一种无标记异种移植模型用于研究人类干细胞球体在鸡胚胎中的行为

摘要

本文介绍了一种将人源细胞球体移植并鉴定于鸡胚中的方法。该异种移植模型利用胚胎微环境作为诱导性信号的来源，用于检测细胞迁移、分化及趋向性，特别适用于研究原代和/或异质性细胞群体。

摘要

异种移植是研究人类细胞在活体（in vivo）条件下行为的重要方法。特别是胚胎环境可为细胞迁移、分化和形态发生提供独特的诱导信号和胚层特性，而这些信号和特性在成体异种移植模型中往往缺失。此外，胚胎模型无法区分自身与非自身组织，从而避免了移植物被排斥的风险，也无需对宿主进行免疫抑制。本文介绍了一种将人类细胞球体移植到鸡胚中的方法，鸡胚具有易获取、易于操作且在37 °C下发育的优点。

类球体技术可用于选择胚胎的特定区域进行移植。移植后，细胞会整合到宿主组织中，从而能够追踪其迁移、生长和分化过程。该模型具有足够的灵活性，可利用多种贴壁细胞群体，包括异质性的原代细胞群体和癌细胞。为避免预先标记细胞的需要，本文还描述了一种通过人源特异性Alu探针杂交来鉴定供体细胞的方案，这在研究异质性细胞群体时尤为重要。此外，DNA探针可轻松调整以鉴定其他供体物种。本实验方案将详细介绍类球体的制备、移植至鸡胚、组织固定与石蜡切片处理，以及最终通过DNA原位杂交鉴定人源细胞的一般方法。此外，还将讨论建议的对照设置、结果解读示例、可检测的多种细胞行为，以及该方法的局限性。

引言

异种移植是研究人类细胞在活体（in vivo）条件下行为的有效工具。这些模型为广泛的研究领域提供了宝贵的信息，例如人类干细胞生物学¹、细胞事件的实时观察²，以及肿瘤血管生成和转移的研究³。此外，癌症生物学的多个方面，包括患者特异性异种移植瘤的致瘤性，也已得到研究^4,5。每种异种移植模型都有其优缺点，因此适用于回答特定的科学问题。鸡胚是一种常用的发育生物学模型，因其作为易于获取的羊膜动物模型，适合进行手术操作。异源移植使研究人员能够构建精确的细胞命运图谱⁶，或探究某一特性是由细胞自主决定还是受环境诱导^7,8。基于类似的原理，鸡胚也可用作异种移植模型，以研究人类细胞的行为。

胚胎环境通过迁移和分化信号以及细胞间相互作用，主动调控组织形态发生。因此，与成年异种移植模型相比，胚胎为检测移植细胞的行为提供了更具指导性的微环境，例如可模拟成体干细胞微环境中存在的信号（如 BMPs、WNTs、NOTCH 和 SHH^9....

方案

本研究中使用的所有体内实验程序均符合动物实验与研究相关的各项实验指南，并遵循巴西实验动物使用指南（L11794）。处理鸡胚所用的实验方案均已获得里约热内卢联邦大学卫生科学中心动物实验伦理委员会批准。使用人源细胞的研究已获得克莱门蒂诺·弗拉加·菲略大学医院伦理委员会批准（批准编号：043/09 和 088/04）。实验使用无特定病原体（SPF）的白来航鸡（Gallus gallus）鸡蛋。

1. 细胞球体的制备

注意：只要细胞具有贴壁性，即可使用多种细胞类型制备细胞球。本方案将使用此前所述方法分离的人脂肪来源基质细胞（ADSCs） ^21,27（图2A）。通过在37 °C、震荡条件下用胶原酶IA消化脂肪组织碎片或抽吸物1小时获得细胞，随后以1−2 × 10⁴ 个细胞/cm²的密度接种并过夜培养。弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞扩增培养3–6代。ADSCs均一表达表面抗原CD105、CD90、CD13和CD44，且不表达造血系抗原CD45、CD14、CD34、CD3和CD19²⁷。尽管本方案所....

