多种功能研究，包括通透性实验和黏附实验，也适用于对特定信号通路的下游分析。此外，随着临床研究和发现科学中生成大规模数据集的需求日益增长，这些高质量的LSECs（可来源于健康肝脏或患有非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其他疾病的肝脏）可单独使用或混合使用，从而实现多组学数据的生成，并进行健康与疾病状态之间的比较13,14。此外，分离得到的LSECs还可用于构建二维及三维体外模型（如类器官），以解析在不同有害刺激条件下以及在各种治疗干预下LSECs中被激活的信号通路及其与其他肝细胞之间的细胞间通讯机制。

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方案

动物实验方案经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后实施。八周龄雄性C57BL/6J小鼠购自杰克逊实验室。小鼠饲养于温度可控、12小时光照与12小时黑暗循环的设施中，并可自由进食。

1. 胶原包被培养皿或培养板的制备

  1. 配制 50 mL 浓度为 0.02 mol/L 的乙酸溶液：将 0.6 mL 冰乙酸加入 49.4 mL 的 H2O 中。
  2. 用 0.02 mol/L 乙酸溶液配制浓度为 50 µg/mL 的 I 型胶原蛋白溶液。稀释倍数需根据批次浓度进行调整。
  3. 用 3 mL 胶原蛋白溶液包被 10 cm 培养皿，室温（RT）孵育 1 小时。
    注意：若使用其他规格的培养皿或培养板，需根据培养面积调整包被液体积，通常使用 6–10 µg/cm2。
  4. 去除包被表面多余的液体，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 3 次，然后让培养皿自然风干。
  5. 若胶原蛋白溶液未经过灭菌处理，需将包被后的培养皿置于无菌细胞培养操作台内，用紫外线（UV）照射 10 分钟进行灭菌。

2. 仪器设备设置

  1. 按照图1B所示设置加热加湿的循环灌注装置。
  2. 先用10%次氯酸钠溶液冲洗灌注系统5分钟，再用无菌水冲洗10分钟。
  3. 在灌注胶原酶溶液前，尽可能排干冲洗液。
  4. 将胶原酶溶液通过灌注系统（如图1B所示）进行循环，以在37 °C预热。将泵速设定为速度控制旋钮上的1档（相当于40 mL/min）。
  5. 在整个操作过程中保持该流速不变。在肝窦内皮细胞（LSEC）分离当天，可将胶原酶溶液在闭路循环中重复使用。
    ​注意：泵速固定为1，以避免机械压力对LSECs生物学状态造成干扰。

3. 手术操作

  1. 称量小鼠体重。
  2. 按每公斤体重90 mg的剂量腹腔注射（IP）氯胺酮，同时按每公斤体重10 mg的剂量注射赛拉嗪。
  3. 当小鼠对疼痛刺激无反应时，将小鼠固定在手术台面上，如图1B所示。
  4. 用70%乙醇喷洒小鼠腹部。使用手术剪从腹部下端开始向上至剑突处做一条长约~5 cm的切口。
  5. 接着，使用小型虹膜剪在腹部两侧各做两个横向切口，以充分暴露腹腔器官。
  6. 将静脉（IV）导管的鞘管置于动物背部下方，以抬高并平整腹部。
  7. 使用常规弯头敷料钳，轻轻地将肠管和胃向动物左侧拨开。
  8. 在暴露的左肾下方的下腔静脉（IVC）下方放置一根5-0外科缝线，并在线上打一个松结。
  9. 在脾静脉分叉处上方的门静脉（PV）周围放置另一根5-0外科缝线，并在线上打一个松结。
  10. 利用PV处的缝线施加张力，将20 G静脉导管插入肝门静脉，位置在门静脉分叉为左右肝门静脉下方约1 cm处。
  11. 将导管沿静脉向上推进，但保持在分叉区域下方。让血液沿导管流下，直至开始滴出。
  12. 将装有缓冲液A（表1）的静脉输液瓶置于手术区域上方，通过输液管连接导管，用该溶液冲洗肝脏，同时避免空气进入系统。
  13. 结扎肾脏下方的下腔静脉周围的缝线。这将使肝脏进行逆行灌注。
  14. 在缝线下方剪断下腔静脉，使动物排空血液。
    注意：此步骤必须迅速完成，以避免肝脏充血。
  15. 用PV处的缝线固定静脉导管。
  16. 开始灌注后，切除与肝脏相连的胃、肠、脾及其他内脏组织。
  17. 切除膈肌及胸腔内的主要血管，取出肝脏并将其放置在灌注托盘上。
  18. 小心移除静脉输液管，并连接循环腔中的胶原酶溶液。
    注意： 步骤3.16–3.18需在5分钟内完成，以免肝脏被缓冲液A灌注过久。操作时务必小心，避免任何气泡进入肝脏。
  19. 继续灌注肝脏，直至肝脏包膜呈现斑驳状且质地变软（10–15分钟或更长， 时间长短取决于不同批次的胶原酶活性）。
  20. 在肝脏灌注过程中，确保动物已死亡，方可将其放入尸检袋中处理。
  21. 消化完成后，将肝脏从灌注腔中取出，放入一个直径10 cm的培养皿中，加入约20 mL无血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
  22. 用几根移液器吸头轻轻撕开肝脏组织，并弃去胆管结构。
  23. 将肝脏悬液通过70 µm细胞筛过滤至一个50 mL锥形管中。
  24. 在室温下以50 × g离心2分钟，收集含有非实质肝细胞的上清液。
    ​注意：肝实质细胞会沉淀于沉淀物中，可通过梯度离心进一步纯化，方法如前所述15。

