一种无标记异种移植模型用于研究人类干细胞球体在鸡胚胎中的行为

Ingrid Rosenburg Cordeiro; José Marques de Brito Neto

doi:10.3791/63067

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一种无标记异种移植模型用于研究人类干细胞球体在鸡胚胎中的行为

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DOI：

10.3791/63067

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2021年10月15日

Ingrid Rosenburg Cordeiro¹^,² , José Marques de Brito Neto¹

¹Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, ²Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种将人源细胞球体移植并鉴定于鸡胚中的方法。该异种移植模型利用胚胎微环境作为诱导性信号的来源，用于检测细胞迁移、分化及趋向性，特别适用于研究原代和/或异质性细胞群体。

摘要

异种移植是研究人类细胞在活体（in vivo）条件下行为的重要方法。特别是胚胎环境可为细胞迁移、分化和形态发生提供独特的诱导信号和胚层特性，而这些信号和特性在成体异种移植模型中往往缺失。此外，胚胎模型无法区分自身与非自身组织，从而避免了移植物被排斥的风险，也无需对宿主进行免疫抑制。本文介绍了一种将人类细胞球体移植到鸡胚中的方法，鸡胚具有易获取、易于操作且在37 °C下发育的优点。

类球体技术可用于选择胚胎的特定区域进行移植。移植后，细胞会整合到宿主组织中，从而能够追踪其迁移、生长和分化过程。该模型具有足够的灵活性，可利用多种贴壁细胞群体，包括异质性的原代细胞群体和癌细胞。为避免预先标记细胞的需要，本文还描述了一种通过人源特异性Alu探针杂交来鉴定供体细胞的方案，这在研究异质性细胞群体时尤为重要。此外，DNA探针可轻松调整以鉴定其他供体物种。本实验方案将详细介绍类球体的制备、移植至鸡胚、组织固定与石蜡切片处理，以及最终通过DNA原位杂交鉴定人源细胞的一般方法。此外，还将讨论建议的对照设置、结果解读示例、可检测的多种细胞行为，以及该方法的局限性。

引言

异种移植是研究人类细胞在活体（in vivo）条件下行为的有效工具。这些模型为广泛的研究领域提供了宝贵的信息，例如人类干细胞生物学¹、细胞事件的实时观察²，以及肿瘤血管生成和转移的研究³。此外，癌症生物学的多个方面，包括患者特异性异种移植瘤的致瘤性，也已得到研究⁴^,⁵。每种异种移植模型都有其优缺点，因此适用于回答特定的科学问题。鸡胚是一种常用的发育生物学模型，因其作为易于获取的羊膜动物模型，适合进行手术操作。异源移植使研究人员能够构建精确的细胞命运图谱⁶，或探究某一特性是由细胞自主决定还是受环境诱导⁷^,⁸。基于类似的原理，鸡胚也可用作异种移植模型，以研究人类细胞的行为。

胚胎环境通过迁移和分化信号以及细胞间相互作用，主动调控组织形态发生。因此，与成年异种移植模型相比，胚胎为检测移植细胞的行为提供了更具指导性的微环境，例如可模拟成体干细胞微环境中存在的信号（如 BMPs、WNTs、NOTCH 和 SHH⁹）。此外，在早期发育阶段缺乏适应性免疫系统，使得异种移植可在无免疫反应或供体组织排斥风险的情况下进行¹⁰。以往的研究已将人类细胞移植至鸡胚中以实现这一目的。人类干细胞的成神经潜能已在注射入神经管或血管后得到检测¹¹，此外还研究了胚胎干细胞¹²和诱导性多能干细胞¹³在胚胎中的整合能力。人类黑色素瘤细胞也已在鸡胚胚胎环境中被研究，揭示了其致瘤性与神经嵴细胞行为之间的关联¹⁴，以及胚胎信息对肿瘤细胞的重编程作用¹⁵。本文描述了一种特别适用于研究人类原代细胞及异质性细胞群体行为的实验方案。

