一种用于研究大鼠先天性与情境性威胁条件反射的不可逃避猫气味暴露方案

摘要

猫的皮肤/皮毛气味暴露为研究啮齿类动物防御反应的神经回路和机制提供了一种可靠的方法，并可能为揭示介导人类恐惧的机制提供线索。本文中，我们描述了一种研究大鼠内感受皮层在威胁反应中作用的实验方案。

摘要

动物在面对威胁性情境时会表现出多种防御行为，包括回避、僵直和风险评估。采用具有生态学意义的动物模型有助于深入理解威胁反应背后的生物学机制。本文描述了一种用于测量大鼠对先天性和后天性厌恶刺激产生防御行为的方法。实验中，将动物单独置于一个无法逃脱的环境中，暴露于捕食者气味，以诱发可测量且持续的防御状态。实验设计包括：先将大鼠置于熟悉的环境中10分钟，随后在同一环境中暴露于猫的气味10分钟。次日，大鼠再次被置于同一环境（即先前暴露于猫气味的环境）中10分钟。两次实验过程均进行录像，并对两天中的防御行为进行评估。

通过结合可逆性功能失活和c-Fos免疫组织化学技术，对内感受皮层在威胁反应中的作用进行了行为学检测。大鼠在第一天暴露于猫的气味，并在第二天重新暴露于相同的情境环境中时，表现出更高水平的防御性行为，且猫的气味显著增强了内感受皮层的神经活动。此外，利用蝇蕈醇（muscimol）对内感受皮层进行失活处理，可减少由猫气味引发的防御性行为表达，并损害情境性威胁记忆。这些结果表明，该行为检测方法是研究防御性行为神经机制的有效工具，可能为理解人类恐惧及其相关障碍的介导机制提供重要线索。

引言

防御行为是在面对可能威胁动物生存的刺激时产生的反应。这类行为在哺乳动物中高度保守，并能迅速与威胁相关的刺激或情境建立关联^1,2,3。在自然界中，大多数动物面临的威胁性刺激来自捕食者；因此，检测捕食者线索（如气味线索）对于避免被捕食具有显著优势。啮齿类动物对捕食者线索的行为反应已被广泛研究。

例如，自然刺激物（如猫的皮毛或皮肤气味）会激活嗅觉系统和副嗅觉系统，引发强烈的防御性行为⁴。这些刺激伴随着神经元和内分泌活动的变化^5,6,7,8, 并对大鼠产生强烈的非条件性厌恶刺激作用，可用于情境性威胁条件化实验^7,8,9,10,11。研究表明，大鼠在接触天然捕食者线索后至少24小时，仍表现出显著且持久的条件性焦虑样状态^7,12,13。这一现象对于建立更贴近现实的创伤后应激障碍（PTSD）^14,15,16,17、广泛性焦虑障碍（GAD）⁵以及惊恐障碍（PD）^18,19模型具有重要意义。

在实验室环境中，恐惧行为通常通过逃跑、回避（例如退缩、躲藏）或僵直来衡量。此外，焦虑可通过伸展姿势以及朝向捕食性刺激的警觉性扫描来测量，这类反应统称为风险评估行为^6,9,20。研究表明，面对无法逃避的威胁时，僵直行为是大鼠主要的防御策略；而当威胁具有不确定性或空间位置不明确时，则更常观察到风险评估行为^12,21,32。尽管已知先天性或后天习得的刺激均可引发防御行为，但目前仍缺乏能够可靠地在更接近自然行为学背景下捕捉防御反应的实验室行为范式。为填补这一空白，我们设计了一种基于行为生态学原理的实验方案，可用于测量持续性的先天性和情境性威胁行为，同时记录大脑对自然化威胁刺激的反应。

应激性经历（例如暴露于无法逃避的捕食者气味）会导致大鼠行为和生理反应发生持久性改变^14,22,23。这些改变反映了创伤后应激障碍（PTSD）等恐惧和焦虑相关疾病中观察到的症状特征。在本模型中，使用无安全藏身处的测试装置使大鼠暴露于无法逃避的威胁事件，从而增强其防御性反应。大鼠在猫的气味以及测试环境刺激下均表现出显著的僵直反应和风险评估行为。这些结果支持将该实验方案作为研究防御行为潜在生物学机制的可靠且有效的方法，并可用于开发和优化针对人类恐惧障碍的新型治疗策略。