4. 非实质肝细胞的分离与肝窦内皮细胞（LSECs）的纯化

注意：按照制造商的说明，使用免疫磁珠纯化 CD146+ 肝窦内皮细胞（LSECs）。

  1. 在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心上清液 5 分钟。
  2. 收集细胞沉淀，并用 1 mL 分离缓冲液（表 1）重悬，按照制造商说明使用自动细胞计数仪测定细胞数量。
  3. 在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心细胞悬液 10 分钟，彻底吸弃上清液。
  4. 每 107 个总细胞用 90 µL 分离缓冲液重悬沉淀。
  5. 每 107 个总细胞加入 10 µL CD146 磁珠，充分混匀并在 4 °C 下孵育 15 分钟。
  6. 为洗涤细胞，每 107 个细胞加入 1–2 mL 分离缓冲液，以 300 x g 离心 10 分钟，然后彻底吸弃上清液。
  7. 将最多 109 个细胞重悬于 500 µL 分离缓冲液（表 1）中。
    注意：若细胞数量更高，应相应增加缓冲液体积。
  8. 准备分离柱，用 3 mL 分离缓冲液冲洗分离柱。
  9. 将细胞悬液加载至装有 70 µm 预分离滤器的分离柱上。
  10. 用 3 mL 分离缓冲液洗涤分离柱 3 次。
    注意：洗涤分离柱时，应在柱储液腔排空后立即加入分离缓冲液。
  11. 将分离柱从分离装置上取下，置于 15 mL 离心管上，用移液器向柱中加入 5 mL 分离缓冲液。
  12. 为回收磁珠标记的细胞，用力将推杆插入柱中以冲洗出细胞。
  13. 在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心 5 分钟。肝窦内皮细胞（LSECs）即可用于显微镜检查和后续分析。

5. 利用流式细胞术对肝窦内皮细胞进行免疫表型分析及纯度评估

  1. 按照制造商说明，使用自动细胞计数仪测定分离得到的肝窦内皮细胞（LSECs）的细胞数量。
  2. 以 300 x g 离心 5 分钟，彻底吸除上清液。
  3. 取 1 x 106 个细胞/管，用 90 µL 染色缓冲液（表 1）重悬。
  4. 每管加入 10 µL 小鼠 FcR 封闭剂和 1 µL 活性染料，于 4 °C 孵育 10 分钟。
  5. 使用染色缓冲液按 1:50 稀释的 CD45、CD146 和 stabilin-2 抗体组合对细胞进行染色，于 4 °C 孵育 20 分钟。
  6. 用 5 mL 染色缓冲液洗涤细胞，以 300 x g 离心 10 分钟，然后彻底吸除上清液。
  7. 用 300 µL 染色缓冲液重悬细胞，并上流式细胞仪检测。

6. 肝窦内皮细胞（LSECs）的培养与检测

  1. 在6孔板中每孔接种1 × 106个细胞，并使用含有5%胎牛血清（FBS）、1%内皮细胞生长补充剂和1%普列霉素溶液的内皮细胞生长培养基进行培养。
  2. 通过光学显微镜观察分离得到的肝窦内皮细胞（LSECs），并以10倍放大倍数获取明场图像。

7. 利用扫描电子显微镜观察肝窦内皮细胞的形态及窗孔结构

  1. 用胶原蛋白溶液预包被细胞培养小室（3 µm 孔径）。
  2. 将分离的肝窦内皮细胞（LSECs，120,000 个细胞）接种于插入式培养小室中，置于 24 孔板内，加入内皮细胞生长培养基，在 37 °C、湿润的培养箱中培养。静置孵育 2 小时，使细胞沉降并贴壁。
  3. 细胞固定时，向细胞培养基中加入等体积、预热至 37 °C 的 Trump 固定液。
  4. 孵育 10 分钟后，将 50% 稀释的 Trump 固定液更换为未稀释的 Trump 固定液。
  5. 在 Trump 固定液中固定细胞 2 小时，随后在 1% 四氧化锇溶液中孵育 1 小时。
  6. 随后进行样品脱水、临界点干燥仪干燥、制样、溅射镀膜，并使用扫描电子显微镜进行观察。