在过去的几十年中，多种组织的间质成分被研究作为祖细胞/干细胞的自体来源，以及因其促血管生成和免疫调节特性，这些特性先前被称为 "间充质干细胞"¹⁶^,¹⁷^,¹⁸最先被鉴定的细胞群体是骨髓基质/干细胞群体（BMSCs），其具有成骨、成脂以及较弱的成软骨潜能。体内¹⁹^,²⁰脂肪来源的基质细胞（ADSCs）是一类异质性细胞群体，通过酶消化脂肪抽吸物或皮肤软组织切除样本，分离出基质-血管组分（SVF），再经体外培养扩增获得。²¹在培养条件下，这些细胞在表型上具有与其他间充质细胞群体共有的标志物，如 CD90、CD73、CD105 和 CD44，以及特有标志物 CD36，且不表达造血细胞标志物（CD45）或内皮细胞标志物（CD31）。²²此外，ADSCs 具有成骨、成脂和成软骨分化潜能体外，该群体中干细胞/祖细胞的数量可通过成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）实验进行测定²². 在体内的，具有ADSC表型的细胞已被报道存在于间质组织中²³ 和/或血管周围²⁴ 区室。越来越明确的是，尽管在标记物上存在共性，体外培养时，不同组织的间质区室反映了特定器官的固有特征，且这些细胞群体的特性因其来源不同而有所差异¹⁷^,²⁵^,²⁶^,²⁷此外，由于这些细胞是根据其对细胞培养皿的黏附性进行分离的，因此可能包含来自不同胚层的细胞²⁸因此，采用异种移植方法无偏倚地研究间质细胞的分化潜能和趋向性，可为这些细胞群体提供有价值的信息，从而指导未来细胞治疗的发展。

本文所述方案（图1）是一种异种移植方法，利用了鸡胚成本低且易于操作的优势。该方法此前已被用于研究人源ADSC²⁹、皮肤成纤维细胞²⁹、月经血来源的基质细胞³⁰以及胶质母细胞瘤细胞³¹的行为。本方法包括以球状体形式移植细胞³²，而此类球状体可由任何贴壁细胞群体制备而成（图2）。此外，还将介绍手术操作步骤以及定制手术器械——微型手术刀和玻璃毛细管——的制备方法（图3）。通过使用人源特异性的Alu探针在组织切片中进行原位杂交，可特异性检测移植的人源细胞（图4），从而无需对移植细胞进行预先标记。代表性实验结果展示了人源ADSC在翼芽水平体节区域（图5、图6、和图7）以及第一咽弓（图8）的移植行为，同时也展示了人源原代胶质母细胞瘤球状体在前脑的移植结果（图8）。文中将描述细胞的迁移、分化及其与鸡胚组织的相互作用，并建议采用共染色或相邻切片染色等检测方法进一步研究细胞行为。

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方案

本研究中使用的所有体内实验程序均符合动物实验与研究相关的各项实验指南，并遵循巴西实验动物使用指南（L11794）。处理鸡胚所用的实验方案均已获得里约热内卢联邦大学卫生科学中心动物实验伦理委员会批准。使用人源细胞的研究已获得克莱门蒂诺·弗拉加·菲略大学医院伦理委员会批准（批准编号：043/09 和 088/04）。实验使用无特定病原体（SPF）的白来航鸡（Gallus gallus）鸡蛋。

1. 细胞球体的制备

注意：只要细胞具有贴壁性，即可使用多种细胞类型制备细胞球。本方案将使用此前所述方法分离的人脂肪来源基质细胞（ADSCs） ²¹^,²⁷（图2A）。通过在37 °C、震荡条件下用胶原酶IA消化脂肪组织碎片或抽吸物1小时获得细胞，随后以1−2 × 10⁴ 个细胞/cm²的密度接种并过夜培养。弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞扩增培养3–6代。ADSCs均一表达表面抗原CD105、CD90、CD13和CD44，且不表达造血系抗原CD45、CD14、CD34、CD3和CD19²⁷。尽管本方案所述方法仅需常规细胞培养所用材料即可简便实施，但最佳聚集时间及是否需要部分解离应通过实验确定。也可采用其他方法制备细胞球，例如悬滴法³³或琼脂糖包被孔板法³⁴；详见讨论部分。所有操作均应在洁净台中采用无菌技术进行。

