方法文章

颅内移植与 体内 小鼠大脑中人神经前体细胞的生物发光示踪

5.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63102

⸱

2022年1月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 2Neuroscience Center Zurich, University of Zurich and ETH Zurich

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了将经携带双报告基因载体（表达荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP））转导的人类神经前体细胞移植至小鼠脑实质内的方法。移植后，利用活体成像系统反复检测荧光素酶信号。 体内 利用荧光显微镜在脑组织切片中鉴定表达生物发光和GFP的移植细胞。

摘要

细胞治疗长期以来一直是实验神经生物学中一种新兴的治疗范式。然而，细胞移植研究通常依赖于终点检测，因此对细胞迁移和存活情况的纵向变化评估极为有限。本文提供了一种可靠且微创的方案，用于在成年小鼠脑内移植并长期追踪神经前体细胞（NPCs）。移植前，细胞通过慢病毒载体转导，该载体包含一种生物发光（萤火虫荧光素酶）和荧光（绿色荧光蛋白 [GFP]）报告系统。通过立体定位注射，将NPCs移植至小鼠右侧大脑半球的感觉运动皮层。移植后，可在完整颅骨条件下，利用生物发光成像在移植后第0、3、14、21和35天连续检测移植物，最长可持续五周，检测分辨率下限为6,000个细胞 体内 生物发光成像。随后，在脑组织切片中鉴定移植的细胞，并通过免疫荧光进一步表征。因此，本方案提供了一种有价值的工具，用于在小鼠脑内移植、追踪、定量和表征细胞。

引言

哺乳动物大脑在损伤或疾病后再生能力有限，因此需要创新策略来促进组织和功能修复。临床前研究策略主要关注脑再生的不同方面，包括神经保护、神经发生、血管生成1,2、血脑屏障修复3,4或细胞治疗5,6。细胞治疗的优势在于能够同时促进上述多种修复过程。在细胞移植实验中，组织修复通过以下两种途径实现：（1）直接的细胞替代；（2）分泌细胞因子，从而促进血管生成和神经发生7。干细胞技术的最新进展进一步推动了可规模化、特征明确的神经细胞来源的开发，目前这些细胞已进入临床试验的准备阶段（详见文献7,8,9综述）。尽管细胞治疗已进入少数神经系统疾病的临床研究阶段（例如帕金森病10、脑卒中11和脊髓损伤12），但其疗效仍存在差异，仍需更多临床前研究以深入理解移植物与宿主之间相互作用的机制。

许多临床前研究的一个主要局限性在于无法对移植到宿主体内的细胞进行持续追踪。通常仅进行终点检测，从而忽略了细胞在宿主体内的动态迁移和存活过程6,13。这些局限性导致对移植物细胞的表征不充分，并需要使用大量动物来理解其纵向变化。为克服这些局限，本研究中，我们使用一种 commercially available 双报告基因慢病毒载体（包含红色荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白，rFluc-eGFP）对诱导性多能干细胞（iPSC）来源的神经前体细胞进行转导。这些细胞通过立体定位法直接注射至小鼠脑实质内，并在5周内通过in vivo 生物发光成像进行纵向追踪。在脑组织采集后，通过组织学脑切片对表达GFP的移植细胞进行识别和进一步表征。该方法可便捷地适用于其他可转导的细胞来源及不同的移植途径，用于啮齿类动物脑部的in vivo 应用。总体而言，该实验流程对于获取小鼠脑内移植物存活与迁移的纵向信息具有重要价值，并有助于后续的组织学分析。

方案

注意：所有涉及小鼠的实验均遵循政府、机构及 ARRIVE 指南，并经苏黎世州兽医办公室批准。实验使用成年雄性和雌性非肥胖糖尿病 SCID gamma（NSG）小鼠（10–14 周龄，25–35 g）。小鼠饲养在标准 II/III 型笼具中，每笼至少两只，置于温湿度可控、光照周期恒定为 12/12 小时明暗循环的环境中。