结果

鉴定 Alu组织学切片中呈阳性的ADSCs
Alu 重复序列是人类基因组中约占10%的重复性元件，因此是特异性识别人类细胞的理想靶标⁴³. 原位 使用DNA探针进行杂交可鉴定组织学切片中的基因组元件，包括原代人类细胞^{29,30,40,44,45,46}在进行实验部分之前，确定形态学特征非常重要 Alu阳性细胞。强烈建议使用人源细胞球（或细胞悬液）的沉淀作为阳性对照。可通过离心并固定部分已制备的细胞球，然后按照步骤3.1.8.......

讨论

此处所述的方案（图1为筛选原代人细胞群体的行为提供了一种可行的方案 体内，以鸡胚为模型。本文描述了细胞球体的形成（图2），将球状体移植到鸡胚中（图3），标本处理及 原位 杂交（图4），人源ADSCs移植至体节前中胚层的代表性结果（图5）及相关实验（图6 和 7），以及将人源ADSCs移植至第一咽弓区域和将人源原发性胶质母细胞瘤移植至鸡前脑的结果（图8).

该方案非常适合用于异质性贴壁细胞群体，包括多种间质/间充质细胞或肿瘤细胞，因为无标记检测方法避免了转染效率或特定亚群筛选的问题。这得益于鸡胚体积较小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物
Gallus gallus 鸡蛋	Granja Tolomei	SPF-free	白来航鸡
试剂
阿尔新蓝 8GX	Sigma-aldrich	A5268
AluFw 引物	Sigma-aldrich	OLIGO	5’-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3’
AluRev 引物	Sigma-aldrich	OLIGO	5’-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3’
硫酸铝	Sigma-aldrich	368458	用于核固红溶液配制
抗地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段抗体	Roche	11093274910	抗体注册号：AB_514497
抗人自然杀伤细胞1抗体（HNK1, CD57）	发育研究杂交瘤库	3H5	抗体注册号：AB_2314644
抗小鼠山羊IgM-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2973	抗体注册号：AB_650513
抗小鼠山羊IgG（H+L）-HRP	Novex	G-21040	抗体注册号：AB_2536527
抗平滑肌肌动蛋白/ACTA2 抗体	Dako	M085129	抗体注册号：AB_2811108
Aquatex	Merck	1085620050	水性封片剂
5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸对甲苯胺盐（BCIP）	Sigma-aldrich	B8503-100MG
封闭试剂	Roche	11096176001
柠檬酸	VETEC	238	用于SSC缓冲液配制
胶原酶 I型 IA	Sigma-aldrich	SCR103
dCTP、dGTP、dATP、dTTP 混合物	Roche	11969064001
Denhardt 溶液 50X	Invitrogen	750018	用于杂交缓冲液配制
硫酸葡聚糖钠盐	Thermo Scientific	15885118	用于杂交缓冲液配制
DIG RNA 标记混合物	Roche	11277073910	含 Dig-11-dUTP
DMEM 低糖培养基	Sigma-aldrich	D5523
3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）	Sigma-aldrich	D5905-50TAB
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）	Sigma-aldrich	227056	用于NBT和BCIP溶液配制
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-aldrich	E6758	用于胰蛋白酶溶液配制
Entellan new	Merck	107961	非水性封片介质
乙醇	Proquímios	N/A
胎牛血清	ThermoFisher	12657029	使用前于56 °C 灭活
甲醛 37% 溶液	Proquímios	N/A
甲酰胺	Vetec	V900064
冰乙酸	Proquímios	N/A
印度墨水	Pelikan	221143
L-谷氨酰胺溶液（200 mM）	Gibco	25030-149