在细胞操作前，将无菌 PBS（磷酸盐缓冲液）、培养基和胰蛋白酶溶液预热至 37 °C。
将 ADSCs 在低糖 DMEM 培养基中培养，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。使用一个汇合的 25 cm² 培养瓶的 ADSCs 制备两块球状体培养板。弃去培养基，用适量无菌 PBS 洗涤培养皿三次（若使用 25 cm² 细胞培养瓶，每次洗涤使用 5 mL PBS）。
加入足量含有 0.78 mM EDTA 的胰蛋白酶溶液以覆盖细胞（若使用 25 cm² 细胞培养瓶，加入 1 mL 胰蛋白酶溶液），将培养瓶在室温下静置 5 分钟。
轻轻吹打细胞使其解离，加入等体积含 FBS 的培养基以中和胰蛋白酶活性，并将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中。
在 180 × g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，轻敲管壁使沉淀松散。
用 500 µL–2 mL 适合该细胞类型的培养基重悬细胞（参见步骤 1.2）。
注意：贴壁细胞（如 ADSCs 和成纤维细胞）的最低浓度为 5 × 10⁵ 个细胞/mL。一个汇合的 25 cm² 培养瓶的 ADSCs 应用 2 mL 培养基重悬，并接种至两个培养皿中，每皿 1 mL。贴附性较弱的细胞（如胶质细胞）可在较小体积中以约 2 × 10⁶ 个细胞/mL 的浓度接种，效果更佳。
将细胞悬液小心地加至一个无菌 60 mm 培养皿的一侧（未包被且未经处理，例如用于制备琼脂平板的培养皿）。通过将培养皿倾斜放置在折叠的洁净纱布上，使培养基局限于尽可能小的区域（图 1B），并在培养箱中保持倾斜状态。
将细胞悬液置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，直至形成细胞聚集体（ADSCs 接种后 6–8 小时）。
注意：球状体聚集时间可能因细胞类型而异。
如需要（见讨论部分），使用 1000 µL 枪头轻轻吹打，对较大的细胞聚集体进行部分解离。ADSC 球状体在接种后 6–8 小时进行解离。
将培养皿放回培养箱，直至球状体准备好用于移植：形态呈圆形、边缘清晰且不易分散（图 1C、D）。
注意：ADSC 球状体在部分解离后 2 天即可准备就绪。

2. 将类球体移植到鸡胚中

准备
1. 将15-30枚鸡胚蛋置于37.5 °C的湿润培养箱中孵育，直至达到目标的汉堡-汉密尔顿（Hamburger-Hamilton, HH）发育阶段³⁵：在肢芽水平体节（HH11-12期或13-19个体节）移植时为40-45小时，或在头颅区域（HH8-9期或5-8个体节）移植时为29-33小时。将鸡蛋水平放置，并在孵化前用铅笔在蛋壳顶部画一条线图3D).
  注意：孵育时间可能因不同孵育器而略有差异。画线可确保在实验前鸡蛋发生旋转时，仍能轻松识别含有胚胎的蛋体上部。
2. 制备锋利的针头（"显微手术刀"）通过将缝合针固定在金属针持上（图3B）。使用涂油的磨刀石磨针，直至其形似带有薄刃的小型手术刀（图3C）或者，通过电解法制备锋利的钨针³⁶.
3. 使用本生灯火焰加热巴斯德玻璃吸管的细端，短暂熔化后取出，拉伸形成细玻璃毛细管。用显微镊子小心将其折断，分为两段。准备一根细毛细管用于印度墨水注射，另一根较粗的毛细管用于转移类球体（图3B).
  注意：通过改变拉制强度，可制作出不同规格的玻璃微电极。微电极应在手术前立即制备。
4. 准备用于卵子操作的工作台面及其他材料（图3A）。将所有手术器械在100 °C烘箱中灭菌过夜，或在使用前用70%乙醇立即消毒。将无菌PBS预热至37 °C。为吸液管组件安装带滤芯的200 µL吸头，用于印度墨水注射和类球体转移。
  注意：转移人类细胞类球体时，请使用带屏障的吸头。
5. 实验开始前，向30 mm培养皿中加入2滴印度墨水储备液，并与1 mL无菌PBS混合。将球体培养板从培养箱中取出，后续实验过程中置于冰盒上。
每个卵的制备
1. 从孵化箱中取出一枚鸡蛋，将其置于蛋托上。在鸡蛋的尖端打一个小孔。图 2D）并使用注射器和针头吸取1.5 mL蛋清。将针头垂直插入蛋内，以避免损伤蛋黄。用胶带封住小孔。可选步骤：可在实验前对所有鸡蛋重复此操作，并将剩余鸡蛋重新放入孵化条件中继续孵育。
2. 使用剪刀小心地在蛋壳顶部切开一个窗口（图3D）。使用移液器，在卵黄上加入1-2滴PBS。如有必要，去除较大的蛋清气泡（例如如图所示的气泡）。 图3F使用移液器。
3. 将细玻璃毛细管连接至吸管装置。通过负压吸取，使玻璃毛细管部分充满印度墨水溶液。将足量印度墨水注射至胚胎下方的卵黄中，直至可见胚胎结构。图3E，F).
4. 使用体视显微镜，计数体节的数量（图 4A）。使用铅笔对卵进行单独编号（图4B).
球体移植
1. 确定移植物区域：肢芽水平的轴旁中胚层（预定15体节的前体节中胚层）^th 至 20^th 体节³⁷) (图 3G 和 图5A）或假定的第一咽弓区域（位于中脑后部/第一菱脑节外侧的外胚层与内胚层之间）³⁸) (图8A).
2. 使用显微解剖刀在目标区域上方切开卵黄膜。
3. 使用一对显微手术刀，在将要植入球状体的区域做一个浅层切口图3H).
  注意：避免损伤内胚层；否则卵黄会泄漏（若发生泄漏，应丢弃该卵）。
4. 从移液器上取下细毛细管，换上粗毛细管。在体视显微镜下观察类球体，选择一个大小与体节相近的类球体（图 2D）。将该球体吸入毛细管中。
5. 轻轻地将球状体放置在切割区域旁边（图3H）。使用锋利的针头将球状体推入切开区域（图3I，J).
6. 使用移液管在胚胎上加入1-2滴PBS，以确保类球体牢固插入。
  注意：如果移植物脱落，应移植新的球状体（步骤 2.3.4 和 2.3.5）。
7. 用纸巾擦去蛋壳上的任何白蛋白渗漏，以确保蛋能够完全密封，避免污染。使用胶带将蛋壳上的窗口密封。
8. 注意嫁接区域（图 4A将卵小心放回37.5 °C的湿润培养箱中，避免移位已插入的类球体。
9. 将卵孵化至所需阶段。
  注意：当异种移植在肢芽水平的体节进行时，已在3.5日龄胚胎（HH21）中成功检测到细胞迁移与细胞死亡，在6日龄胚胎（HH29）中观察到细胞分化与趋向性图5A）。植入宿主组织的操作也已在8日龄胚胎（HH33期）中完成。移植至咽弓区域的供体细胞已在4.5日龄胚胎（HH25期）中进行研究（图8A).