1. 细胞培养与病毒转导

  1. 利用小分子抑制剂将诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为神经前体细胞（NPCs），方法如前所述14.
  2. 培养NPCs15 从第2代开始，在神经干细胞维持培养基（NSMM； 表1）并添加小分子（表1在经多聚鸟氨酸/层粘连蛋白521（pLO/L521）包被的6孔板中培养（每孔2 mL培养基），每日更换培养基。
    注意：传代NPC时，每孔加入1 mL细胞解离试剂（参见 材料表）并在37 °C孵育1分钟，直至大部分细胞脱落。
    1. 包被时，每孔加入150 µL pLO溶于1 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）中，室温（RT）孵育2小时。用PBS洗涤三次后，每孔加入10 µg L521溶于1 mL PBS中，室温（RT）孵育2小时。
  3. 进行病毒转导时，将50,000个细胞接种至每孔涂有pLO/L521的24孔板中，并向每孔加入预包装的病毒载体（pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro，LL410PA-1）。
    注意：所提供的总感染单位（IFU）为 >2 × 106 IFU足以在感染复数（MOI）为20的条件下感染100,000个细胞。细胞计数已使用自动细胞计数仪完成。转导效率在很大程度上取决于所使用的细胞系。慢病毒操作需遵循当地针对生物安全等级2（BSL-2）产品的相关规范。
  4. 在37 °C下孵育细胞72小时，期间持续每日更换培养基。
  5. 通过荧光显微镜观察细胞中GFP的表达情况，以确认转导成功。将显微镜放大倍数设置为10x或20x，采用适当的激发波长（460-480 nm）和发射波长范围（490-520 nm）来检测转导后表达GFP的细胞。
  6. 通过定量GFP转导细胞与总细胞的比率，评估总体转导效率。
    注意：转导效率为65-95%的转导效率通过本方案实现。 >建议将50%作为移植前的通过/不通过标准。若无法达到50%的转导效率，可进行嘌呤霉素筛选或使用流式细胞术分选细胞，以提高转导细胞的得率。
  7. 可选步骤：细胞冻存
    1. 离心细胞（300 × g，5 分钟）并弃去上清液。将沉淀重悬于 1 mL 冷冻保存液中（参见 材料表）并将悬液转移至小瓶中，以获得106 细胞/小瓶。将细胞转移至冻存盒中，在 -80 °C 保存 24 小时，随后转移至 -150 °C 长期保存。

2. 移植用细胞的制备

  1. 从 -150 °C 保存环境中取出一管细胞并转移至实验室。使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
    注意：该管细胞含有 1.5–2 × 106 个细胞。
  2. 迅速将细胞管放入 37 °C 水浴中，直至无冰晶残留（2–3 分钟）。
    注意：快速解冻至关重要，以尽量减少对细胞膜的损伤。切勿将细胞管完全浸入水浴中，以免增加污染风险。
  3. 将细胞管转移至生物安全柜中，并用移液器将全部内容物（约 1 mL）转移至无菌的 15 mL 锥形离心管中。
    注意：操作经慢病毒转导的细胞需在 BSL-2 条件下进行。然而，通过洗涤和传代可去除培养基中的病毒颗粒。关于何时可从 BSL-2 转移至 BSL-1 的具体规定，应咨询当地主管部门。
  4. 加入 9 mL 无菌 1× PBS，于室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
  5. 使用移液器（1–10 mL）吸取并去除上清液；轻轻倾斜离心管使沉淀朝向移液器吸头，开始吸取。注意不要扰动沉淀。
  6. 用 10 mL 无菌 1× PBS 重悬细胞以洗涤细胞。
    注意：轻轻敲击离心管，使细胞在残留液体中充分重悬。使用 1 mL 移液器缓慢吹打细胞悬液，直至无团块或聚集物存在。
  7. 在最终离心前，使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
  8. 于室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
  9. 去除上清液（步骤 2.5），并将细胞沉淀重悬于所需体积的无菌 PBS 中，调整细胞浓度至 8 × 104 个细胞/µL。将细胞置于冰上，并在接下来的 5 小时内用于移植。
    ​注意：本实验方案中使用了 1.6 × 105 个细胞/2 µL PBS 的体积。

