方法文章

应用被动头部运动在啮齿动物头部产生定义的加速度

DOI：

10.3791/63100

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2022年7月21日

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1Department of Rehabilitation for Motor Functions, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 2Department of Assistive Technology, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 3Department of Metabolism and Endocrinology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Department of Rehabilitation Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 5Department of Clinical Research, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本协议描述了一种定制设计的"被动头部运动"系统，该系统再现了啮齿动物头部在以中等速度跑步期间产生的机械加速度。它允许从体育锻炼的有益影响中剖析机械因素/元素。

摘要

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运动被广泛认为对各种疾病和身体疾病有效，包括与脑功能障碍有关的疾病和疾病。然而，运动有益效果背后的分子机制知之甚少。许多体育锻炼，特别是那些被归类为有氧运动的锻炼，如慢跑和步行，在足部与地面接触时会产生冲动力。因此，推测机械冲击可能与运动如何导致机体稳态有关。为了在大脑上测试这一假设，开发了一种定制设计的"被动头部运动"（以下简称PHM）系统，该系统可以产生具有受控和定义大小和模式的垂直加速度，并再现机械刺激，这些刺激可能应用于啮齿动物的头部在跑步机以中等速度跑步时，这是一种典型的干预措施，用于测试运动对动物的影响。通过使用该系统，证明PHM概括了小鼠前额叶皮层（PFC）神经元中的血清素（5-羟色胺，以下简称5-HT）受体亚型2A（5-HT2A）信号传导。这项工作为应用PHM和测量其在啮齿动物头部产生的机械加速度提供了详细的协议。

引言

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运动有益于治疗或预防几种身体疾病，包括糖尿病和原发性高血压等生活方式疾病1。与此相关的是，关于运动对大脑功能的积极影响的证据也已积累2。然而，运动对大脑益处的分子机制仍然主要未阐明。大多数体育活动和锻炼至少在某种程度上会在头部产生机械加速度。虽然各种生理现象是机械调节的，但在大多数情况下，机械负荷的重要性已在肌肉骨骼系统中得到记录3，4，5。虽然大脑在体育活动中也受到机械力的影响，特别是所谓的冲击运动，但很少研究生理大脑功能的机械调节。由于头部机械加速度的产生在体育锻炼中相对常见，因此推测机械调节可能与运动对大脑功能的益处有关。

5-HT2A 受体信号传导对于调节神经系统中起作用的各种生化信号中的情绪和行为至关重要.它涉及多种精神疾病6，7，8，运动已被证明具有治疗效果。5-HT2A受体是5-HT2受体的一个亚型，属于5-羟色胺家族，也是G蛋白偶联....

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方案

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所有动物实验均获得国家残疾人康复中心机构动物护理和使用委员会的批准。8-9周龄雄性Sprague-Dawley大鼠用于测量跑步机跑步和PHM期间头部的加速度。9-10周龄雄性C57BL / 6小鼠用于PFC的行为测试和组织学分析。 这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 测量跑步机跑步过程中沿 x、y 和 z 轴的加速度大小

  1. 用吸入1.5%异氟醚麻醉大鼠。
    注意:在适应实验室环境至少1周后使用大鼠。确保大鼠对后肢脚趾捏没有反应。
  2. 使用手术胶带将加速度计（见 材料表）固定在大鼠头顶上。
  3. 从麻醉中完全恢复后，将大鼠放入跑步机中（见 材料表），并将跑步机调整到中等速度（20 m / min）12 （图1A）。
    注意:异氟醚吸入终止后，至少需要20分钟才能确认大鼠从麻醉中完全恢复并开始跑步机实验。确保大鼠对后肢脚趾夹伤有反应，能够行走或奔跑而不会明显踉跄。
  4. 按照制造商的说明，使用应用软件测量大鼠跑步机运行期间垂直加速度的大小（参见 材料表）。
    注意:提取 10 个串行波并单独计算沿 3 维轴（x<....

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结果

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在跑步机以中等速度（20 m / min）跑步期间，大鼠头部垂直加速度的峰值幅度约为1.0× g （图1C）。PHM系统（图1D）的设置是为了在啮齿动物的头部产生1.0 × g 的垂直加速度峰值。

与对照小鼠（每天麻醉而不使用PHM30分钟/天，持续7天）相比，向小鼠施用PHM（2Hz，30分钟/天，持续7天）显着减弱了其HTR（图2）。这代表了PHM对PFC神经元中5-HT2A 受体信号传导的抑制作用。

跑步机运行和PHM显着增强了小鼠PFC神经元中的5-HT2A 受体内化（图3）。在小鼠PFC神经元中，跑步机运行和PHM一致地下调5-HTP诱导的c-Fos表达，即5-HT2A 受体激活<.......