方案

以下实验程序遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, USA）《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第80-23号，1996年修订版）的机构指导原则。所有实验操作均获得智利天主教大学（Pontificia Universidad Católica de Chile）机构生物安全与伦理委员会批准。所有实验均在大鼠的活跃期（暗期）进行。

1. 测试房间和测试舱的准备

注意：装置的概览如图1所示。测试室根据先前的研究进行了设计和改进^24,25。

1. 使用一个透明的矩形聚甲基丙烯酸甲酯测试箱，其尺寸为：60 cm（长）× 40 cm（宽）× 40 cm（高）。用黑色纸张覆盖测试箱的侧壁和后壁。确保测试箱的正面保持透明，以便记录动物的行为。
2. 在测试箱右下角的底部地面上固定一个钢制支架，并用其在测试过程中固定猫项圈。
3. 每次测试前后均使用5%（v/v）乙醇清洁测试箱，以清除受试大鼠留下的任何气味线索，避免引发大鼠的厌恶反应。每次测试间隔应留出5分钟，使乙醇充分挥发。
4. 在安静的房间内进行测试，测试箱上方20 cm处使用一个80 W的红光灯泡提供微弱照明。在测试箱正前方放置一台摄像机，用于记录动物的行为。

图1：测试箱的示意图概览。 该装置包含一个测试隔室，其结构包括：(1) 通风孔，(2) 侧面，以及 (3) 背面墙壁涂暗，左下角地面固定有一个钢制支架 (4)，用于连接猫项圈（尺寸：宽 15 mm，厚 5 mm，长 300 mm）。图中所示为箱体尺寸（60 L × 40 W × 40 H cm）。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 猫气味的制备

1. 使用内衬为毛毡的猫项圈，以更好地收集和保留猫的气味。确保准备多个项圈，用于作为对照项圈（无气味）或测试项圈（含猫气味）。
   注意：关键在于猫项圈必须具有内衬，以便收集和保留气味。
2. 将项圈佩戴在一只已切除卵巢的家猫雌性个体上，并让其佩戴一周后再进行测试。在佩戴测试项圈期间，尽量让该雌性猫待在室内。
   注意：整个研究过程中应使用同一只猫。
3. 将使用过的猫项圈保存在密封的塑料容器中，并置于 4 °C 环境下储存。每三天更换一次使用过的项圈，换上含有新鲜猫气味的新项圈。

