本方案通过与光学显微镜和免疫细胞化学染色法进行比较，展示了使用结晶紫可视化病毒滴定的准确且客观的方法。
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摘要
摘要
病毒滴定是病毒学研究中的关键检测方法。细胞病变效应（CPE）的检测 通过 TCID50 检测和噬斑形成单位（PFU）检测是测定病毒储备液滴度的两种主要方法，通常依赖显微镜观察或细胞染色以实现可视化。在 TCID50 检测中，客观的可视化通常基于对细胞内病毒进行免疫细胞化学（ICC）染色以计算滴度，并结合细胞病变效应（CPE）的视觉观察。 通过 显微镜观察。然而，免疫细胞化学染色成本较高且耗时。在本研究中，我们比较了直接观察细胞病变效应（CPE）的视觉方法 通过 显微镜观察、免疫细胞化学染色和结晶紫染色用于测定两种致细胞病变效应（CPE）病毒——猪源性甲型流感病毒（IAV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的滴度。我们发现，结晶紫染色和免疫细胞化学染色均比肉眼观察CPE更为准确，对IAV和PRRSV的测定精度几乎相同。因此，本文提出结晶紫染色法是一种更快且更经济的方法，可用于在细胞系中对产生CPE的病毒进行TCID50测定以确定病毒滴度。
引言
病毒滴定 通过 TCID50 检测是传染病研究中常用的技术1尽管随着时间的推移，该方法背后的数学原理已有多种变体被提出1,2,3,4目前应用的感染检测方法依赖于显微镜下观察细胞病变效应（CPE）的存在来进行视觉确认5为了在TCID50测定中更客观地确认细胞病变效应（CPE）的可视化，针对病毒蛋白进行免疫细胞化学（ICC）胞内染色是最常用的方法之一。6 因为不同病毒可产生不同形式的细胞病变效应（CPE）。在我们的实验中，甲型流感病毒（IAV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染后引起的细胞形态学变化相似，均表现为感染细胞变圆并从培养板上脱落。对于PRRSV而言，其引起的CPE被称为 "完全破坏"，所有细胞最终都会从孔壁脱落。而甲型流感病毒（IAV）则可能同时表现出完全破坏以及另一种称为细胞病变效应（CPE）的现象 "部分破坏" 其中少量细胞在感染后未脱落7然而，该技术操作耗时，且需要使用相对昂贵的试剂。需要注意的是，免疫细胞化学法（ICC）并非直接标记细胞病变效应（CPE），而是标记成功被病毒感染的细胞数量。这意味着，即使感染尚未引发CPE，只要在孵育结束时细胞已被成功感染，就会被判定为阳性，因此ICC检测出的阳性细胞比例通常高于CPE观察结果。基于此，本研究描述了一种在TCID50实验中通过结晶紫染色对CPE进行可视化检测的补充方法。结晶紫是一种带正电荷的化学物质，可结合细胞膜，常用于染色贴壁细胞。在病毒学研究中，结晶紫常被用于测定噬斑形成单位等指标。8.
本研究比较了未染色显微镜观察细胞病变效应（CPE）检测与结晶紫染色及基于病毒蛋白识别的免疫细胞化学染色的敏感性，其中后者因具有较高敏感性而被认为更为客观。研究结果表明，结晶紫染色和免疫细胞化学染色均比基于显微镜观察的CPE检测更为准确，可用于在TCID50滴定实验中客观识别感染孔。鉴于这两种方法在测试的引起细胞病变效应的病毒和细胞系中能达到几乎相同的准确度，本文提出结晶紫染色是一种更快且更经济的TCID50病毒滴定测定方法。所建议的结晶紫染色方法总耗时为40分钟，包括15分钟多聚甲醛（PFA）孵育、5分钟结晶紫染色，以及最多15分钟的材料准备、缓冲液洗涤和干燥。作为对照比较所采用的免疫细胞化学染色方案平均耗时4小时30分钟，其操作步骤参照先前文献所述9,10。本文提出的方法旨在帮助清晰呈现完整的病毒滴定结果。感染和孵育时间可根据不同病毒采用不同的实验设计。本研究测试了两种在细胞系中可引起细胞病变效应的RNA病毒。
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方案
1. 滴定实验方案
注意：使用可感染贴壁细胞的致细胞病变病毒。本实验示范中采用的是猪源甲型流感病毒（A/California/07/2009/(H1N1)）和2型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）NC 1-7-4株。
- 在生物安全二级（BSL-2）实验室的生物安全柜中，于96孔板中对这些病毒进行为期7天的滴定。
- 进行滴定前，将所需细胞系接种至96孔板中。对于PRRSV，使用MA-104细胞系；对于IAV，使用MDCK细胞系。细胞培养时使用含10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的DMEM培养基，并将细胞培养至完全汇合。
- 感染前，用200 µL PBS洗涤细胞。
- 通过将900 µL培养基与100 µL病毒混合，进行10倍系列稀释来稀释病毒储备液。确保充分涡旋混匀，以保证培养基与病毒充分混合，避免稀释误差。
- 在盖子上标记板子的布局。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤孔板。按照先前描述的滴定方法2,3，在相应孔中加入50 µL接种物。
- 在37 °C、5% CO2培养箱中孵育7天。
2. 细胞病变效应（CPE）评估 通过 显微镜技术
- 7天培养后，用200 µL的1x PBS洗涤所有孔，重复两次。
