胫骨内骨肉瘤细胞注射法建立原位骨肉瘤及肺转移小鼠模型

摘要

本实验方案描述了通过胫骨内注射骨肉瘤细胞，建立携带原位骨肉瘤及肺转移病灶的小鼠模型。

摘要

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨癌，肺是最常见的转移部位。伴有肺转移的骨肉瘤患者五年生存率低于30%。因此，建立能够模拟人类骨肉瘤发展的小鼠模型，对于深入理解骨肉瘤发生及肺转移的基本机制，并开发新型治疗方法具有重要意义。本文报道了构建原发性骨肉瘤及肺转移小鼠模型的详细操作步骤 通过 胫内注射骨肉瘤细胞。结合生物发光或X射线活体成像系统，这些活体小鼠模型可用于监测和定量骨肉瘤的生长与转移。为建立该模型，将含有骨肉瘤细胞的基底膜基质装载至微量注射器中，在麻醉后注射至每只无胸腺小鼠的一侧胫骨。当原位骨肉瘤达到IACUC批准方案规定的尺寸限制时，处死小鼠。分离携带骨肉瘤的腿部组织及发生转移的肺组织。该模型具有潜伏期短、生长迅速、病变更严重以及对原发灶和肺转移灶的监测敏感等特点。因此，这些模型是研究特定因子在骨肉瘤发生及肺转移中的功能与机制、肿瘤微环境，以及评估治疗效果的理想工具。 体内.

引言

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨癌^1,2，其主要侵犯周围组织，甚至在患者确诊时已发生肺转移。肺转移是骨肉瘤治疗面临的主要挑战，伴有肺转移的骨肉瘤患者五年生存率仍低至20%–30%^3,4,5。然而，自20世纪70年代引入化疗以来，原发性骨肉瘤的五年生存率已提高至约70%⁶。因此，迫切需要深入了解骨肉瘤发生及肺转移的基本机制，以开发新的治疗方法。建立能够最好地模拟人类骨肉瘤进展的小鼠模型具有重要意义⁷。

骨肉瘤动物模型可通过自发形成、诱导型基因工程、移植及其他技术方法构建。由于肿瘤形成时间长、成瘤率不一致、发病率低且稳定性差，自发性骨肉瘤模型很少被使用^8,9。尽管诱导型骨肉瘤模型比自发性模型更容易获得，但其应用仍受到限制，因为诱导因素会影响骨肉瘤的微环境、发病机制及病理特征¹⁰。转基因模型有助于理解肿瘤的发病机制，因....

方案

所有动物实验均经上海中医药大学动物福利委员会批准。选用4周龄雄性BALB/c裸鼠，在进行骨肉瘤细胞原位注射手术前适应性饲养一周。小鼠饲养于独立通风 每笼五只小鼠，饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，自由摄取SPF级饲料和无菌水。

1. 细胞的制备

1. 在注射成骨肉瘤细胞（143B-Luciferase）当天，用 PBS（pH 7.4）将培养于 10 cm 细胞培养皿中、融合度达 80%–90% 的细胞洗涤两次，加入 1.5 mL 0.25% 胰蛋白酶消化 3 分钟。随后加入 6 mL 含 10% 血清的 MEM 培养基以终止胰蛋白酶消化反应，并将细胞收集至 15 mL 离心管中。
   注：143B-Luciferase 细胞系是通过将 pLV-luciferase 载体转染至 143B 细胞系获得²³。
2. 吸取 20 µL 细胞悬液加入细胞计数板的计数室中，使用自动细胞计数仪（见材料表）计算细胞浓度。
3. 在室温下以 800 × g 离心 5 分钟。
4. 用移液器吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 8.5 mg/mL 基底膜基质（见材料表）中，调整终浓度为 2 × 10⁷ 个细胞/mL。
....