3. 实验操作前大鼠的准备

1. 使用体重为270–290 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠，单笼饲养，自由摄食和饮水 随意摄取.
2. [可选] 大鼠手术前准备（可选）
   1. 在无菌条件下进行手术。使用70%乙醇溶液清洁并消毒操作区域，并对所有手术材料和器械进行灭菌。
   2. 用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）的混合物对大鼠进行腹腔注射麻醉。待麻醉深度达到合适水平，即大鼠对足趾夹捏刺激或角膜刺激无反应时，开始操作。为在整个手术过程中维持麻醉状态，每45分钟追加一次麻醉混合剂。
   3. 从耳后至两眼之间轻轻剃除大鼠头部毛发，使用无菌酒精棉片对术区进行消毒，随后使用聚维酮碘溶液消毒。涂抹润滑性眼膏，以防止手术过程中角膜干燥。
   4. 将大鼠置于立体定位仪中，通过将耳杆正确插入耳道来固定头部。然后，将大鼠的门齿轻轻插入门齿杆，并固定鼻部夹。
   5. 将一根无菌的26 G不锈钢导向套管置于立体定位仪夹持器中。使用手术刀沿头皮正中线做一切口。在切口周围（2–3 cm范围内）放置2个或更多止血钳。
   6. 完全清除颅骨上的组织，直至颅骨的前囟和人字缝均清晰可见。
   7. 使用门齿杆和耳杆分别校准颅骨的背腹轴和前后轴，以验证头部位置的对称性。确定目标脑区导管套管的坐标。通过调节门齿杆使前囟（bregma）和后囟（lambda）保持在同一水平面上。
   8. 根据 Paxinos 和 Watson 的脑立体定位坐标，计算引导套管植入目标脑区的坐标²⁶ 或斯旺森脑图谱²⁷.
      注意：对于主要内感受性岛叶皮层，采用以下立体定位坐标：前囟后0.51 mm，中线外侧5.0 mm，颅骨表面下4.5 mm，相对于垂直方向向内倾斜10°。
   9. 通过将引导套管向下移动直至接触颅骨，确认其植入坐标，然后在已确认的位置钻穿颅骨形成孔洞。在目标区域周围再钻3个孔，用于将3枚螺钉固定于颅骨中。
   10. 将套管插入目标脑区，使用螺丝和牙科丙烯酸树脂将套管固定于颅骨。将牙科丙烯酸树脂涂抹于干燥的颅骨表面，确保其覆盖螺丝以牢固固定套管。待丙烯酸树脂完全硬化后，小心移除立体定位仪臂，保留导向套管在位。
       注意：该步骤可固定植入的套管，使实验人员能够在目标区域进行多次微量注射。
   11. 将不锈钢芯针插入导向套管，以避免堵塞和污染。
   12. 手术结束时，给予单次剂量的抗生素（恩诺沙星 5%；19 mg/kg，腹腔注射）和抗炎药（酮芬 0.2 mg/kg，腹腔注射）。术后连续三天重复此步骤。
   13. 让大鼠在开始实验前至少恢复一周。
3. 将大鼠置于反向12/12小时光照/黑暗循环（光照开启时间为晚上7:00）下饲养，至少在实验开始前十天进行此光照调节图2).
   注意：如果实验人员需要进行任何手术操作，必须在反转光暗周期之前完成。这有助于减少术后应激反应。
4. 每天对所有大鼠进行 20 分钟的手动操作，持续 2–3 天。每次取一只大鼠，用手牢固地抓住其躯干（不要抓尾巴），并在该过程中抚摸它们。如果动物表现出应激迹象，则延长操作时间。
   注意：此步骤对于尽量减少操作应激至关重要，因为应激可能影响后续步骤。
5. 实验前3天，每天让动物在测试箱（含未使用过的猫项圈的猫气味箱）中适应30分钟，以使其熟悉测试环境。
   注意：建议实验人员不要使用有香味的香水或润肤露。
6. 将动物放入实验舱后，等待约10-15分钟，将手臂伸入测试舱内，更换为另一条具有相同特征的猫项圈。
   注意：此步骤至关重要，应尽可能准确地模拟行为实验的每一步操作，以最大限度地减少应激反应，避免影响大鼠在测试最后10分钟内的行为表现。
7. 每次实验间隔用5%（v/v）乙醇清洁测试室。

图2：实验设计时间线。 大鼠首先暴露于反转的明暗循环条件下10天，随后在最后三天内每天在测试箱中适应30分钟，测试箱中放置一个对照（未佩戴过的）猫项圈。在第0天，大鼠首先在熟悉的测试环境中（CONTEXT）暴露10分钟，随后在同一环境中暴露于带有或不带猫气味的项圈，持续额外10分钟（TEST）。在第1天，第0天曾暴露于猫气味（TEST）的大鼠被再次放入相同的测试箱中10分钟（CONTEXT），并再次暴露于猫气味（RETEST）额外10分钟。本图经⁸修改。缩写：R-Dark/light = 反转明暗循环。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 猫气味测试流程

1. 在实验方案的第0天，评估动物对猫科动物气味的威胁反应。
2. 如有必要，按照下述方法在行为学测试前进行皮层注射。若仅执行行为学实验，则跳过此步骤，直接进入步骤4.3。
   1. 移除堵头后，将连接至1 µL Hamilton注射器的无菌33 G注射套管插入导向套管中。
   2. 用无菌生理盐水（对照组大鼠）或GABA-A受体激动剂蝇蕈醇（处理组大鼠）填充Hamilton注射器，每侧半球注射0.5 µL，持续2分钟。注射后等待2分钟以使药物充分扩散，缓慢撤出注射套管，立即插入堵头。
      注意：此步骤应在安静环境中对清醒动物进行，缓慢注射药物以尽量减少注射套管的抖动，避免药物扩散至邻近脑区。
   3. 完成每侧半球的皮层注射后，等待30分钟，再进入下一步。
3. 将动物放入测试箱中持续20分钟。前10分钟内，给予动物一个未使用过的熟悉项圈作为暴露刺激；随后的10分钟内，引入浸有猫科动物气味的项圈（TEST）或另一个未使用过的熟悉项圈（CONTEXT）（图3）。