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讨论

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使用开发的PHM应用系统，我们已经证明其PFC神经元中的5-HT信号传导是机械调节的。由于运动效果的复杂性，很难在健康促进的背景下准确剖析运动的后果。重点是机械方面，以排除可能与运动活动一起或随后发生的代谢事件的参与或贡献，例如能量消耗。这里描述的方法有望在生物医学研究中更广泛地用于探索运动对大脑功能影响的机制。

目前的系统需要麻醉才能使实验动物接受PHM，这可能会影响（有害或不有害）大脑中的神经细胞行为和过程。通过修改系统，包括PHM产生的机械加速度的幅度、模式和波形，可以在没有麻醉的情况下应用PHM。例如，具有正弦波的较小加速度峰值而不是当前PHM的1× g 脉冲峰值可能会被"感觉"为动物更舒适的刺激。或者，可以实施新方法以最小的应力将实验动物保持在振荡平台上。这些修改和改进是可行的，主要是因为PHM产生的加速度原则上与适度运动有关，并且不太可能对实验动物造成"痛苦"的压力。

以前的许多研究报告了适度运动是治疗或预防许多疾病和紊乱的有效程序16，<.......

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披露

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作者声明，本文中描述的工作不存在竞争利益。

致谢

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这项工作部分得到了日本厚生劳动省校内研究基金的支持;日本学术振兴会科学研究补助金（KAKENHI 15H01820、15H04966、18H04088、20K21778、21H04866、21K11330、20K19367）;文部科学省支持的私立大学战略研究基金会项目，2015-2019年，日本文部科学省（S1511017）;内藤科学与工程基金会。这项研究还获得了再生康复研究与培训联盟（AR3T）的资助，该联盟得到了Eunice Kennedy Shriver国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD），国家神经疾病和中风研究所（NINDS）和美国国立卫生研究院国家生物医学成像和生物工程研究所（NIBIB）的支持，奖励号为P2CHD086843。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-羟色氨酸 （5-HTP）Sigma-AldrichH9772血清素 （5-HT） 前体
无刷电机驱动器东方电机BMUD30-A2变速器 内置电机驱动器
C57BL/6 小鼠东方酵母公司C57BL/6J本研究中使用的小鼠
低温恒温器徕卡CM33050S切片机切割冷冻样品
直流电机东方电机BLM230-GFV2
驴抗山羊 Alexa Fluor 568InvitrogenA-11057用于免疫组织化学染色的二抗
驴抗小鼠 Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571用于免疫组织化学染色的
驴抗兔 Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206用于免疫组织化学染色的二抗
驴血清Sigma-AldrichS30-100ML免疫组织化学染色中抗体非特异性结合的阻断剂
荧光显微镜KeyenceBZ-9000荧光显微镜
山羊多克隆抗体-5-HT2A 受体Santa Cruz Biotechnologysc-15073用于免疫组织化学染色的一抗
异氟醚辉瑞v002139吸入麻醉剂
KimWipeNIPPON PAPER CRECIAS-200用于清洁实验室表面、零件、仪器的纸布
液体阻断剂大同产业PAP-S用于制作载玻片表面防水的标记
物 小鼠单克隆抗 NeuN（克隆 A60）EMD Millipore （Merck）MAB377用于免疫组织化学染色的一抗
NinjaScan-LightSwitchscienceSSCI-023641用于测量加速度的加速度计
OCT 化合物Sakura Finetek45833用于制备冷冻组织切片的包埋剂
ProLong Gold 抗淬灭封片剂InvitrogenP36934用于预防的封固剂面粉褪色
兔多克隆抗体 c-FosSanta Cruz Biotechnologysc-52用于免疫组织化学染色的一抗
载玻片盒AS ONE03-448-1用于存储载玻片的不透明盒
Spike2Cambridge electronic design limited （CED）N/A用于分析加速
Sprague-Dawley 大鼠日本 SLC的应用软件Slc：SD本研究中使用的大鼠
跑步机机MuromachiMK-680系统用于大鼠和小鼠的强制跑步实验

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lackland, D. T., Voeks, J. H. Metabolic syndrome and hypertension: regular exercise as part of lifestyle management. Current Hypertension Reports. 16 (11), 1-7 (2014).
  2. Heyn, P., Abreu, B. C., Ottenbacher, K. J.

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重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

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Passive Head MotionVertical AccelerationTreadmill RunningMechanical StimulationPrefrontal Cortex5 HT2A ReceptorHead Twitch ResponseImmunostaining ProtocolFluorescence MicroscopySerotonin Signaling

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