应用被动头部运动在啮齿动物头部产生定义的加速度

摘要

本协议描述了一种定制设计的"被动头部运动"系统，该系统再现了啮齿动物头部在以中等速度跑步期间产生的机械加速度。它允许从体育锻炼的有益影响中剖析机械因素/元素。

摘要

运动被广泛认为对各种疾病和身体疾病有效，包括与脑功能障碍有关的疾病和疾病。然而，运动有益效果背后的分子机制知之甚少。许多体育锻炼，特别是那些被归类为有氧运动的锻炼，如慢跑和步行，在足部与地面接触时会产生冲动力。因此，推测机械冲击可能与运动如何导致机体稳态有关。为了在大脑上测试这一假设，开发了一种定制设计的"被动头部运动"（以下简称PHM）系统，该系统可以产生具有受控和定义大小和模式的垂直加速度，并再现机械刺激，这些刺激可能应用于啮齿动物的头部在跑步机以中等速度跑步时，这是一种典型的干预措施，用于测试运动对动物的影响。通过使用该系统，证明PHM概括了小鼠前额叶皮层（PFC）神经元中的血清素（5-羟色胺，以下简称5-HT）受体亚型2A（5-HT_2A）信号传导。这项工作为应用PHM和测量其在啮齿动物头部产生的机械加速度提供了详细的协议。

引言

运动有益于治疗或预防几种身体疾病，包括糖尿病和原发性高血压等生活方式疾病^1。与此相关的是，关于运动对^{大脑功能的积极影响}的证据也已积累2。然而，运动对大脑益处的分子机制仍然主要未阐明。大多数体育活动和锻炼至少在某种程度上会在头部产生机械加速度。虽然各种生理现象是机械调节的，但在大多数情况下，机械负荷的重要性已在肌肉^{骨骼系统中得到}记录3，^4，5。虽然大脑在体育活动中也受到机械力的影响，特别是所谓的冲击运动，但很少研究生理大脑功能的机械调节。由于头部机械加速度的产生在体育锻炼中相对常见，因此推测机械调节可能与运动对大脑功能的益处有关。

5-HT_2A 受体信号传导对于调节神经系统中起作用的各种生化信号中的情绪和行为至关重要.它涉及多种精神疾病⁶，⁷，^8，运动已被证明具有治疗效果。5-HT_2A受体是5-HT₂受体的一个亚型，属于5-羟色胺家族，也是G蛋白偶联受体（GPCR）家族的成员，其信号传导通过其内化调节，配体依赖性或非依赖性⁹。头部抽搐是啮齿动物的特征行为，其数量（频率）明确表示其前额叶皮层（PFC）神经元中5-HT_2A受体信号传导的强度^10，11。利用这种致幻反应对施用5-HT（头部抽搐反应，以下简称HTR;见补充视频1）的严格特异性，测试了上述关于运动对大脑功能的机械影响的假设。因此，我们分析和比较了接受强制运动（跑步机跑步）或运动模拟机械干预（PHM）的小鼠的HTR。

方案

所有动物实验均获得国家残疾人康复中心机构动物护理和使用委员会的批准。8-9周龄雄性Sprague-Dawley大鼠用于测量跑步机跑步和PHM期间头部的加速度。9-10周龄雄性C57BL / 6小鼠用于PFC的行为测试和组织学分析。 这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 测量跑步机跑步过程中沿 x、y 和 z 轴的加速度大小

1. 用吸入1.5%异氟醚麻醉大鼠。
   注意:在适应实验室环境至少1周后使用大鼠。确保大鼠对后肢脚趾捏没有反应。
2. 使用手术胶带将加速度计（见 材料表）固定在大鼠头顶上。
3. 从麻醉中完全恢复后，将大鼠放入跑步机中（见 材料表），并将跑步机调整到中等速度（20 m / min）¹² （图1A）。
   注意:异氟醚吸入终止后，至少需要20分钟才能确认大鼠从麻醉中完全恢复并开始跑步机实验。确保大鼠对后肢脚趾夹伤有反应，能够行走或奔跑而不会明显踉跄。
4. 按照制造商的说明，使用应用软件测量大鼠跑步机运行期间垂直加速度的大小（参见 材料表）。
   注意:提取 10 个串行波并单独计算沿 3 维轴（x 轴、 y 轴和 z 轴， 图 1B）的平均加速度。通过将步进同步波（~2 Hz频率）定义为跑步机跑步引起的加速度来量化峰值幅度（图1C）。大鼠用于这项研究，因为它们较大的体型适合可靠地测量头部的垂直加速度，这在小鼠中是不可能的。然而，由于头部抽搐反应的定量分析的简便性和可靠性，小鼠被用于进一步的研究。