3. 组织解剖、固定、处理及组织学切片制备

解剖与固定
1. 配制固定液（每枚胚胎至少1 mL）：无水乙醇-37%甲醛-冰醋酸，按6:3:1比例混合。清洁工作台面、一对显微镊子、手术剪或虹膜剪，以及带槽勺。将60 mm玻璃培养皿中加入冷PBS，并置于体视显微镜下。
2. 剪去封口胶带以打开鸡蛋。
3. 剪除胚胎周围的膜结构，并用带槽勺取出胚胎。
4. 将胚胎转移至培养皿中。若胚胎为5日龄（HH26）或更老，在进行任何ex ovo操作前应立即去头。
5. 使用显微镊子和剪刀去除残留的膜结构。在PBS中轻轻振荡样本，以洗去残留的卵黄颗粒。
6. 若异种移植操作位于翼部水平，则弃去头部；若细胞移植至头颅区域，则剪除并弃去身体下半部分，确保心脏区域保持完整。
7. 将每个样本分别转移至含有1 mL固定液的2.0 mL离心管中。按之前方式对各管进行单独标记（图4B）。在4 °C条件下振荡孵育过夜。
8. 使用细胞团或类球体（图4F）作为阳性对照。具体操作为：将细胞悬液（步骤1.5）或细胞类球体（步骤1.10）在1.5 mL离心管中以180 × g离心10分钟，弃去培养基，不扰动沉淀，加入1 mL固定液。在4 °C条件下静置孵育过夜，后续步骤与鸡胚样本处理方式相同。
脱水与包埋
1. 通过依次用1 mL 70%、80%、90%和100%乙醇在1×PBS中洗涤，对胚胎进行脱水处理，每次至少1小时，并持续振荡。
2. 在室温下用1 mL 100%乙醇振荡孵育样本过夜。
3. 在通风橱中用1 mL 100%二甲苯孵育样本1小时，重复此步骤两次。
4. 将管内内容物转移至染色缸中，弃去二甲苯。加入足量熔融石蜡覆盖胚胎，并用玻璃盖片盖住染色缸。在65 °C烘箱中孵育过夜。
5. 准备一块预热板和用于石蜡包埋的模具。
  注：拉直的一对回形针可用于精确定位胚胎。
6. 将模具中填满熔融石蜡，并将胚胎转移至其中。调整胚胎位置，以获得躯干的横切面（图5A）或头部的冠状切面（图8A）。
7. 在石蜡中插入纸制标签，置于待切面的对侧，以帮助在后续切片时保持正确的胚胎方向（图4C）。
8. 如需使用，将包埋盒覆盖在样本上方。待石蜡块完全冷却后从模具中取出。或者，使用熔融石蜡将已硬化的石蜡块固定于包埋盒或其他块状夹持器上，再次冷却。
切片
1. 准备切片所需材料。将加热板预热至42 °C，并用洁净的铝箔覆盖一块约30 cm × 20 cm的纸板或泡沫板。使用前清洁所有表面。
  注：应佩戴手套，避免核酸酶污染，尤其是部分切片将用于RNA in situ杂交实验。出于同样原因，除非水浴和表面可彻底清洁，否则应避免使用组织展片水浴来展平石蜡切片。
2. 使用切片机刀片修去多余石蜡。在两侧修成梯形斜面，以便后续使用刀片轻松分离各切片（图3A）。
3. 将石蜡块固定于切片机上。仔细调整位置，确保左右两侧相互平行。在切出数片样本并经显微镜观察后，进行更精细的调整。
4. 当达到目标区域（肢芽或第一咽弓）时，切取7 µm厚的切片，并将石蜡带置于覆盖铝箔的板上。对整个目标区域进行连续切片（图4C）。
5. 为制备连续切片，将适量载玻片用无菌去离子水滴覆盖。使用毛刷和刀片将单个切片依次转移至载玻片上。将相邻切片转移至不同载玻片，以形成连续切片系列（图4D）。为3.5日龄胚胎准备3张系列切片，4.5日龄准备4张，6日龄准备5张。对相邻切片使用不同的探针、抗体或经典组织学染色剂进行染色。
  注：若胚胎切片范围较大，同一系列中可包含多个相邻切片。每张载玻片上可放置多个切片，但需在切片间留出适当空间以便其充分展开。此时暂勿将载玻片置于加热板上。
6. 待所有切片转移至载玻片后，添加更多水，使所有切片漂浮于同一水滴中。将载玻片置于加热板上，使切片充分展开。随后将载玻片从加热板上取下，小心倾斜载玻片并接触滤纸，以去除多余水分。
  注：切片在完全展开前，不得直接接触载玻片表面。
7. 将载玻片置于37 °C培养箱中干燥过夜。