图 3：猫的气味暴露增加先天性防御行为。（A, B）大鼠首先在熟悉的测试环境中（CONTEXT）暴露10分钟，随后在同一环境中，额外暴露于带有猫气味的项圈（猫气味组，黑色圆圈）或无猫气味的项圈（无气味组，空心圆圈）10分钟（TEST）。圆圈表示 naïve 大鼠表现出的僵直行为（B）和风险评估行为（C）所占时间的百分比。数据以均值±标准误（SEM）表示。*p < 0.05。本图经修改自⁸。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 将摄像机放置在测试箱前方，记录动物的行为，供后续由不了解实验条件的实验人员进行行为评分。
5. 猫气味实验阶段结束后，将动物放回其饲养笼中，并送回动物饲养室，直至下一次实验阶段。
6. 每次实验之间用5% (v/v) 乙醇清洁测试箱。
7. 在猫气味实验阶段24小时后（第1天），评估动物对测试环境的防御性反应。
8. 如有需要，在环境暴露前重复步骤4.2。
9. 将大鼠放回相同的测试箱中，放置未佩戴过的熟悉项圈，记录其在10分钟内的防御性行为，以评估情境性威胁记忆（图4）。
10. 将摄像机放置在测试箱前方，记录动物的行为，供后续由不了解实验条件的实验人员进行行为评分。
11. 在接下来的10分钟内，更换为未佩戴过的熟悉项圈，重新向动物暴露带有猫气味的项圈，并记录其防御性行为。
12. 第二次暴露于猫气味后，将动物放回其饲养笼中，并用5% (v/v) 乙醇清洁测试箱，然后将大鼠送回动物饲养室。

图 4：猫的气味接触引发情境性威胁学习。 圆圈表示僵直行为（黑圈）和风险评估行为（灰圈）所占的时间百分比。虚线将先天恐惧测试（第0天，左侧）与情境恐惧测试（第1天，右侧）分开。数据以均值 + 标准误（SEM）表示。*p < 0.05。该图改编自⁸。请点击此处查看此图的放大版本。

5. 免疫组织化学实验步骤

1. 在实验完成后90分钟，通过腹腔注射混合物（氯胺酮0.45 mg/kg和赛拉嗪0.05 mg/kg）对动物进行麻醉。随后通过心脏灌注4%多聚甲醛处死大鼠。
   注意：如果需要评估首次猫气味暴露、对环境的条件化反应或再次暴露于猫气味的情况，请在每种实验情境后执行此步骤。操作时应佩戴手套和实验服，并在通风橱中小心处理多聚甲醛。
2. 灌注后，将脑组织置于相同的固定液中固定2小时，然后转移至含0.02%叠氮化钠的30%蔗糖磷酸盐缓冲液（PBS）中，直至脑组织沉降至底部。将脑组织保存于4 °C条件下。
3. 使用干冰冷冻脑组织，并在滑动式切片机上将其切成50 µm厚的连续冠状切片。收集三套目标脑区的切片，其中一套用于验证套管植入位置，另两套用于免疫组织化学染色。
4. 将游离脑切片在含0.3% H₂O₂的PBS溶液中孵育30分钟，用PBS洗涤后，转移至封闭液（含0.4% Triton X-100、0.02%叠氮化钠和3%正常山羊血清的PBS溶液）中，室温孵育1小时。
5. 将切片转移至一抗孵育液中，其中c-Fos抗体以1:20,000比例溶于封闭液，室温下孵育过夜。
6. 用PBS冲洗切片1小时，然后将其置于二抗溶液中孵育，二抗以1:1,000比例溶于含0.4% Triton X-100和1.5%正常山羊血清的PBS溶液中。
7. 再次用PBS冲洗切片40分钟，随后在亲和素/生物素-过氧化物酶复合物系统（见材料表）中孵育1小时，该系统以1:500比例溶于PBS。
8. 冲洗切片后，将其置于含0.003% H₂O₂和0.05%氯化镍的0.05% 3,3′-二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）溶液中孵育，以获得深蓝色反应产物。

6. 细胞计数

1. 使用低倍（10x）物镜结合实体镜观察切片，定位神经元细胞核内c-Fos的点状染色（图5）。
2. 根据目标区域的大小使用相应的计数网格。例如，在pIC区域，从前囟0.95 mm至-0.26 mm处使用0.25 mm × 1 mm的计数网格；从前囟-0.51 mm至-2.45 mm处使用0.5 mm × 1 mm的计数网格。
3. 使用数字手动计数器定量每张切片中c-Fos免疫反应阳性（Fos-ir）细胞的数量。
4. 对所有感兴趣的冠状切片重复计数两次，并确保由同一名观察者在不知晓实验分组的情况下完成计数。
5. 使用连接数字相机的显微镜拍摄照片。