2. PHM系统的调整及PHM在小鼠中的应用

1. 在PHM系统中预设平台振荡幅度和螺旋桨形凸轮的转速（图1D），使垂直加速度的大小和频率与步骤1.4中获得的值相匹配。
   注意:PHM系统包括金属框架和木制平台。电机速度可以通过调节连接到内置驱动器的拨盘来改变和控制（参见 材料表）。600 的刻度对应于 2 Hz， 图 1E。螺旋桨形凸轮有四个叶片，台阶高度为 5 mm（图 1F）。
2. 通过吸入1.2%异氟醚 麻醉 小鼠。
   注意:在适应实验室环境至少1周后使用小鼠。确保鼠标对后肢脚趾捏没有反应。
3. 将鼠标置于俯卧位置，头部和身体的其余部分分别位于可摆动和静态平台上。
   注意:保持小鼠麻醉（1.2%异氟醚）。
4. 打开电机以垂直振荡平台，并将PHM应用于鼠标。
   注意:电机速度已调整为以 2 Hz 振荡平台（请参阅步骤 2.1）。麻醉并将控制鼠标同样放在PHM平台上，但保持电机关闭。

3. 鼠标在跑步机上奔跑

1. 将鼠标放在跑步机上，将跑步机调整到中等速度（10 m/min）¹³。

4. 小鼠头部抽搐反应 （HTR） 的量化

1. 设置摄像机（帧速率:24 fps）以在透明塑料外壳中记录整个空间。
   注意:塑料保持架用于将鼠标保持在视频录制领域。
2. 腹膜内给予小鼠5-羟基色氨酸（5-HTP）（100mg / kg）（参见 材料表），5-HT的前体。
3. 将鼠标放在透明笼中并开始记录30分钟。
4. 查看录制的视频（1/2x 或 1/3x 速度），手动计算头部抽搐。
   注意:分析师没有对实验程序视而不见。小鼠的特征性"抽动"快速运动（见 补充视频1）被计为头部抽搐，在正常繁殖环境下很少发生。

5.小鼠PFC的免疫组织化学分析

1. HTR 测试完成后，通过施用咪达唑仑 （4.0 mg/kg）、布托酚 （4.0 mg/kg） 和美托咪定 （0.3 mg/kg） 的混合物麻醉小鼠，在 PBS 中灌注 4% 多聚甲醛 （PFA），然后按照先前发表的报告^14，15 切除大脑。
2. 将大脑在PBS中的4%PFA中固定后在4°C下再固定24小时，并储存在30%蔗糖/ PBS中直至下沉。冻结固定的最佳切割温度化合物（OCT化合物，见 材料表）。
3. 从幻灯片盒中检索小鼠大脑的冷冻切片（参见 材料表）。将载玻片放在室温下的干净湿巾上，直到样品完全脱水。
   注意:使用低温恒温器从嵌入OCT化合物中的冷冻样品制备20微米厚的矢状切片（横向+ 0.5-1.5 mm）（见 材料表）。
4. 使用液体阻滞剂笔（参见 材料表）在载玻片上的冷冻切片组织周围画一个圆圈，以限制溶液的扩散区域（Tris缓冲盐水（TBS-T）中的0.1%吐温-20）。
5. 将湿巾放在装有载玻片的托盘底部，以营造潮湿的环境。
6. 用TBS-T透化后，在室温下用4%驴血清（见 材料表）封闭1小时。
7. 在TBS-T中浸泡5分钟冲洗载玻片一次。
8. 在每张载玻片上应用 100 μL 适当稀释的一抗和 DAPI（参见 材料表）混合物，盖上托盘以避免样品干燥，并在室温下孵育过夜。
9. 用TBS-T冲洗三次（每次孵育5分钟）。
10. 在每张载玻片上应用 100 μL 适当稀释的物种匹配荧光二抗（与 Alexa Fluor 488、568 或 645 偶联）（参见 材料表），并在室温下孵育 1 小时。
11. 用TBS-T冲洗三次（每次孵育5分钟）。
12. 用安装介质安装载玻片（参见 材料表）。用盖玻片盖住载玻片。
13. 在荧光显微镜下观察样品。