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结果

实验示意图与设备设置：
在本实验方案中，采用封闭式灌注回路消化小鼠肝脏，随后通过低速离心（50 × g，2 分钟）分离非实质细胞与肝细胞。从非实质细胞组分中，使用 CD146 磁珠分选法分离原代肝窦内皮细胞（LSECs）。实验流程示意图见图 1A。将套管插入门静脉（PV），同时结扎下腔静脉，以确保胶原酶单向流经肝脏（图 1B）。自制灌注腔室配备加热与加湿系统，以维持装置周围空气温度在 37–40 °C，并保持湿润环境。灌注所用胶原酶在封闭系统中循环，可在同一天内重复用于两到三只小鼠，从而提高分离过程的成本效益。

通过流式细胞术评估分离的肝窦内皮细胞纯度及表面标志物：
采用已明确表征的特异性肝窦内皮细胞（LSEC）表面标志物 CD146 和 stabilin-216,

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讨论

在本论文中，我们描述了一种从小鼠肝脏分离肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案，该方案包括两步胶原酶灌注及随后的磁珠激活细胞分选（MACS）。该方案包含以下三个步骤：（1）先通过门静脉（PV）灌注无钙缓冲液，随后灌注含胶原酶的缓冲液，以实现肝细胞的分散；（2）通过低速离心去除肝实质细胞（即肝细胞）；（3）利用抗CD146磁珠对非实质细胞（NPCs）进行基于MACS的LSEC阳性筛选。整个操作过程可在3小时内完成。此外，包括所有耗材在内的单只小鼠实验成本约为150美元，表明该LSEC分离方法整体上高效且经济。我们同样使用步骤（1）和（2）来分离原代小鼠肝细胞，但该应用不在本论文的讨论范围之内。

门静脉插管和肝脏灌注中有几个关键步骤：（i） 导管定位：导管尖端应置于成年小鼠门静脉（PV）分叉远端至少3 mm处，该位置通常可在肝脏门部识别。若导管尖端插入门静脉过深，将影响部分肝叶的灌注。灌注不良的肝叶表现为无颜色变化，若能及时发现，可通过将导管轻微调整至门静脉更远端来纠正，此操作可能优化肝叶灌注。（ii）气泡：泵与门静脉之间的输注通路必须完全排除气泡。微量空气进入门静脉可导致空气栓...

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披露

所有作者均无利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）糖尿病与消化及肾脏疾病研究所（1RO1DK122948，授予SHI）以及NIH Silvio O. Conte 消化系统疾病研究中心核心项目P30资助机制（DK084567）提供支持。KF还获得了日本促进科学学会（JSPS）海外研究奖学金的支持。我们还要感谢Gregory J. Gores博士和Steven Bronk在胶原酶灌注装置的初始设计与优化方面所做的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2.0英寸 20 G 静脉（IV）导管Terumo，美国新泽西州索默塞特SR-OX2051CA
2–3英寸带中心孔的灌注盘定制；实验室自制
405/520 活性染料Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-110-205
4英寸普通弯型敷料镊Fisher BrandFS16-100-110
5-0 Perma-Hand 丝线缝合线Ethicon，美国新泽西州拉里坦A182H
抗-stabilin-2（小鼠）mAb-Alexa Fluorà 488MBL International，美国马萨诸塞州伍本D317-A48
BSA 储存液Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-091-376
抗-CD146（LSEC）-PE，抗小鼠Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-118-407
CD146（LSEC）MicroBeads，小鼠Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-092-007
抗-CD45-Viogreen，抗小鼠Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-110-803
I型胶原蛋白Corning，美国纽约州康宁354236
II型胶原酶Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆17101-015
内皮细胞生长培养基ScienCell 研究实验室，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德211-500
FcR 封闭试剂，小鼠Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-092-575
FlowJo 软件，版本 10.6Becton, Dickinson and Company
硬化精细剪刀F.S.T，美国加利福尼亚州福斯特城14091-11
加热（37 °C）加湿循环灌注装置，配备氧气注入系统，压力为 10 psi定制；实验室自制
日立 S 4700 扫描电子显微镜日立公司，美国加利福尼亚州普莱森顿SEM096
LS 柱Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-042-401
MACS 预分离滤器（70 μm）Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-095-823
MACS 洗涤缓冲液Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-091-222
MACS Smart Strainer（70 μm）Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-098-462
MACSQuant 流式细胞仪Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫
Millicell 细胞培养小室Millipore Sigma，美国马萨诸塞州伯灵顿PITP01250
Nexcelom 细胞计数仪Nexcelom Bioscience，美国马萨诸塞州劳伦斯Cellometer Auto T4 Plus
PercollGE Healthcare，美国伊利诺伊州芝加哥17-0891-01
手术剪刀F.S.T，美国加利福尼亚州福斯特城14001-12
极小弯型敷料镊F.S.T，美国加利福尼亚州福斯特城11063-07

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