4. 通过聚合酶链式反应（PCR）合成地高辛标记的 Alu 探针

配制以下人源特异性引物的储备液³⁹：AluFw：5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' 和 AluRev：5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'。
配制50 µL的以下PCR反应体系⁴⁰：1x PCR缓冲液，2.0 mM MgCl₂，0.1 mM dCTP，0.1 mM dGTP，0.1 mM dATP，0.065 mM dTTP，0.035 mM dig-11-dUTP，0.4 µM AluFw引物，0.4 µM AluRev引物，0.05 U/µL Taq聚合酶，以及1 ng/µL人基因组DNA。
使用以下程序进行PCR扩增：94 °C预变性4分钟，随后进行40个循环（每个循环包括94 °C变性20秒、60 °C退火20秒、72 °C延伸20秒），最后在72 °C延伸5分钟。
使用分光光度计测定探针浓度。将探针储存于-20 °C。
注意：PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳后长度应为200–300 bp²⁹。

5. 切片原位杂交 Alu 探针

第1天：通透化与杂交
注意：第1天的所有步骤应使用已灭菌的载玻片玻璃罐。
1. 将一份PBT缓冲液（PBS中含0.1% Tween 20）预热至37 °C水浴中，并准备一个含50%去离子甲酰胺/50%去离子水的湿盒。
  注意：根据玻璃罐的大小计算所有洗涤液的体积。除非另有说明，所有洗涤步骤均通过将载玻片浸入溶液中完成。
2. 在通风橱中，用二甲苯连续洗涤三次，每次5分钟，以去除石蜡。
3. 通过两次100%乙醇洗涤（每次5分钟）使组织重新水化，随后在PBS中依次用90%、70%、30%乙醇各洗涤2分钟。
4. 用PBT缓冲液（PBS中含0.1% Tween 20）洗涤三次，每次5分钟。
5. 进行通透化处理：将2 µg/mL蛋白酶K加入预热的PBT缓冲液中，将载玻片浸入该溶液，并在37 °C水浴中孵育14分钟。
6. 将组织切片在4%多聚甲醛/PBS溶液中室温固定20分钟。
7. 用PBS洗涤5分钟。
8. 擦去每张载玻片上多余的PBS后，向组织区域加入300 µL杂交缓冲液（50%去离子甲酰胺，4x SSC pH 5.0，1x Denhardt溶液，5%硫酸葡聚糖，100 µg/mL鲑精DNA）（表1），在甲酰胺湿盒中42 °C孵育1小时。
9. 在杂交缓冲液中配制0.2 ng/mL Alu探针溶液。倾斜载玻片去除原有杂交缓冲液，向组织区域加入120 µL Alu探针溶液，加盖玻璃盖玻片，注意避免产生气泡。
  注意：此步骤中不得使用Parafilm覆盖载玻片，因其在高于70 °C时会熔化。
10. 将载玻片置于95 °C加热板上加热5分钟。
  注意：切勿吸入甲酰胺蒸气。
11. 将载玻片在甲酰胺湿盒中42 °C孵育过夜。
第2天：严谨性洗涤与免疫组织化学
1. 配制20x SSC缓冲液（3 M NaCl，0.3 M柠檬酸钠，pH 7.5）（表1）。将两份0.1x柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液（pH 7.5）预热至42 °C。
2. 用pH 7.5的2x SSC缓冲液填充载玻片玻璃罐，轻轻放入载玻片，等待盖玻片自行脱落。用镊子取下盖玻片，并将载玻片在2x SSC缓冲液中室温孵育5分钟。
3. 再次用pH 7.5的2x SSC缓冲液室温洗涤5分钟。
4. 用pH 7.5的0.1x SSC缓冲液在42 °C下洗涤两次，每次5分钟。
5. 用MABT缓冲液（含Tween的马来酸缓冲液；0.1 M马来酸，0.15 M氯化钠，0.1% Tween 20，pH 7.5）（表1）在室温下洗涤两次，每次30分钟。
6. 擦去每张载玻片上多余的缓冲液，向组织区域加入400 µL封闭液（MABT中含10%灭活的正常山羊血清和2%封闭试剂），在由去离子水制备的湿盒中室温孵育2小时。
7. 倾斜载玻片去除液体，加入150 µL以封闭液按1:2,000稀释的碱性磷酸酶标记的Fab抗DIG抗体片段。加盖玻璃盖玻片或Parafilm，在湿盒中4 °C孵育16小时。
第3天：显色反应
1. 在盛有MABT缓冲液的玻璃罐中（如步骤5.2.2所述）轻轻取下盖玻片或Parafilm，将载玻片在MABT缓冲液中室温孵育30分钟。
2. 再用MABT缓冲液洗涤三次，每次30分钟。
3. 用MAB缓冲液（马来酸缓冲液；0.1 M马来酸，0.15 M氯化钠，pH 7.5）（表1）洗涤30分钟。
4. 用NTM缓冲液（NaCl-Tris-MgCl₂缓冲液；100 mM Tris-HCl pH 9.5，100 mM氯化钠，50 mM氯化镁）（表1）洗涤两次，每次10分钟。
5. 向染色罐中加入显色液（NTM中含0.45 µL/mL 4-硝基蓝四唑氯化物，3.5 µL/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸对甲苯胺盐）（表1），将载玻片浸入其中。用铝箔包裹染色罐，在37 °C下避光孵育过夜以显色。
第4天：复染与封片
1. 在室温下用PBS洗涤三次，每次10分钟。
  注意：确保将显色液作为卤素废物妥善处理。
2. 可直接滴加水溶性封片剂并加盖玻璃盖玻片进行封片；也可选择进行核固红或阿利新蓝复染。
3. 擦去多余的PBS，在组织区域加入500 µL 0.1%核固红复染液⁴¹（表1），在湿盒中孵育10分钟。倾斜去除多余染液后，进入脱水步骤（步骤5.4.5）。
4. 将组织浸入0.5%阿利新蓝溶液（软骨复染）⁴²中10分钟；用蒸馏水冲洗，再在1%磷钼酸中孵育10分钟。再次用水冲洗后进行脱水。
  注意：若省略磷钼酸洗涤步骤，阿利新蓝将作为细胞核复染剂。
5. 依次在70%、95%、100%、100%乙醇中脱水，每次5分钟。
6. 在通风橱中用二甲苯洗涤三次，每次5分钟。
7. 使用以二甲苯为基础的封片剂和玻璃盖玻片进行封片。
8. 将载玻片在通风橱中干燥至少16小时。