图 5：猫气味引起初级内感受皮层的神经元激活。（A）pIC的代表性显微照片显示，暴露于未佩戴过的猫项圈（无气味，左侧）的大鼠中c-Fos-ir细胞（黑色箭头）几乎缺失，而暴露于猫气味的大鼠中c-Fos-ir细胞数量显著增加（右侧）。（B）两种实验条件下pIC中c-Fos-ir细胞的定量分析。数据以均值 + 标准误（SEM）表示。*p < 0.05。比例尺 = 200 µm。本图改编自⁸。缩写：pIC = 初级内感受皮层；c-fos-ir = c-Fos免疫反应性。 请点击此处查看此图的放大版本。

7. 数据分析

1. 从视频记录的实验中评分防御行为，并使用统计软件进行分析。
2. 通过计时冻结行为来评估冻结反应，以10分钟内发生冻结的时间百分比表示。使用公式（Eq）计算冻结百分比1).
   冻结率 = （冻结持续时间（秒）/ 600 秒）× 1001)
   注：冻结定义为除呼吸外完全无运动，且持续至少1秒²⁸.
3. 通过记录警觉性扫描行为的持续时间来评估风险，并将其表示为10分钟内用于风险评估的时间百分比。使用公式（Eq）计算风险评估的百分比2).
   % 风险评估 =（用于风险评估的时间（秒）/ 600 秒）× 1002)
   注意：风险评估行为定义为至少持续1秒的警觉性扫描（观察性、左右头部运动，无移动）²⁹.
4. 手动评分这些行为参数，并确保由对实验条件（即气味和药物条件）设盲的实验人员进行计数。根据数据集的正态性，采用参数检验或非参数检验来比较两组或多组。
   注意：本研究中所有统计检验均使用 SPSS 软件进行。
   1. 使用Kruskal-Wallis检验 H-使用Mann-Whitney检验 U- 组间两两比较的检验。
   2. 使用Friedman检验分析组内随时间变化的比较，随后采用Wilcoxon符号秩检验进行两两比较。
      注意：在所有图示中，显著性水平设定为 p < 0.05 (*) 和 p < 0.01 (**).
5. 为分析特定脑区中 c-Fos 的表达，通过计算每平方毫米内 c-Fos 免疫反应阳性细胞的密度，统计每张切片中 c-Fos 阳性细胞的数量²，并比较对照组（无气味）与刺激组（猫气味）之间的平均数量。
   1. 根据数据的正态性，使用非配对学生t检验 tt检验或Mann-Whitney检验 U-测试。
      注意：在本研究中，采用曼-惠特尼（Mann-Whitney）检验 U采用检验；若 p 值小于0.05，则认为差异具有统计学意义 < 0.05 (*).

结果

在本实验方案中，分别通过测量大鼠的僵直百分比和风险评估百分比来评估其恐惧和类焦虑状态。实验设计的时间线见图2。第0天暴露于猫气味的动物实验结果见图3。大鼠在面对猫气味（TEST）时，其僵直水平显著高于熟悉环境（CONTEXT）（图2A，猫气味组，Wilcoxon符号秩检验，Z = -2.201，p = 0.028），风险评估水平也显著升高（图2B，猫气味组，Wilcoxon符号秩检验，Z = -2.336，p = 0.018）。在测试的第二阶段暴露于未佩戴过的项圈的大鼠中，僵直水平较低（图2A，无气味组，Wilcoxon符号秩检验，Z = -0.184，p = 0.854），风险评估水平也较低（图2B，无气味组，Wilcoxon符号秩检验，Z = -1.753，p = 0.08）。

进一步分析显示，在测试的第二阶段，猫气味组的僵直水平（图2A，Mann-Whitney检验，U = 0.000，p = 0.004）和风险评估行为（图2B，Mann-Whitney检验，U = 4.000，p = 0.025）均高于无气味组。在暴露于熟悉环境（CONTEXT）的前10分钟内，两组之间的僵直水平（图2A，Mann-Whitney检验，U = 11.000，p = 0.256）和风险评估行为（图2B，Mann-Whitney检验，U = 15.00，p = 0.627）无显著差异。这些结果表明，该方案适用于检测对猫毛/皮肤气味引发的防御性行为。