结果

在跑步机以中等速度（20 m / min）跑步期间，大鼠头部垂直加速度的峰值幅度约为1.0× g （图1C）。PHM系统（图1D）的设置是为了在啮齿动物的头部产生1.0 × g 的垂直加速度峰值。

与对照小鼠（每天麻醉而不使用PHM30分钟/天，持续7天）相比，向小鼠施用PHM（2Hz，30分钟/天，持续7天）显着减弱了其HTR（图2）。这代表了PHM对PFC神经元中5-HT_2A 受体信号传导的抑制作用。

跑步机运行和PHM显着增强了小鼠PFC神经元中的5-HT_2A 受体内化（图3）。在小鼠PFC神经元中，跑步机运行和PHM一致地下调5-HTP诱导的c-Fos表达，即5-HT_2A 受体激活<...

讨论

使用开发的PHM应用系统，我们已经证明其PFC神经元中的5-HT信号传导是机械调节的。由于运动效果的复杂性，很难在健康促进的背景下准确剖析运动的后果。重点是机械方面，以排除可能与运动活动一起或随后发生的代谢事件的参与或贡献，例如能量消耗。这里描述的方法有望在生物医学研究中更广泛地用于探索运动对大脑功能影响的机制。

目前的系统需要麻醉才能使实验动物接受PHM，这可能会影响（有害或不有害）大脑中的神经细胞行为和过程。通过修改系统，包括PHM产生的机械加速度的幅度、模式和波形，可以在没有麻醉的情况下应用PHM。例如，具有正弦波的较小加速度峰值而不是当前PHM的1× g 脉冲峰值可能会被"感觉"为动物更舒适的刺激。或者，可以实施新方法以最小的应力将实验动物保持在振荡平台上。这些修改和改进是可行的，主要是因为PHM产生的加速度原则上与适度运动有关，并且不太可能对实验动物造成"痛苦"的压力。

以前的许多研究报告了适度运动是治疗或预防许多疾病和紊乱的有效程序^16，<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-羟色氨酸 （5-HTP）	Sigma-Aldrich	H9772	血清素 （5-HT） 前体
无刷电机驱动器	东方电机	BMUD30-A2	变速器 内置电机驱动器
C57BL/6 小鼠	东方酵母公司	C57BL/6J	本研究中使用的小鼠
低温恒温器	徕卡	CM33050S	切片机切割冷冻样品
直流电机	东方电机	BLM230-GFV2
驴抗山羊 Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11057	用于免疫组织化学染色的二抗
驴抗小鼠 Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-31571	用于免疫组织化学染色的
驴抗兔 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21206	用于免疫组织化学染色的二抗
驴血清	Sigma-Aldrich	S30-100ML	免疫组织化学染色中抗体非特异性结合的阻断剂
荧光显微镜	Keyence	BZ-9000	荧光显微镜
山羊多克隆抗体-5-HT2A 受体	Santa Cruz Biotechnology	sc-15073	用于免疫组织化学染色的一抗
异氟醚	辉瑞	v002139	吸入麻醉剂
KimWipe	NIPPON PAPER CRECIA	S-200	用于清洁实验室表面、零件、仪器的纸布
液体阻断剂	大同产业	PAP-S	用于制作载玻片表面防水的标记
物 小鼠单克隆抗 NeuN（克隆 A60）	EMD Millipore （Merck）	MAB377	用于免疫组织化学染色的一抗
NinjaScan-Light	Switchscience	SSCI-023641	用于测量加速度的加速度计
OCT 化合物	Sakura Finetek	45833	用于制备冷冻组织切片的包埋剂
ProLong Gold 抗淬灭封片剂	Invitrogen	P36934	用于预防的封固剂面粉褪色
兔多克隆抗体 c-Fos	Santa Cruz Biotechnology	sc-52	用于免疫组织化学染色的一抗
载玻片盒	AS ONE	03-448-1	用于存储载玻片的不透明盒
Spike2	Cambridge electronic design limited （CED）	N/A	用于分析加速
Sprague-Dawley 大鼠	日本 SLC	的应用软件Slc：SD	本研究中使用的大鼠
跑步机机	Muromachi	MK-680	系统用于大鼠和小鼠的强制跑步实验