3. 移植操作步骤

  1. 手术准备
    1. 清洁并灭菌手术器械。
    2. 准备立体定位仪和微量注射泵系统。
      注意：在开始操作前，必须测试 Hamilton 注射器和 30 G、2 英寸的针头。将针头插入含有无菌 0.9% NaCl 的试管中，缓慢吸取并推出溶液，以检查其通畅性。
    3. 设置麻醉机。在使用动物前测试设备是否正常工作。用 70% 乙醇清洁诱导室。
  2. 动物准备
    1. 实验前至少将小鼠在标准条件下饲养 7 天，以适应环境。
      注意：本方案使用以下动物：雌性 NOD/SCID/IL2rγnull（30–35 g，也称为 NSG）和雌性 C57BL/6J（20–25 g，也称为 B6）。该操作也可在雄性小鼠中进行。
    2. 测量小鼠体重，并据此调整镇痛药的注射剂量。腹腔注射卡洛芬（carprofen，5 mg/kg 体重）以减轻疼痛和/或预防炎症反应。
    3. 使用氧气中挥发的异氟烷（诱导阶段为 3%，手术维持阶段为 1.5–2%）对动物进行麻醉。
      注意：由于气体麻醉可在术后快速苏醒，且麻醉气体浓度易于调节，因此更推荐使用。
    4. 通过伤害性反射（如脚趾夹捏）判断动物是否处于深度麻醉状态。达到深度麻醉后，将动物从诱导室转移至立体定位仪，并通过面罩维持麻醉。
      注意：整个过程中需目视监测呼吸频率（40–60 次/分钟）。使用加热垫以防止术中低体温。
    5. 涂抹眼用润滑剂，防止眼睛干燥。
    6. 使用电动剃刀剃除小鼠头皮毛发，并用棉签蘸取 5% 聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。
    7. 固定小鼠头部，并将耳杆插入外耳道。
      注意：操作时应避免损伤鼓膜。插入耳杆前，先在两侧耳道涂抹利多卡因软膏。为确认头部位置是否稳定，可轻压头部观察是否有移动。若发现移动，则耳杆或鼻夹的位置可能不正确，需重新调整。
  3. 开颅
    1. 使用手术刀沿中线切开皮肤，切口需足够大以暴露 lambda 和 bregma 解剖标志。
      注意：可使用皮肤牵开器保持颅骨暴露。
    2. 用手术刀剥离骨膜和筋膜，并用无菌棉签擦干颅骨表面。
    3. 调整耳杆和门齿夹，以标准化头部位置。
      注意：为实现前后方向的准确定位，bregma 和 lambda 的垂直坐标必须一致。
    4. 将针头置于 bregma 处，计算目标注射点的坐标（本方案选用的感兴趣坐标为：前后方向（AP）：+0.5 mm，内外侧方向（ML）：+1.5 mm）。将针头移至该位置，并用墨水标记。
      注意：坐标选择基于 Franklin 和 Paxinos 小鼠脑图谱16，距离以距 bregma 的毫米数表示。
    5. 向颅骨表面滴加无菌 0.9% NaCl 溶液，使用外科牙科钻在颅骨上钻出直径为 2–3 mm 的孔。
    6. 将针头移至硬脑膜表面，测定深度坐标。
  4. 移植操作
    1. 重悬步骤 2.9 中的细胞，吸取 2 µL 细胞悬液至注射器（5 µL 或 10 µL）中。
      注意：确保细胞悬液中无气泡。注射器在安装至立体定位装置前应保持水平放置，以避免细胞沉降。
    2. 将注射器置于目标位点上方（计算所得坐标：AP：+0.5 mm，ML：+1.5 mm），缓慢将针头移至硬脑膜表面。
      注意：若对坐标准确性存疑，可在细胞移植前先使用染料进行注射，并通过组织学评估注射位点（详见17）。
    3. 以 0.02 mm/s 的速度将针头插入脑组织至目标深度（本方案选用的背腹方向（DV）坐标为 -0.8 mm）。超过目标深度 0.1 mm 后，再以相同距离缓慢回撤针头，以形成供细胞注入的空间。
    4. 使用镊子在针头周围涂抹组织粘合剂，防止细胞泄漏。
    5. 以 3–5 nL/s 的恒定速率注射 2 µL 预备好的细胞悬液。
      注意：注射过程将持续 7 至 12 分钟。
    6. 注射完成后，将针头留置至少 5 分钟后再缓慢拔出。涂抹组织粘合剂封闭颅骨孔洞，并等待 2 分钟使其固化。
  5. 缝合与术后护理
    1. 向暴露的颅骨滴加无菌 0.9% NaCl 溶液，防止脱水。
    2. 使用 5/0 丝线缝合伤口。
    3. 皮下注射 0.5 mL 乳酸林格液至小鼠下背部，以补充水分。
    4. 停止麻醉气体供应，小心将小鼠从立体定位仪中取出，并放回置于加热垫上的笼盒中。
    5. 在术后急性期密切监测动物状态。每天至少两次检查缝合情况、体重及整体健康状况。