第1天对测试环境（CONTEXT）的条件性威胁反应如图4所示。暴露于猫气味的大鼠在首次接触捕食者气味后24小时被放回测试箱。在第1天，动物对测试环境表现出比第0天更高的僵直反应（Wilcoxon符号秩检验，Z = -2.366，p = 0.018）和风险评估水平（Wilcoxon符号秩检验，Z = -2.201，p = 0.028）。此外，CONTEXT与RETEST阶段之间的僵直反应（Wilcoxon符号秩检验，Z = -0.841，p = 0.400）或风险评估水平（Wilcoxon符号秩检验，Z = -0.943，p = 0.345）无显著差异。大鼠在RETEST和TEST阶段的僵直反应（Wilcoxon符号秩检验，Z = -0.105，p = 0.917）和风险评估（Wilcoxon符号秩检验，Z = -0.980，p = 0.327）水平保持一致。这些结果表明，单次10分钟的猫毛/皮肤气味暴露即可导致动物对曾遭遇捕食者气味的环境产生习得性威胁反应。

图5 和 图6 展示了使用本文所述方案进行的两组实验。我们检测了初级内感受皮层（pIC）——一个参与情绪处理的脑区^8,30,31,32——是否对防御行为的表达具有必要性。通过在不同动物组（无气味组和猫气味组）中计数c-Fos-ir细胞，评估由猫气味诱导的pIC神经元激活情况。这些大鼠在完成测试后90分钟被实施安乐死。与对照组相比，猫气味组pIC中c-Fos-ir神经元数量显著增加（Mann-Whitney检验，U = 3.000，p = 0.016）（图5）。

图6：初级内感受皮层中蝇蕈醇失活会损害情境性威胁记忆。（A, B）处理组在第0天向初级内感受皮层（pIC）注射生理盐水，第1天注射蝇蕈醇（处理组）。对照组大鼠在两天均于pIC注射生理盐水。第1天，动物被放回熟悉的测试箱中，暴露于情境（CONTEXT）10分钟，随后再次暴露于猫的气味（RETEST）额外10分钟。圆圈表示僵直行为（黑圈）和风险评估行为（空心圈）所占的时间百分比。虚线将先天恐惧测试（第0天，左侧）与情境恐惧测试（第1天，右侧）分开。数据以均值±标准误（SEM）表示。*p < 0.05。本图经修改自⁸。缩写：pIC = 初级内感受皮层；Sal-Sal = 第0天和第1天均注射生理盐水；Sal-Mus = 第0天注射生理盐水，第1天注射蝇蕈醇。请点击此处查看此图的放大版本。

我们还测量了pIC区注射蝇蕈醇（muscimol）失活后对情境性威胁记忆的影响（图6）。处理组（sal-mus大鼠）在第0天向pIC区注射生理盐水，第1天注射GABA-A受体激动剂蝇蕈醇。该组动物在第1天暴露于熟悉环境时，其僵直反应（图6A，Wilcoxon符号秩检验，Z = -0.140，p = 0.889）和风险评估行为（图6B，Wilcoxon符号秩检验，Z = -0.700，p = 0.484）与第0天相比无显著差异，表明其情境性威胁记忆受损。有趣的是，在RETEST阶段与TEST阶段相比，僵直反应显著降低（图6A，Wilcoxon符号秩检验，Z = -2.100，p = 0.036），而风险评估行为未见显著变化（图6B，Wilcoxon符号秩检验，Z = -0.980，p = 0.327）。这一结果表明，在第1天抑制pIC区活动选择性地损害了对捕食者气味的恐惧反应，但未影响焦虑样行为。综上所述，这些结果支持上述实验方案适用于研究对捕食性威胁的先天性和习得性防御反应。

讨论

本文所述方案提供了一种创新方法，用于评估由先天性和习得性厌恶刺激引发的防御行为。通过使用一种没有安全藏身处的测试装置（图1）以及浸有已切除卵巢的家猫皮肤/皮毛气味的颈圈，可在大鼠中诱发强烈且持续的威胁状态，该模型可能有助于研究介导适应性和非适应性防御反应的神经环路。