氯化镁	Merck	8147330100	用于NTM缓冲液配制
马来酸	Sigma-aldrich	M0375-500G	用于MAB缓冲液配制
甲醇	Proquímios
正常山羊血清	Sigma-aldrich	NS02L	使用前于56 °C 灭活
4-硝基蓝四氮唑氯化物（NBT）	Roche	11585029001
核固红	Sigma-aldrich	60700
Paraplast Plus	Sigma-aldrich	P3558
青霉素G钠盐	Sigma-aldrich	P3032
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-aldrich	P3813
磷钼酸	Merck	100532
蛋白酶K	Gibco BRL	25530-015
鲑鱼精DNA	Invitrogen	15632011	用于杂交缓冲液配制
氯化钠	Sigma-aldrich	S9888	用于SSC、MAB和NTM缓冲液配制
硫酸链霉素	Sigma-aldrich	S6501
Taq DNA聚合酶试剂盒	Cenbiot Enzimas	N/A
Tris-HCl	Sigma-aldrich	T5941
胰蛋白酶	Sigma-aldrich	T4799
Tween 20	Sigma-aldrich	P1379
二甲苯	Proquímios	N/A
显微镜及设备
Axioplan 直立显微镜	Carl Zeiss Microscopy	N/A
Axiovision 软件	Carl Zeiss Microscopy	N/A
细胞培养箱	ThermoForma	3110
鸡蛋孵化箱（50枚容量）	GP
鹅颈灯	Biocam	N/A	用于鸡蛋操作
Fiji 软件；Cell Counter 插件	ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
超净工作台	TROX	1385
Nanodrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
旋转式切片机	Leica Biosystems	RM2125 RTS	用于切片
体视显微镜	Labomed	Luxeo 4D	用于鸡蛋操作
灭菌烘箱	REALIS	7261690	用于手术材料灭菌
耗材
0.2 mL（PCR）聚丙烯离心管	Eppendorf	30124707
15 mL 聚丙烯锥形离心管	Corning	CLS430791
1.5 mL 聚丙烯离心管	Axygen	MCT-150-C
2 mL 聚丙烯离心管	Axygen	MCT-200-C
50 mL 聚丙烯锥形离心管	Corning	CLS430829
带滤芯（过滤）吸头，200 μL 规格	Invitrogen	AM12655	用于鸡蛋操作
凹槽玻璃染色缸（带盖玻片）	Hecht Karl	42020010
包埋盒	Simport	M480	用作石蜡块支架
玻璃盖玻片，24 × 40 mm	Kasvi	K5-2440
玻璃巴斯德吸管，230 mm	NORMAX	5426023	用于制备玻璃毛细管
切片机刀片	Leica Biosystems	HIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818	用于切片
Parafilm M	Parafilm	P7793
塑料培养皿，30 mm	Kasvi	K13-0035	用于鸡蛋操作
塑料培养皿，60 mm	Prolab	0303-8	用于细胞球体制备。不应进行促进细胞黏附的处理。
硅烷化载玻片（Starfrost）	Knittel Glass	198	用于切片
1 mL 注射器，26 G 针头（0.45 × 13 mm）	Descarpack	32972	用于鸡蛋操作（蛋白抽吸）
手术工具
吸管	Drummond	2-000-000	用于鸡蛋操作
解剖剪刀	Fine Science Tools	14061-11	用于鸡蛋操作
显微镊（镊子）	Fine Science Tools	00108-11	用于鸡蛋操作及玻璃毛细管制备
持针器（可调节解剖针夹头）	Fisherbrand	8955	用于鸡蛋操作
油石，10000目	N/A	N/A	用于磨锐针头
小型画笔一对	N/A	N/A	用于处理石蜡切片。可使用任意品牌。
缝纫针	N/A	N/A	用于磨制成微型手术刀。可使用任意品牌。
无菌一次性手术刀，23号	Swann-Norton	110	用于切片
手术刀柄	Swann-Norton	914	用于切片
Wecker 睫毛剪，尖/尖型	Surtex	SS-641-11	用于鸡蛋操作