4. 体内 成像

  1. 荧光素的制备
    1. 室温下解冻D-荧光素钾盐，并用PBS配制30 mg/mL的新鲜D-荧光素储备液。
    2. 通过0.22 µm注射器滤器对储备液进行灭菌。
      注意：建议立即使用工作液。如有必要，溶解后的荧光素可保存于 -20 °C，但长期储存可能导致信号降解。荧光素为光敏性试剂，应尽可能避免直接暴露于光照下。也可考虑使用其他底物（如 cycluc）以提高分辨率。18.
  2. 成像
    1. 初始设置
      注意：生物发光成像使用一台 体内 成像系统（参见 材料表由暗室和冷却电荷耦合器件（CCD）相机组成。
      1. 双击 Living Image 软件 图标并选择一个 用户 ID 从下拉列表中。
      2. 点击 初始化 在 对照 初始化过程完成后，出现的面板 温控箱 控制面板上的指示灯将变为绿色。
      3. 在 对照 面板，检查 发光的 和 拍摄照片 盒子并选择 自动曝光 （约60秒）。选择一个 视野 (D/12.5 cm 被选用于本方案）。输入受试者身高（1.5 cm），然后选择 使用受试者身高 对焦选项。手动设置以下参数： 大像素合并，f/2，激发滤光片被阻断，以及 开放发射滤光片.
    2. 根据体重确定D-荧光素的注射剂量为300 mg/kg。 注：D-荧光素的标准推荐剂量为150 mg/kg。本实验方案参考了使用300 mg/kg剂量以获得更高灵敏度的文献方法进行了调整。18.
    3. 腹腔注射（i.p.）荧光素酶底物。
      ​注意：如果动物在注射前需要进行镇静，需注意这可能会延长荧光素酶表达的峰值时间。
    4. 等待5分钟，然后通过持续供给异氟烷对动物进行麻醉（诱导阶段为4.5%，成像过程中维持阶段为1.5–2%）。
    5. 将眼用润滑剂涂抹于眼睛，然后使用普通剃毛器对镇静后的动物头部区域进行剃毛。将动物放入成像室，并在注射荧光素后15分钟点击开始成像 获取 在 对照 面板