众所周知，特定防御反应的表现取决于威胁刺激的特征以及动物所处的情境或环境^21,33。回避、风险评估和僵直是动物在受到威胁刺激时可能引发的多种防御反应中的一部分^9,19。然而，主要防御反应的选择取决于环境条件，例如与威胁的距离³³，或测试箱内是否存在安全区域^21,33。例如，当大鼠被放置在带有躲避箱的开放区域中并暴露于猫的气味时，会表现出伸展/警觉姿势、探头出躲避箱以及回避等防御行为^6,24,25。相反，在无法逃脱且与威胁距离并非过近的情况下，僵直行为、警觉性扫描以及伸展/警觉姿势则会被强烈诱发^33,34。

研究表明，暴露于不可控应激源会产生多种行为后果，这些后果与应激源可控时所引起的行为变化有所不同^35,36,37,38. 例如，不可逃避的尾部电击会导致背缝核内5-羟色胺水平显著升高，而可逃避的尾部电击则不会产生此种效应³⁵ 在厌恶经历后24小时测量的类似焦虑行为³⁶此外，不可控的压力源会增强动物的恐惧条件反射^36,37 和人类³⁸我们最初制定该实验方案的目的是使大鼠暴露于一种无法控制厌恶刺激的情境中，从而在单次短暂接触猫科动物气味后，表现出强烈且持续的威胁反应，并增强情境学习能力。

在本实验设计中，由于缺乏藏身处，大鼠表现出强烈且持续的防御状态，该状态在静止不动（即除呼吸外完全不动²⁸）和风险评估（即警觉性扫描以及伸展/关注姿势²⁹）行为之间交替出现，这两种行为通常分别被视为啮齿类动物恐惧和类焦虑状态的行为表现（图3）。值得注意的是，当大鼠在24小时后再次暴露于测试环境中时，仍出现相同的防御反应模式，表明单次10分钟的猫毛/皮肤气味暴露足以诱导持久的情境性威胁学习，这与先前报道的结果一致^{7,10,11,14,15,34,39}（图4）。

使用带有内部毛毡衬里的猫项圈来高效收集和捕获气味，从而获得可靠的威胁刺激样本，以诱发强烈的防御反应。研究人员在类似研究中曾使用厌恶刺激，如猫的粪便、尿液或三甲基噻唑啉（TMT，狐狸粪便中的一种成分）。然而，这些刺激对捕食者即时存在的预测性似乎较低，因为它们在诱导情境学习方面能力较弱^40,41。根据以往的研究结果^{2,4,8,9,10,11,20,34,39}，猫的气味是一种可靠的先天性厌恶刺激，可在大鼠中诱导持续的防御反应和情境性威胁记忆。多年来，这类基于动物行为学的动物模型日益引起研究人员的兴趣，被用于研究压力及相关应激障碍^{13,14,15,16,17,23,42}，例如与适应不良的恐惧记忆相关的创伤后应激障碍（PTSD）。

本方案旨在与多种实验技术结合使用，例如分子生物学和细胞生物学方法，以及在清醒且行为自主的动物中进行的电生理学研究，这些技术为回答尚未解决的科学问题、加深我们对适应性和非适应性威胁反应的理解提供了机会。在本研究中，我们验证了以下假设：参与情绪处理的脑区——后岛皮层（pIC），对于防御性行为的表达是必需的。行为学实验与c-Fos免疫组织化学相结合，用于绘制pIC在猫气味刺激以及脑内灌注GABA-A受体激动剂蝇蕈醇（muscimol）条件下神经元活动的变化模式；其中蝇蕈醇用于可逆性地抑制pIC活性，以确定该脑区在对捕食者气味产生的先天性和习得性威胁反应中的作用。研究结果表明，猫气味可诱导pIC神经元活动显著增强（图5），而抑制pIC则导致情境性威胁记忆严重受损（图6）。

尽管此处描述的实验方案在技术上易于实施和操作，但仍可能出现一些问题。例如，如果未佩戴过的项圈与已佩戴过的猫项圈发生接触，可能会导致猫气味的交叉污染。因此，在所有操作过程中必须将项圈分开存放，并且在将已佩戴过的项圈放入测试箱后应更换手套。如果实验者希望在同一测试箱中进行有气味和无气味条件的实验，则必须在不同的日期进行。这些实验可使用两个完全相同的测试箱³⁴，并且应将大鼠饲养在不同的房间内，以避免社会性交流⁴³。动物暴露于陌生环境中新异刺激所引发的压力也可能是一个问题。因此，动物必须至少经过三天对测试环境和操作流程的适应期，以减少大鼠在新环境中通常表现出的压力和防御行为。此外，适应期的时间应长于正式测试的时间。例如，如果测试持续10分钟，则适应期应设定为20或30分钟。