6. 图像采集

载玻片完全干燥后，使用直立式明场显微镜检查所有切片中是否存在移植的人源细胞（图4E）。寻找蓝紫色 Alu阳性细胞（图 4F，）并标记出包含的片段 Alu-阳性细胞使用记号笔标记（图4E).
注意：用标记对各部分进行标注 Alu阳性细胞将更便于在拍照时定位，并与使用其他标记物染色的相邻切片进行比较。
注意按照切片上异种移植物位置的相同顺序（前-后方向）拍摄照片。每张照片的命名应包含所有相关信息，例如[异种移植日期_细胞类型_胚胎年龄_探针类型_切片编号_001包含元数据文件，以便后续添加比例尺。
如果同一系列的其他切片使用另一种标记物（例如 RNA）进行染色原位杂交或免疫组织化学，拍摄并命名相邻切片（图6）以相同的方式。

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结果

鉴定 Alu组织学切片中呈阳性的ADSCs
Alu 重复序列是人类基因组中约占10%的重复性元件，因此是特异性识别人类细胞的理想靶标⁴³. 原位使用DNA探针进行杂交可鉴定组织学切片中的基因组元件，包括原代人类细胞²⁹^,³⁰^,⁴⁰^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶在进行实验部分之前，确定形态学特征非常重要 Alu阳性细胞。强烈建议使用人源细胞球（或细胞悬液）的沉淀作为阳性对照。可通过离心并固定部分已制备的细胞球，然后按照步骤3.1.8...

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讨论

此处所述的方案（图1为筛选原代人细胞群体的行为提供了一种可行的方案体内，以鸡胚为模型。本文描述了细胞球体的形成（图2），将球状体移植到鸡胚中（图3），标本处理及原位杂交（图4），人源ADSCs移植至体节前中胚层的代表性结果（图5）及相关实验（图6 和 7），以及将人源ADSCs移植至第一咽弓区域和将人源原发性胶质母细胞瘤移植至鸡前脑的结果（图8).