5. 灌注

  1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg 体重）对动物进行麻醉。等待小鼠对疼痛刺激（如脚趾夹捏）不再产生反应。
  2. 将小鼠仰卧放置，使用镊子和剪刀打开胸腔。
  3. 使用普通剪刀切开膈肌。
  4. 暴露心脏，并将连接灌注管路的针头（管路中含任氏液/4% 多聚甲醛溶液（PFA））插入左心室心尖部位。
    注意：注意保持针头尖端位于心室腔内。
  5. 用剪刀剪开右心室。
  6. 用任氏液（可室温保存）灌注 3–4 分钟（流速：17 mL/min）。持续灌注至心脏组织完全洗净为止。
  7. 切换三通阀，使 PFA 溶液（4 °C 保存；操作过程中置于冰上）开始流动，继续灌注约 5 分钟（约 100 mL）。
  8. 停止灌注泵，将针头从左心室取出。
    ​注意：PFA 灌注可均匀地保持组织完整性，同时有助于保存移植组织中 GFP 信号，避免因扩散而导致信号丢失。

6. 处理

  1. 组织采集
    1. 使用标准剪刀移除头部，并在皮肤正中做切口。
    2. 将皮肤翻转至眼睛上方，暴露颅骨。
    3. 从顶骨后部开始，用弹簧剪刀做小切口；沿矢状缝向前推进剪刀至两眼之间位置。再次从后部开始，在矢状面上做两条平行切口，间距约 4 mm。
      注意：操作时需小心，避免剪刀压迫颅骨内表面而损伤脑组织。
    4. 用镊子小心倾斜一侧顶骨并将其折断，对另一侧重复相同操作。
      注意：使用微型解剖刀将骨片与脑膜分离，否则在去除颅骨时可能损伤脑组织。若额骨部分残留，可做小切口以倾斜并折除骨片。
    5. 为取出脑组织，将微型解剖刀轻轻插入脑下方（嗅球处），并轻柔向上抬起。
    6. 采集后，将脑组织置于 4% 多聚甲醛（PFA）溶液中，4 °C 固定 4–6 小时，随后转移至无菌 1× PBS 中保存。
  2. 免疫组织化学染色
    1. 将脑组织转移至 30% 蔗糖溶液中，4 °C 至少放置 48 小时，以防止冷冻过程中形成冰晶。
    2. 使用滑动式切片机切割厚度为 40 µm 的冠状切片。将切片以游离状态收集并储存在 24 孔板的防冻保护液（表 1）中，置于 -20 °C 保存，直至后续处理。
    3. 每孔加入 450 µL 1× PBS 漂洗切片（每次 5 分钟，共 3 次，室温）。
    4. 每孔加入 450 µL 封闭液（表 1），室温封闭 1 小时，以阻断非特异性结合位点。
    5. 每孔加入 450 µL 一抗溶液，4 °C 过夜孵育。一抗按 1:200 比例用含 3% 驴血清和 0.1% Triton-X-100 的 PBS 稀释。为在宿主环境中识别供体来源的组织，使用针对人特异性细胞核的抗体（Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1）。
    6. 每孔加入 450 µL 1× PBS 洗涤切片（每次 5 分钟，共 3 次，室温）。
    7. 每孔加入 450 µL 对应的荧光标记二抗溶液，室温孵育 2–3 小时。二抗用含 3% 驴血清和 0.1% Triton-X-100 的 1× PBS 稀释。
    8. 每孔加入 450 µL 1× PBS 洗涤切片（每次 5 分钟，共 3 次，室温）。
    9. 用 450 µL 浓度为 0.1 µg/mL 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。

结果

我们旨在利用纵向追踪小鼠大脑中移植的神经前体细胞 体内 生物发光成像，并在后续组织学分析中鉴定移植的细胞（图1A）。因此，神经前体细胞被转导了含有 EF1α-rFluc-eGFP 的慢病毒载体。移植前，通过检测 eGFP 的表达来验证细胞转导是否成功 体外 (图1B）。成功转导的细胞被立体定位移植至小鼠脑内目标坐标位置（例如，感觉运动皮层）。移植后，小鼠全身注射D-荧光素酶底物（D-luciferin，rFluc的底物），检测移植细胞的信号强度以确认移植成功图1C).

