方法文章

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

DOI：

10.3791/63077

⸱

2022年2月25日

 , 
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

本文内容

摘要

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本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究大脑中特定突触的生理特性及其可塑性变化机制，是现代神经科学面临的关键挑战。传统方法 体外 电生理技术利用电刺激来诱发突触传递。该方法的主要缺点在于其非特异性：刺激电极所在区域内的所有轴突都会被激活，从而难以将观察到的效应归因于特定的传入连接。这一问题可通过用光遗传学刺激替代电刺激来克服。本文描述了一种将光遗传学与 体外 膜片钳记录。这是一种研究精确解剖定位的突触连接的基础突触传递及突触可塑性的强大工具，几乎适用于脑内任何神经通路。本文描述了编码通道视紫红质蛋白的病毒载体的制备与处理方法，用于将其手术注射至啮齿类动物脑内特定的突触前区域（内侧前额叶皮层），以及制备下游靶区（外侧内嗅皮层）的急性脑片。同时提供了将膜片钳记录与光刺激诱导突触激活相结合，以研究短时程和长时程突触可塑性的详细实验流程。我们还讨论了通过结合光遗传学与Cre依赖性细胞标记实现通路特异性和细胞特异性研究的实验范例。最后，介绍了对突触前目标区域进行组织学验证的方法，以及对突触后细胞进行生物胞素标记，以便进一步确定其精确定位和细胞类型。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

理解突触的生理学特性及其可塑性变化机制，是理解健康大脑中脑网络功能的基础1，以及它们在脑部疾病中功能障碍的机制。急性脑切片 离体 脑切片技术能够利用全细胞膜片钳记录，以高信噪比记录单个神经元突触的电活动。通过控制膜电位并进行简便的药理学干预，可实现对受体亚型的分离。这些记录具有极高的特异性，可用于鉴定突触后神经元，包括其皮层层级和亚区域定位2细胞形态学3，分子标志物的存在4，其传入投射5，或者它最近是否曾处于活跃状态6.

然而，实现突触前输入的特异性具有一定的挑战性。传统方法采用刺激电极来激活特定层内的轴突。一个典型的例子是海马体，其中在辐射层（stratum radiatum）进行局部刺激，可激活从CA3区投射到CA1区的突触7。在此情况下，突触前特异性得以实现，因为CA3输入是位于辐射层内、投射至CA1锥体细胞的唯一兴奋性输入8。尽管如此，这种通过传统电刺激方法在CA3-CA1轴突上实现的高度输入特异性仅属特例，也正因如此，该突触才成为被广泛深入研究的对象。在其他脑区，来自多个....

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方案

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所有动物实验均按照英国《1986年动物科学程序法案》及相关指南以及当地机构指南进行。

1. 立体定位病毒注射

注意：本实验方案需要解剖学上的特异性，但不需要突触后细胞类型的特异性。

  1. 选择合适的动物。本方案使用雄性野生型Lister hooded大鼠（300–350 g，约3月龄）。
  2. 选择合适的病毒载体。需考虑多个因素（参见 讨论）。本实验方案采用病毒表达光遗传学通道 ChETATC12，用于转导兴奋性神经元（AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry；滴度：3.3 x 1013 病毒基因组/mL
  3. 使用注射坐标和体积的确定方法 如先前所述的脑图谱35.
  4. 病毒制剂的立体定位注射
    注意：应遵循所有相关的国家和机构关于动物使用与护理的指南。病毒载体的立体定位注射操作参照先前所述方法进行。13 并作如下修改。
    1. 在动物麻醉和准备期间，将病毒制剂置于冰上保存。
    2. ....

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结果

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在本实验方案中，我们描述了如何通过病毒递送光遗传学工具来研究长程突触的生理学特性及可塑性。该方案可轻松适用于研究大脑中几乎任何长程连接。作为示例，我们介绍了将编码视蛋白的腺相关病毒（AAV）注射至大鼠内侧前额叶皮层（mPFC），从外侧 entorhinal 皮层（LEC）制备急性脑片，对 LEC 第5层锥体神经元进行膜片钳记录，以及在 LEC 中通过光刺激激活来自 mPFC 的神经末梢（图1）。

一个健康的锥体细胞被定位并进行了膜片钳记录（例如， 图3A）。在当前的 mPFC 至 LEC 示例中，突触后细胞未被标记；如果需要鉴定突触后细胞，应使用宽场光学方法定位表达荧光标记的细胞（例如， 图3B）。在实验前应使用红外光学评估细胞的健康状态。为激活外侧内嗅皮层（LEC）中的内侧前额叶皮层（mPFC）轴突，将LED直接置于第5层细胞胞体及其近端树突上方 通过 显微镜物镜（