该方案非常适合用于异质性贴壁细胞群体，包括多种间质/间充质细胞或肿瘤细胞，因为无标记检测方法避免了转染效率或特定亚群筛选的问题。这得益于鸡胚体积较小...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由里约热内卢联邦大学（UFRJ，资助 J.B.）、国家科学技术发展委员会（CNPq，资助 J.B.）以及卡洛斯·查加斯·菲略基金会（FAPERJ，资助 J.B.）提供支持。我们感谢法国巴黎国家科学研究中心（CNRS）的 T. Jaffredo 提供 Runx2（Cbfa1）探针。HNK1 抗体来自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库由 NICHD 资助建立，并由美国爱荷华州爱荷华城爱荷华大学生物科学系（邮编：52242，IA）维护。我们感谢 V. Moura-Neto 提供切片机的使用权限，以及 R. Lent 提供显微镜的使用权限。我们感谢 E. Steck 在合成 Alu 探针过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
动物
Gallus gallus 鸡蛋	Granja Tolomei	SPF-free	白来航鸡
试剂
阿尔新蓝 8GX	Sigma-aldrich	A5268
AluFw 引物	Sigma-aldrich	OLIGO	5’-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3’
AluRev 引物	Sigma-aldrich	OLIGO	5’-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3’
硫酸铝	Sigma-aldrich	368458	用于核固红溶液配制
抗地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段抗体	Roche	11093274910	抗体注册号：AB_514497
抗人自然杀伤细胞1抗体（HNK1, CD57）	发育研究杂交瘤库	3H5	抗体注册号：AB_2314644
抗小鼠山羊IgM-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2973	抗体注册号：AB_650513
抗小鼠山羊IgG（H+L）-HRP	Novex	G-21040	抗体注册号：AB_2536527
抗平滑肌肌动蛋白/ACTA2 抗体	Dako	M085129	抗体注册号：AB_2811108
Aquatex	Merck	1085620050	水性封片剂
5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸对甲苯胺盐（BCIP）	Sigma-aldrich	B8503-100MG
封闭试剂	Roche	11096176001
柠檬酸	VETEC	238	用于SSC缓冲液配制
胶原酶 I型 IA	Sigma-aldrich	SCR103
dCTP、dGTP、dATP、dTTP 混合物	Roche	11969064001
Denhardt 溶液 50X	Invitrogen	750018	用于杂交缓冲液配制
硫酸葡聚糖钠盐	Thermo Scientific	15885118	用于杂交缓冲液配制
DIG RNA 标记混合物	Roche	11277073910	含 Dig-11-dUTP
DMEM 低糖培养基	Sigma-aldrich	D5523
3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）	Sigma-aldrich	D5905-50TAB
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）	Sigma-aldrich	227056	用于NBT和BCIP溶液配制
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-aldrich	E6758	用于胰蛋白酶溶液配制
Entellan new	Merck	107961	非水性封片介质
乙醇	Proquímios	N/A
胎牛血清	ThermoFisher	12657029	使用前于56 °C 灭活
甲醛 37% 溶液	Proquímios	N/A
甲酰胺	Vetec	V900064
冰乙酸	Proquímios	N/A
印度墨水	Pelikan	221143
L-谷氨酰胺溶液（200 mM）	Gibco	25030-149
氯化镁	Merck	8147330100	用于NTM缓冲液配制
马来酸	Sigma-aldrich	M0375-500G	用于MAB缓冲液配制