最后，防御行为的评估应优先在昼夜周期的黑暗阶段进行，因为此时大鼠处于活跃期。必须将大鼠维持在反转的明暗周期下，以便实验操作能够在大鼠和实验人员均处于各自活跃期的情况下进行³⁴。明暗周期的调整最多不超过10天即可稳定，根据经验，在此条件下大多数大鼠对猫的气味能够产生适当的反应。然而，也有少数研究表明，Sprague-Dawley大鼠相较于Wistar大鼠对长期威胁性条件刺激和焦虑更为不敏感⁴⁴。因此，使用Wistar大鼠而非Sprague-Dawley品系大鼠可能会获得更显著的实验结果。

综上所述，猫的气味是一种符合动物行为学意义的威胁性刺激，能够引发大鼠可靠的神经元、内分泌及行为反应。在无法逃避的环境中接触猫的气味会导致大鼠产生强烈且持久的恐惧/焦虑反应，从而实现快速而持久的情境性威胁记忆学习。上述实验方案可作为研究恐惧反应以及适应性和非适应性威胁记忆编码机制的有用工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-3′ 二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）	Bio-Rad		比色印迹底物；与辣根过氧化物酶标记的抗体联用
密封塑料容器	commercial		用于储存猫项圈
猫项圈	commercial		尺寸：宽 1.5 cm，厚 0.5 cm，长 30 cm
猫气味	家猫		经卵巢切除的室内外雌性家猫，饲喂常规商业猫粮。
恩诺沙星 5%	Bayer		抗生素（19 mg/kg，腹腔注射），用于手术方案
乙醇	Sigma-Aldrich		5% v/v，用于清洁测试箱
引导套管	Plastic One		26 号规格。由围绕一段不锈钢管模制而成的带螺纹圆柱形塑料基座构成，根据立体定位坐标植入脑内特定靶区。
哈密尔顿微量注射器	Sigma-Aldrich		1 µL，用于失活实验方案
过氧化氢 30%	Merck Millipore		用于免疫组织化学实验步骤
注射套管	Plastic One		33 号规格。该套管插入引导套管中，用于向脑内特定靶区输送液体。
氯胺酮（Imalgene）	Rhodia Merieux		镇静剂（100 mg/kg，腹腔注射），用于手术和免疫组织化学实验方案
酮洛芬 1%	Rhodia Merieux		抗炎药（0.2 mg/kg，腹腔注射），用于手术方案
雄性大鼠	智利天主教大学（Universidad Catòlica de Chile）		SD 品系（270–290 g）
机械式手动数字计数器	commercial		用于细胞计数
蝇蕈醇（Muscimol）	Sigma-Aldrich		0.5 µg/µL，注入局部脑区
正常山羊血清	Life Technologies		用于免疫组织化学实验步骤
封闭套管	Plastic One		插入引导套管以密封之，防止注射后组织液外流
多聚甲醛粉末	Sigma-Aldrich		用于组织固定
PBS 10x，pH 7.4	Life Technologies		用于免疫组织化学实验步骤
一抗	Sigma, St Louis		兔多克隆抗体 F7799，用于免疫组织化学实验
红色灯泡（80 瓦）	Crompton		用于行为学实验方案
螺钉	Plastic One		用于手术方案中将引导套管固定于颅骨
二抗	Jackson Immunoresearch		抗兔 IgG（H+L），用于免疫组织化学实验
单剂量无菌生理盐水 0.9%	SalJet		0.5 µg/µL，注入局部脑区
叠氮化钠	Sigma-Aldrich		用于免疫组织化学实验步骤
SPSS for Windows	IBM		版本 20.0，用于统计数据分析的软件
立体定位仪	Kopf		用于手术方案
透明聚甲基丙烯酸甲酯矩形腔室	自制		60 × 40 × 40 cm（长 × 宽 × 高）；透明聚（甲基丙烯酸甲酯）矩形腔室
吐温 X-100	Merck Millipore		用于免疫组织化学实验步骤
Vectastain ABC Elite 试剂盒	Vector Laboratories		基于亲和素/生物素的辣根过氧化物酶系统，用于检测生物素标记的二抗
摄像机	Sony		建议使用夜视摄像机
赛拉嗪（Xylazine, Rompun）	Bayer		镇静剂（20 mg/kg，腹腔注射），用于手术和免疫组织化学实验方案