本方案通过与光学显微镜和免疫细胞化学染色法进行比较，展示了使用结晶紫可视化病毒滴定的准确且客观的方法。
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摘要
摘要
病毒滴定是病毒学研究中的关键检测方法。细胞病变效应（CPE）的检测 通过 TCID50 检测和噬斑形成单位（PFU）检测是测定病毒储备液滴度的两种主要方法，通常依赖显微镜观察或细胞染色以实现可视化。在 TCID50 检测中，客观的可视化通常基于对细胞内病毒进行免疫细胞化学（ICC）染色以计算滴度，并结合细胞病变效应（CPE）的视觉观察。 通过 显微镜观察。然而，免疫细胞化学染色成本较高且耗时。在本研究中，我们比较了直接观察细胞病变效应（CPE）的视觉方法 通过 显微镜观察、免疫细胞化学染色和结晶紫染色用于测定两种致细胞病变效应（CPE）病毒——猪源性甲型流感病毒（IAV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的滴度。我们发现，结晶紫染色和免疫细胞化学染色均比肉眼观察CPE更为准确，对IAV和PRRSV的测定精度几乎相同。因此，本文提出结晶紫染色法是一种更快且更经济的方法，可用于在细胞系中对产生CPE的病毒进行TCID50测定以确定病毒滴度。
引言
病毒滴定 通过 TCID50 检测是传染病研究中常用的技术1尽管随着时间的推移，该方法背后的数学原理已有多种变体被提出1,2,3,4目前应用的感染检测方法依赖于显微镜下观察细胞病变效应（CPE）的存在来进行视觉确认5为了在TCID50测定中更客观地确认细胞病变效应（CPE）的可视化，针对病毒蛋白进行免疫细胞化学（ICC）胞内染色是最常用的方法之一。6 因为不同病毒可产生不同形式的细胞病变效应（CPE）。在我们的实验中，甲型流感病毒（IAV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染后引起的细胞形态学变化相似，均表现为感染细胞变圆并从培养板上脱落。对于PRRSV而言，其引起的CPE被称为 "完全破坏"，所有细胞最终都会从孔壁脱落。而甲型流感病毒（IAV）则可能同时表现出完全破坏以及另一种称为细胞病变效应（CPE）的现象 "部分破坏" 其中少量细胞在感染后未脱落7然而，该技术操作耗时，且需要使用相对昂贵的试剂。需要注意的是，免疫细胞化学法（IC....
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方案
1. 滴定实验方案
注意：使用可感染贴壁细胞的致细胞病变病毒。本实验示范中采用的是猪源甲型流感病毒（A/California/07/2009/(H1N1)）和2型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）NC 1-7-4株。
- 在生物安全二级（BSL-2）实验室的生物安全柜中，于96孔板中对这些病毒进行为期7天的滴定。
- 进行滴定前，将所需细胞系接种至96孔板中。对于PRRSV，使用MA-104细胞系；对于IAV，使用MDCK细胞系。细胞培养时使用含10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的DMEM培养基，并将细胞培养至完全汇合。
- 感染前，用200 µL PBS洗涤细胞。
- 通过将900 µL培养基与100 µL病毒混合，进行10倍系列稀释来稀释病毒储备液。确保充分涡旋混匀，以保证培养基与病毒充分混合，避免稀释误差。
- 在盖子上标记板子的布局。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤孔板。按照先前描述的滴定方法2,3，在相应孔中加入50 µL接种物。
- 在37 °C、5% CO2培养箱中孵育7天。
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结果
用于数学计算滴度的方程式此前已有描述2,3.
简而言之，对于PRRSV，我们采用卡伯法：
滴度（TCID50）= 10 T + 1.3，其中：
在此公式中，d = 完全阳性病毒反应的最高稀释度的负对数值：五个阳性重复孔；r = 稀释梯度的对数值；N = 每个稀释度的重复孔数；n = 下一稀释度中呈现阳性病毒反应的孔数。
对于 IAV，我们使用 Muench.......
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讨论
病毒滴定在病毒学研究中被常规使用，其中噬斑形成单位（PFU）检测和半数组织培养感染剂量（TCID50）测定最为常用1,2,3,4两种方法均依赖于检测感染细胞中的细胞病变效应（CPE），尽管可通过肉眼观察进行评估 通过 显微镜检查通常需要应用染色方法，以获得更客观的结果，甚至缩短孵育时间。对于TCID50而言，免疫细胞化学（ICC）染色是一种最常用的替代肉眼观察细胞病变效应（CPE）的方法，可提供准确且客观的检测结果。6，由于使用特异性抗体，这一过程耗时且通常成本较高9,10然而，尽管此类检测也可通过结晶紫染色进行可视化观察而获益，但目前尚无比较研究评估免疫细胞化学法（ICC）与结晶紫染色在灵敏度方面的差.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Frank Scholle 博士对本文手稿提出的有益意见，感谢 Chloe Mariant 在显微镜图像方面的帮助，以及感谢 Teresa M. Tiedge 在英文语言修改方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔细胞培养板 | Genesee | 25-221 | 透明，平底 |
| AEC溶液 | Thermo Fisher | 1122 | |
| 结晶紫 | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| 胎牛血清 | BioWest | S1480 | |
| 多聚甲醛 | Thermo Fisher | J19943 | |
| 甲型流感病毒一抗 | Bioss | BS-0344R | |
| PRRSV一抗 | Bioss | BS-10043R | |
| 皂苷 | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| 二抗 | Invitrogen | 31460 | |
| 盐酸三羟甲基氨基甲烷 | Thermo Scientific | AM9856 |
参考文献
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A.
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