甲醇	Proquímios
正常山羊血清	Sigma-aldrich	NS02L	使用前于56 °C 灭活
4-硝基蓝四氮唑氯化物（NBT）	Roche	11585029001
核固红	Sigma-aldrich	60700
Paraplast Plus	Sigma-aldrich	P3558
青霉素G钠盐	Sigma-aldrich	P3032
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-aldrich	P3813
磷钼酸	Merck	100532
蛋白酶K	Gibco BRL	25530-015
鲑鱼精DNA	Invitrogen	15632011	用于杂交缓冲液配制
氯化钠	Sigma-aldrich	S9888	用于SSC、MAB和NTM缓冲液配制
硫酸链霉素	Sigma-aldrich	S6501
Taq DNA聚合酶试剂盒	Cenbiot Enzimas	N/A
Tris-HCl	Sigma-aldrich	T5941
胰蛋白酶	Sigma-aldrich	T4799
Tween 20	Sigma-aldrich	P1379
二甲苯	Proquímios	N/A
显微镜及设备
Axioplan 直立显微镜	Carl Zeiss Microscopy	N/A
Axiovision 软件	Carl Zeiss Microscopy	N/A
细胞培养箱	ThermoForma	3110
鸡蛋孵化箱（50枚容量）	GP
鹅颈灯	Biocam	N/A	用于鸡蛋操作
Fiji 软件；Cell Counter 插件	ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
超净工作台	TROX	1385
Nanodrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
旋转式切片机	Leica Biosystems	RM2125 RTS	用于切片
体视显微镜	Labomed	Luxeo 4D	用于鸡蛋操作
灭菌烘箱	REALIS	7261690	用于手术材料灭菌
耗材
0.2 mL（PCR）聚丙烯离心管	Eppendorf	30124707
15 mL 聚丙烯锥形离心管	Corning	CLS430791
1.5 mL 聚丙烯离心管	Axygen	MCT-150-C
2 mL 聚丙烯离心管	Axygen	MCT-200-C
50 mL 聚丙烯锥形离心管	Corning	CLS430829
带滤芯（过滤）吸头，200 μL 规格	Invitrogen	AM12655	用于鸡蛋操作
凹槽玻璃染色缸（带盖玻片）	Hecht Karl	42020010
包埋盒	Simport	M480	用作石蜡块支架
玻璃盖玻片，24 × 40 mm	Kasvi	K5-2440
玻璃巴斯德吸管，230 mm	NORMAX	5426023	用于制备玻璃毛细管
切片机刀片	Leica Biosystems	HIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818	用于切片
Parafilm M	Parafilm	P7793
塑料培养皿，30 mm	Kasvi	K13-0035	用于鸡蛋操作
塑料培养皿，60 mm	Prolab	0303-8	用于细胞球体制备。不应进行促进细胞黏附的处理。
硅烷化载玻片（Starfrost）	Knittel Glass	198	用于切片
1 mL 注射器，26 G 针头（0.45 × 13 mm）	Descarpack	32972	用于鸡蛋操作（蛋白抽吸）
手术工具
吸管	Drummond	2-000-000	用于鸡蛋操作
解剖剪刀	Fine Science Tools	14061-11	用于鸡蛋操作
显微镊（镊子）	Fine Science Tools	00108-11	用于鸡蛋操作及玻璃毛细管制备
持针器（可调节解剖针夹头）	Fisherbrand	8955	用于鸡蛋操作
油石，10000目	N/A	N/A	用于磨锐针头
小型画笔一对	N/A	N/A	用于处理石蜡切片。可使用任意品牌。
缝纫针	N/A	N/A	用于磨制成微型手术刀。可使用任意品牌。
无菌一次性手术刀，23号	Swann-Norton	110	用于切片
手术刀柄	Swann-Norton	914	用于切片
Wecker 睫毛剪，尖/尖型	Surtex	SS-641-11	用于鸡蛋操作

参考文献

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一种无标记异种移植模型用于研究人类干细胞球体在鸡胚胎中的行为

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