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讨论

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本文所述方案介绍了一种结合立体定位手术递送编码光遗传学元件的腺相关病毒（AAV）与急性脑切片电生理记录的方法，用于研究高度特异性的长距离突触投射（图1）。这些技术相结合，可在传统非特异性电刺激难以触及的长距离且解剖分布弥散的神经通路中，以高精度表征脑环路的生理特性与可塑性。结合细胞特异性分子标记，可进一步实现对从某一脑区投射至另一脑区不同明确定义的细胞群的投射通路进行特征分析23。

为了充分利用该技术的高度精确性，必须验证通路特异性。这需要通过多个步骤完成：在记录过程中，确保所研究的突触为单突触连接（步骤 3.3.5）。随后，通过组织学方法检查注射位点，以确认病毒局限于预期的突触前目标区域，并评估经生物胞素标记的突触后细胞的位置与形态，确保其符合预期。

病毒选择与实现细胞特异性
该技术具有高度可适配性，适用于小鼠和大鼠。需要解剖学特异性的实验可使用野生型啮齿类动物进行。若需要.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由Wellcome基金（资助号：206401/Z/17/Z）支持。我们感谢Zafar Bashir提供的专业指导，以及Clair Booth博士在技术方面给予的协助和对稿件提出的修改意见。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL 离心管Fisher Scientific Ltd12134102
10 µL 移液器GilsonFD10001
24 孔板SARSTEDT83.3922
三通鲁尔阀Cole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物Vector LaboratoriesSK-4105
40倍物镜OlympusLUMPLFLN40XW
4-氨基吡啶Hello BioHB1073
4倍物镜OlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512病毒滴度：3.3×1013 GC/ml
消色差透镜Edmund Optics49363聚焦可见光谱和近红外光
台式微量离心机Benchmark ScientificC1005*
生物胞素Sigma-AldrichB4261
硼硅酸盐玻璃毛细管Warner InstrumentsG150F-6
牙钻头Fine science tools19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
相机 - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
卡巴胆碱Tocris2810
氯己定外科清洗剂VetaseptXHG008
动物毛发剪Andis22445AGC Super 2速可拆卸刀头剪毛器
准直聚光透镜ThorLabsACL2520-A
盖玻片Fisher Scientific Ltd10011913
冷冻切片机LeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
氰基丙烯酸酯胶水Rapid Electronics Ltd84-4557
数据采集设备National InstrumentsUSB-6341 BNC
D-葡萄糖Sigma-AldrichG8270
500 nm 长通二向色镜Edmund Optics69899
600 nm 长通二向色镜Edmund Optics69901
二向色镜立方体ThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore324626
带侧端口的电极夹持器HEKA895150
发射滤光片Chroma59022m
激发滤光片ChromaET570/20x
眼用凝胶DechraLubrithal
细毛刷Scientific Laboratory SuppliesBRU2052
断头器World Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
过氧化氢溶液Sigma-AldrichH100930% (w/w)
异氟烷Henry Schein988-3245
异戊烷Sigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-葡萄糖酸盐Sigma-AldrichG4500
运动学荧光滤光立方体ThorLabsDFM1T1
LED 驱动器ThorLabsLEDD1B
利多卡因软膏Teva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
微型钻机Harvard Apparatus75-1887
微电极拉制仪Sutter instrumentsP-87
微量注射器Hamilton7634-01/00
微量注射器针头Hamilton7803-05定制规格：33号，长度15 mm，尖端类型4 - 12°
微量注射泵World Precision InstrumentsUMP3T-1
安装式蓝色LEDThorLabsM470L5
安装式绿色LEDThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550用于切片的折射红外成像，微分干涉差（DIC）光学是另一种常用方法
OCT 包埋介质VWR InternationalRAYLLAMB/OCT最佳切割温度介质
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148
膜片钳放大器Molecular Devices700A
蠕动泵World Precision InstrumentsMinistar
聚-L-赖氨酸包被的载玻片Fisher Scientific Ltd23-769-310
记录室Warner InstrumentsRC-26G
手术刀片Swann Morton#24
切片固定器Warner InstrumentsSHD-26-GH/15
立体定位仪KopfModel 902
微钻立体定位夹持器Harvard Apparatus75-1874
蔗糖Sigma-AldrichS0389
手术显微镜Carl ZeissOPMI 1 FR pro
缝合线EthiconW577H
细胞内记录液用注射器滤器Thermo Scientific Nalgene171-0020
河豚毒素柠檬酸盐Hello BioHB1035
移液管Fisher Scientific Ltd10458842
吐温 X-100Sigma-AldrichX100
直立式荧光显微镜LeicaDM6 B
含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP 试剂盒Vector LaboratoriesPK-4000
振动切片机Campden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/Version 2.32数据采集软件
溶液
aCSF
蔗糖切割液
PFA
细胞内液？

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nico....

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