为了评估检测限 体内 生物发光成像，将6,000至180,000个细胞移植至小鼠右侧感觉运动皮层（图2A）。我们检测到 <6,000 个细胞，且移植后立即检测到与移植细胞数量成正比的生物发光信号图2B）。由于人源细胞对免疫健全小鼠具有免疫原性，因此采用NOD scid gamma（NSG）免疫缺陷小鼠以观察细胞移植物的长期存活情况。细胞移植后，通过生物发光信号检测证实，移植物可长期存活并持续达5周之久。图2C，D。成功检测到移植的细胞 离体 通过eGFP报告基因以及抗人细胞核和抗人线粒体抗体的免疫染色进行后续组织学分析（图 2E).

慢病毒转导示意图；立体定位移植，rFluc-eGFP NPCs，活体成像。
图1：神经前体细胞的移植。（A）rFluc-eGFP NPCs 的生成与移植示意图。（B）转导后 NPCs 的代表性免疫荧光图像（GFP 报告基因，绿色），DAPI 复染（蓝色）；比例尺 = 5 µm。（C）移植细胞中生物发光信号的活体检测；颜色条表示：蓝色（0，最小值，无信号），红色（4 流量，p/s × 105，最大信号）。缩写：NPCs = 神经前体细胞；GFP = 绿色荧光蛋白；rFluc-eGFP = 红色萤火虫荧光素酶与增强型绿色荧光蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；p/s = 光子/秒。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠细胞移植研究；生物发光成像，细胞计数，GFP，HuNu，通量图，显微镜。
图 2：移植细胞的时间过程。（A）移植细胞数量的示意图。（B）移植后1小时检测移植细胞的灵敏度。（C, D）在NSG小鼠中移植细胞（180,000个）长达35天的时间过程；颜色条表示：蓝色（0，最小值，无信号），红色（4通量，p/s × 105，最大信号）；数据为均值 ± 标准误（n = 3）。（E）移植后5周组织切片及移植细胞的代表性荧光图像。比例尺 = 10 µm。缩写：D = 移植后天数；NSG = 免疫缺陷型NOD scid gamma；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；GFP = 绿色荧光蛋白；HuNu = 抗人核抗体，克隆235-1；p/s = 光子/秒。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

修复受损大脑以实现功能恢复仍是尚未解决的难题。近年来，许多创新的临床前方法不断涌现，例如靶向免疫调节19,20、血管生成1,21,22,23、血脑屏障完整性2,3,24,25以及细胞替代治疗5,26。尤其是近年来，由于干细胞技术及高效分化方案的重大进展，基于细胞的治疗方法已成为脑部疾病治疗中极具前景的策略15,28。本文提供了一种在小鼠脑内移植并追踪神经细胞的有价值方案。该方法适用于所有可用于小鼠脑内in vivo应用的可转导细胞系。

本实验方案在小鼠体内使用了人源移植物。由于免疫原性的原因，这类移植物在免疫功能健全的野生型小鼠中无法长期存活。因此，本研究采用免疫缺陷型NSG小鼠以克服这一限制。 alternatively，也可选择使用小鼠来源的移植物来规避免疫排斥问题。如果必须进行人源细胞移植，人源化小鼠模型则是一种新兴的替代方案，可降低移植物排斥的发生概率29。