结果

成功的原位（原发性）骨肉瘤及转移性肺模型依赖于骨肉瘤细胞的准确原位注射。本文介绍一种原位（原发性）骨肉瘤模型 通过 成功建立了胫骨内骨肉瘤细胞注射模型。 图 3A 显示一只具有原位（原发性）骨肉瘤的代表性小鼠，以及 图3B 显示一个典型的孤立原位（原发性）骨肉瘤。每周使用游标卡尺测量一次肿瘤体积，并按照步骤2.11所述方法进行计算（图3C). 原位（原发性）骨肉瘤生长 体内 通过X射线和生物发光（当注射的细胞用荧光素酶标记时）活体成像系统进行追踪. X射线图像采集于143B成骨肉瘤细胞注射后的第一周至第六周图3D）。此外，原位（原发性）骨肉瘤生长的影像 体内 在将荧光素酶标记的143B细胞注射入小鼠胫骨后获得图3E).

讨论

骨肉瘤细胞原位注射是研究特定因素在骨肉瘤发生和发展中功能与机制的理想模型，也可用于评估治疗效果。为避免肿瘤生长差异，需选择处于80%-90%融合度、活力最强的骨肉瘤细胞，严格控制胰蛋白酶消化时间，确保细胞活性不受影响，并以相同数量精确注射至每只小鼠的胫骨。由于细胞团块会影响细胞计数，导致注射到每只小鼠胫骨中的细胞数量不准确，因此需用移液器将细胞悬液适当上下吹打混匀，以防止细胞团块形成。

另一个必须考虑的关键因素是骨肉瘤细胞的重悬液。注射的细胞应重悬于基底膜基质中，而非PBS或培养基中。此外，高浓度的基底膜基质难以移液，且会影响体积的准确性；因此，需要采用适当浓度的基底膜基质²⁶。为进行骨肉瘤细胞注射，在胫骨平台钻孔时，应使穿刺针随注射器旋转前进，而不是直接向前推进，直至约一半针头进入胫骨。特别需要注意的是，通常使用免疫缺陷小鼠，通过人源骨肉瘤细胞建立原位骨肉瘤模型²⁷。同时，注射操作应在生物安全柜内使用无菌手术器械进行。由于小鼠在麻醉和手术后可能出现不适，术后第一周必须密切监测小鼠状态。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动细胞计数仪	上海西摩生物科技有限公司	IC1000	细胞计数
麻醉机	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R500IP	小鼠麻醉设备
BALB/c 裸鼠	上海斯莱克实验动物有限责任公司	/	动物
基底膜基质	上海优宁生物科技有限公司	356234, BD, Matrigel	重悬细胞
生物发光成像系统	上海佰泰科技有限公司	Vieworks	若注射的细胞标记有荧光素酶，则用于追踪肿瘤生长及肺转移
离心管（15 mL）	上海约年生物科技有限公司	430790, Corning	离心细胞
异氟烷	深圳瑞沃德生命科技有限公司	VETEASY	小鼠麻醉
MEM 培养基	上海约年生物科技有限公司	LM-E1141	细胞培养基
微量注射器	上海高鸽工贸有限公司	0-50 μL	将细胞精确注射至胫骨
磷酸盐缓冲液	碧云天生物技术	ST447	洗涤人骨肉瘤细胞
1 ml 注射器	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司	20200411	钻孔
143B 细胞系	ATCC	CRL-8303	骨肉瘤细胞系
胰蛋白酶（0.25%）	上海约年生物科技有限公司	25200056, Gibco	细胞胰酶处理
台盼蓝	碧云天生物技术	ST798	染色细胞以评估活性
载体（pLV-荧光素酶）	上海约年生物科技有限公司	VL3613	质粒
Lipofectamine 2000	上海约年生物科技有限公司	11668027,Thermo fisher	质粒转染试剂
X射线成像系统	布鲁克（北京）科技有限公司	FX PRO	获取X射线图像以检测肿瘤生长