- 在光学显微镜下观察板上所有孔，以肉眼检测细胞病变效应（CPE）。对于PRRSV和IAV，其CPE表现为细胞死亡并随后从培养板上脱落，导致单层细胞结构破坏。然而，其他病毒可能表现出不同类型的CPE。
3. 染色方案
注意：细胞病变效应（CPE）被评估 通过 结晶紫染色
- 7天孵育后，用200 µL的1×PBS洗涤所有孔，重复两次。
- 每孔加入50 µL含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS固定细胞，在室温（RT）孵育15分钟。
- 孵育结束后，用200 µL的1×PBS洗涤细胞两次。然后每孔加入50 µL用蒸馏水稀释至4%的结晶紫溶液，在室温孵育5分钟。
注意：结晶紫可对固定时仍贴附在培养板上的细胞进行染色，而细胞脱落区域则保持无色。 - 最后，吸除各孔中的结晶紫染液，可选择将培养板在室温下静置空气干燥2–5分钟，或用200 µL蒸馏水洗涤以去除多余染料，再进行观察。
- 采用先前描述的方法通过数学计算确定滴度。本研究中分别使用Karber公式和Muench公式计算PRRSV和IAV的滴度2,3。这些公式的具体细节见代表性结果部分。
4. 免疫细胞化学（ICC）标记
注意：两种病毒的免疫细胞化学标记均按照先前描述的方法进行9,10,11。
- 在滴定孵育7天后，按照步骤3.2所述使用PFA固定细胞。
- 用由 100 mL 1 M Tris 盐酸盐、1 g 皂苷和 8.5 g NaCl 溶于 900 mL H₂O 中配制的溶液洗涤平板2然后，用1×PBS与5%胎牛血清（FBS）的混合液再洗涤两次，室温（RT）下用Tris-皂苷-NaCl溶液孵育20分钟。
- 室温下用一抗孵育所有孔，孵育时间为2小时。
注意：每种病毒的一抗体积为 100 µL，使用含 2% FBS 的 1x PBS 按 1:300 比例稀释制备。 - 用第4.2步配制的Tris、皂苷和NaCl溶液洗涤细胞两次。
- 室温下用二抗孵育所有孔，孵育时间为1小时。
注意：二抗体积为 100 µL，用含 2% FBS 的 1x PBS 以 1:250 的比例稀释制备。 - 用 Tris、皂苷和 NaCl 稀释液按照步骤 4.2 中所述洗涤细胞。
- 吸弃前一步的稀释液，按照生产商说明，每孔加入200 µL以1:50比例用水稀释的氨基乙基咔唑（AEC）溶液，在室温下孵育30分钟。
- 孵育后，弃去AEC溶液，每孔加入100 µL的1x PBS用于成像 通过 显微镜技术
- 按照步骤 3.5 中所述，通过数学方法推导滴度。
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结果
用于数学计算滴度的方程式此前已有描述2,3.
简而言之，对于PRRSV，我们采用卡伯法：
滴度（TCID50）= 10 T + 1.3，其中：
在此公式中，d = 完全阳性病毒反应的最高稀释度的负对数值：五个阳性重复孔；r = 稀释梯度的对数值；N = 每个稀释度的重复孔数；n = 下一稀释度中呈现阳性病毒反应的孔数。
对于 IAV，我们使用 Muench...
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讨论
病毒滴定在病毒学研究中被常规使用，其中噬斑形成单位（PFU）检测和半数组织培养感染剂量（TCID50）测定最为常用1,2,3,4两种方法均依赖于检测感染细胞中的细胞病变效应（CPE），尽管可通过肉眼观察进行评估 通过 显微镜检查通常需要应用染色方法，以获得更客观的结果，甚至缩短孵育时间。对于TCID50而言，免疫细胞化学（ICC）染色是一种最常用的替代肉眼观察细胞病变效应（CPE）的方法，可提供准确且客观的检测结果。6，由于使用特异性抗体，这一过程耗时且通常成本较高9,10然而，尽管此类检测也可通过结晶紫染色进行可视化观察而获益，但目前尚无比较研究评估免疫细胞化学法（ICC）与结晶紫染色在灵敏度方面的差...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Frank Scholle 博士对本文手稿提出的有益意见，感谢 Chloe Mariant 在显微镜图像方面的帮助，以及感谢 Teresa M. Tiedge 在英文语言修改方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔细胞培养板 | Genesee | 25-221 | 透明，平底 |
| AEC溶液 | Thermo Fisher | 1122 | |
| 结晶紫 | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| 胎牛血清 | BioWest | S1480 | |
| 多聚甲醛 | Thermo Fisher | J19943 | |
| 甲型流感病毒一抗 | Bioss | BS-0344R | |
| PRRSV一抗 | Bioss | BS-10043R | |
| 皂苷 | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| 二抗 | Invitrogen | 31460 | |
| 盐酸三羟甲基氨基甲烷 | Thermo Scientific | AM9856 |
参考文献
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重印与许可