使用一种商业化的双报告病毒载体，其在EF1α启动子下表达萤光素酶（firefly luciferase）和eGFP，以实现对移植组织的可视化。选择该启动子旨在获得高强度信号15然而，除了神经前体细胞（NPCs）之外，其他细胞类型也被证明可在脑损伤后促进脑功能恢复，包括周细胞30 和星形胶质细胞31因此，根据所使用的细胞系不同，其他启动子可能更适用于实现高水平表达。此外，使用外源基因启动子（如CMV）可能导致表达下调，尤其是在长期实验中32慢病毒载体的转导效率在很大程度上取决于所使用的细胞系，并可能在不同实验之间存在差异。因此，在开始实验之前必须对转导效率进行评估。 在体 实验之间存在转导效率的差异，因此需要进行实验校正。移植的脑区也会影响信号强度。尽管检测限为 <对于皮层移植，6,000个细胞即可达到效果，但在检测较深脑区（如纹状体或海马）的信号时，可能需要更多细胞。

小鼠脑内的移植体积限制在1-2 µL。因此，为实验确定合适的细胞数量非常重要。先前观察到，增加细胞数量会导致存活率下降，这很可能是因为移植区域的营养物质和氧气供应有限33。体内生物发光成像与其他体内成像方法（如MRI或CT）相比，空间分辨率相对较低。因此，移植物细胞的短距离迁移路径只能在后续的事后分析中可靠地评估。

生物发光的绝对信号强度通常与移植的细胞数量成正比。然而，如果移植物被植入较深的脑结构中，或信号强度超出活体成像系统的线性检测范围，则信号强度可能会降低。in vivo 目前正在开发新型底物，以实现比D-荧光素更有效地穿透血脑屏障，包括cycluc1。这些底物未来可能进一步提高对移植细胞的检测灵敏度18。总体而言，本方案提供了一种简便、微创的方法，用于在小鼠脑内移植并观察移植物。

