在体 无线光遗传学控制精细运动行为

摘要

本实验方案描述了如何在自由活动的小鼠中，将无线光遗传学技术与高速视频记录相结合，用于单颗粒取食抓握任务，以表征参与精细运动行为的神经环路。

摘要

精细运动技能在日常生活中至关重要，而在多种神经系统疾病中可能受损。这些技能的习得与执行需要感觉-运动整合，并涉及对大脑双侧回路的精确控制。在动物模型中实施单侧肢体行为范式，将有助于深入理解脑结构（如纹状体）在复杂运动行为中的作用，因为它允许在任务执行过程中对正常条件和疾病状态下特定核团的神经活动进行操控和记录。

自创建以来，光遗传学已成为研究大脑的主要工具，能够选择性地靶向激活或抑制特定神经元群体。将光遗传学与行为学检测相结合，有助于揭示特定脑功能的潜在机制。采用微型发光二极管（LED）的无线头戴式系统可在完全自由活动的动物中实现远程光遗传控制，克服了有线系统对动物行为限制较多的问题，同时不降低光发射效率。本实验方案将无线光遗传学方法与高速视频记录技术结合，应用于单手上肢灵巧性任务中，以解析特定神经元群体对精细运动行为的贡献。

引言

大多数由我们完成的动作都包含运动技能行为，已知这种行为会受到多种脑部疾病的影响^1,2,3,4,5,6。实施能够研究技能性动作发展、学习和表现的任务，对于理解运动功能的神经生物学基础至关重要，尤其是在脑损伤、神经退行性疾病和神经发育障碍的模型中^{2,7,8,9,10,11,12,13}。伸手抓取和取回物体是日常生活中常见的动作，也是早期发育过程中最先获得的运动技能之一，并在随后的岁月中不断精细化

方案

涉及动物使用的实验程序均遵循当地及国家指导原则，并经相应的机构动物护理与使用委员会批准（细胞生理研究所动物护理与使用委员会方案编号：VLH151-19）。Drd1-Cre 转基因雄性小鼠²⁷，出生后35-40天、C57BL/6背景的小鼠用于本方案。小鼠饲养条件如下：温度22±1 °C，湿度55%，光照周期12/12小时，晚上7点关灯，出生后第21天断奶。断奶后幼鼠按性别分组，每组2-5只同笼饲养。 动物饲养在带有微屏障盖的静态饲养盒中。垫料为无菌白杨木屑。啮齿类动物颗粒饲料 并提供RO纯化水 随意摄取，除非另有说明。

1. 手术操作

1. 根据目标脑区的背腹向坐标准备适当长度的LED光纤套管（理想情况下比实际深度长0.5 mm以补偿颅骨厚度，例如背外侧纹状体为3.5 mm）（图1）。
   1. 将玻璃光纤裁剪至略长于最终所需长度，使用粗砂纸将光纤尖端研磨至目标长度，最后用细砂纸抛光光纤尖端。
      注意：LED光纤套管是一种直径为250 µm的玻璃光纤，连接有红外接收器（见材料表）。
2. 使用水平拉制仪（见材料表）制备玻璃移液管（外径1.14 mm....

结果

抓取任务是一种广泛用于研究在不同实验操控条件下精细技能运动的形成、学习、表现及运动学特征的范式。小鼠在几天内即可学会执行该任务，并在训练5天后达到超过55%的准确率，进入平台期（图2A，B）。与先前报道结果相似，部分动物无法正确执行任务（占29.62%），应将其排除在后续分析之外³⁰。其中包含一类非学习型小鼠（54只中有6只，占11.1%），它们从训练初期即未能命中目标，抓取时与食丸距离过远，或在尚未到达食丸正上方的正确位置时便提前执行抓取动作。在训练初期，另一组小鼠能以较高准确率完成任务，但从第3至4天起开始表现变差，抓取位置逐渐偏离食丸（54只中有10只，占18.51%）。在此群体中，部分小鼠起初使用偏好爪进行训练，但在数天后改变了爪的偏好；这一现象此前已被Chen等（2014）讨论过³⁰。

伸手抓取动作在不同试验之间以及动物个体内部均具有高度的刻板性（

讨论

在明确定义的行为范式中，利用光遗传学操控神经元群体正在推动我们对运动控制机制的理解^7,23。无线方法特别适用于需要对多个动物进行测试或自由活动的任务^34,35。随着技术与设备的不断优化，任何结合光遗传学的行为实验都应优先选择无线方法^34,36。

目前的方法具有多种优势，因为微型LED可提供高强度的稳定光源，且植入物可用于需要持续数天刺激的研究。然而，插入用于视蛋白刺激的光纤可能会对脑组织造成机械性损伤，在套管所在位置引发感染，偶尔还会导致炎症³⁷。长期高频的光遗传学刺激已被证明会产生热量，可能导致光毒性³⁷。通过使用红移效应视蛋白（这类视蛋.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉机	RWD	R583S	异氟烷蒸发器
Anesket	PiSA		氯胺酮
光学实验平台	Thorlabs	MB3090/M	实心铝制光学面包板
相机镜头	Canon		50mm f/1.4 手动对焦镜头（C接口）
相机系统	BrainVision	MiCAM02	相机控制器和同步器
棉签
CS溶液	PiSA		9%氯化钠溶液
定制训练舱	自制
钻头#105	Dremel	2 615 010 5AE	雕刻刀头
无尘精密巧克力颗粒	Bio-Serv	F05301
乙醇	J.T.  Baker	9000-02	乙醇
眼用棉签	Ultracell	40400-8	由吸水性PVA材料制成的眼用棉签
Fluriso	VetOne	V1 502017-250	异氟烷
玻璃毛细管	Drumond Scientific	3-000-203-G/X	NanoJect II用移液管
过氧化氢	Farmacom		消毒剂
高速相机	BrainVision	MiCAM02-CMOS	单色高速相机
红外发射器	Teleopto
胰岛素注射器
LED套管	Teleopto	TelC-c-l-d	250 µm 487 nm光LED套管
10 µL微量移液器	Eppendorf	Z740436
微电极拉制仪	Sutter	P-87	水平拉制仪
显微镜LSM780	Zeiss		共聚焦显微镜
切片机
模拟接收器	Teleopto
NanoJect II	Drumond Scientific	3-000-204	微量注射器
氧气瓶	Infra	na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA	Addgene	20297	用于ChR2表达的病毒载体
Parafilm封口膜
多聚甲醛	Sigma	P-6148
磷酸盐缓冲液	Sigma	P-4417	磷酸盐缓冲液片剂
10 µL移液器吸头	ThermoFisher	AM12635	0.5–10 µL  容量
Pisabental	PiSA		戊巴比妥钠
有机玻璃	商用		丙烯酸板材
聚维酮碘	Farmacom		消毒剂
Procin	PiSA		赛拉嗪
Puralube	Perrigo pharma	1228112	眼用润滑剂（15%矿物油/85%凡士林）
旋转工具	Kmoon	Mini grinder	标准型
手术刀
手术刀片
立体定位仪	Stoelting	51730D	数字型装置
Super-Bond C&B	Sun Medical		牙科水泥
一次性外科手术帽
Teleopto遥控器	Teleopto
Tg Drd1-Cre小鼠品系	Gensat	036916-UCD	转基因插入FK150Gsat
组织粘合剂	3M Vetbond	1469SB
TPI Vibratome 1000 plus	Peico		切片机
含DAPI的Vectashield封片剂	Vector laboratories	H-1200	封片介质
无线接收器	Teleopto	TELER-1-P