披露

作者声明无潜在利益冲突。

致谢

作者 RR 和 CT 感谢 Mäxi 基金会和 3R Competence Center 提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>病毒转导
pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro（Lenti-Labeler 病毒）SystembioLL410VA-1
<强>耗材
Eppendorf 微量离心管；1.5 mLSigma AldrichZ606340
Falcon 离心管；15 mLTPP91015
显微镜盖玻片首选产品
显微镜载玻片首选产品
无菌棉签首选产品
缝线；5/0 丝线，带弯曲针B. BraunG0762482
注射器滤器；0.22 µmTPP99722
注射器；1 mL 和 0.5 mLB. Braun9166017V
组织培养板（24孔）TPP92024
<强>仪器设备
自动细胞计数仪（Vi-CELL XR）贝克曼库尔特生命科学383721
镊子Fine Science Tools11064-07
精细镊子Fine Science Tools11412-11
加热垫首选产品
高速无刷微型电机套件ForedomK.1060-22
理想微型钻头套装，共5件细胞定点特异性60-1000
体内 成像系统（IVIS Lumina III，配备 Living Imaging 4.2 软件包）Perkin ElmerCLS136334
异氟烷蒸发器Provet AG330724
显微注射器泵系统World Precision InstrumentsUMP3T-1
微量注射器；700系列；体积：5-10 µLHamilton7635-01
切片机LeicaHM430
NanoFill-33 G 针头（可拆卸且可重复使用）World Precision InstrumentsNF33BV-2
持针器Fine Science Tools12001-13
灌注泵和管路MasterflexHV-77120-42
手术刀Fine Science Tools10003-12
小型直头博拿剪精细科学工具14184-09
小型弹簧剪，直头Fine Science Tools15000-03
刮勺默克Z243213-2EA
用于啮齿类动物的立体定位仪；电动World Precision Instruments99401
<强>药品与试剂
AccutaseInvitrogenA11105-01蛋白酶和胶原酶解；细胞解离试剂
抗人细胞核抗体，克隆 235-1，生物素偶联物默克MAB1281B
B27 – 补充剂（50倍浓缩）Gibco17504-001
聚维酮碘（11 mg 碘/1 ml 溶液）ösung萌蒂制药有限公司所有药品均由瑞士苏黎世州药房提供
封闭液（3% 驴血清；0.1% Triton-X-100 溶于 PBS）首选产品；可自制
CHIR99021（10 mM） – 2,500xStemMACS130-103-926
冷冻保护剂溶液首选产品；可自制
DAPI溶液（1 mg/mL）赛默飞世尔科技62248
D-荧光素钾盐Perkin Elmer122799
DMEM/F12Gibco11320-074
驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555InvitrogenA-31570
驴血清首选产品
埃斯科纳康（戊巴比妥钠 300 mg）斯特雷利制药股份有限公司所有药品均由瑞士苏黎世州药房提供
乙醇；70%首选产品
无动物源成分的重组人碱性成纤维细胞生长因子蛋白赛默飞世尔科技 PHG6015
谷氨酰胺（100倍浓缩液）GibcoA12860-01
hLif (10 µg/mL – 1,000×PeproTechAF-300-05-25UG
异氟烷（异氟烷（1-氯-2,2,2-三氟乙基二氟甲基））­乙醚）99.9%）Provet AG所有药品均由瑞士苏黎世州药房提供
层粘连蛋白-L521（L-521）Biolaminin LNLN521
利多卡因软膏（利多卡因：25 mg，丙胺卡因：25 mg）Aspen Pharma Schweiz GmbH所有药品均由瑞士苏黎世州药房提供
封片剂首选产品；可自制
N2-补充剂（100倍浓缩）Gibco 75202-001
NeurobasalGibco 21103-049
眼用润滑剂（棕榈酸视黄醇：15,000 UI）Bausch & Lomb Swiss AG所有药品均由瑞士苏黎世州药房提供
多聚甲醛溶液首选产品
PBS赛默飞世尔科技10010023也可自制
聚-L-鸟氨酸溶液（pLO）Sigma-AldrichP4957
Rimadyl（卡洛芬 50 mg）Zoetis Schweiz GmbH所有药品均由瑞士苏黎世州立药房提供
乳酸林格液B. Braun3570500
林格氏液B. Braun3570030
生理盐水（0.9% NaCl）B. Braun3570160
SB431542（10 mM） – 3,333.3xStemMACS130-106-543
组织粘合剂（Histoacryl）B. Braun1050060

参考文献

  1. Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
  2. Rust, R., et al. Anti-Nogo-A antibodies prevent vascular leakage and act as pro-angiogenic factors following stroke. Scientific Reports. 9 (1), 20040(2019).
  3. Weber, R. Z., et al. Characterization of the blood brain barrier disruption in the photothrombotic stroke model. Frontiers in Physiology. 11, 58226(2020).
  4. Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews. Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
  5. Wang, Y., et al. 3K3A-APC stimulates post-ischemic neuronal repair by human neural stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (9), 1050-1055 (2016).
  6. Llorente, I. L., et al. Patient-derived glial enriched progenitors repair functional deficits due to white matter stroke and vascular dementia in rodents. Science Translational Medicine. 13 (590), (2021).
  7. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized brain cells for stroke patients using pluripotent stem cells. Stroke. 49 (5), 1091-1098 (2018).
  8. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).
  9. Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell Transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
  10. Schweitzer, J. S., et al. Personalized iPSC-derived dopamine progenitor cells for Parkinson's disease. The New England Journal of Medicine. 382 (20), 1926-1932 (2020).
  11. Muir, K. W., et al. Intracerebral implantation of human neural stem cells and motor recovery after stroke: multicentre prospective single-arm study (PISCES-2). Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 91 (4), 396-401 (2020).
  12. Kawabori, M., et al. Cell therapy for chronic TBI: interim analysis of the randomized controlled STEMTRA trial. Neurology. 96 (8), 1202-1214 (2021).
  13. George, P. M., et al. Engineered stem cell mimics to enhance stroke recovery. Biomaterials. 178, 63-72 (2018).
  14. Sancho-Martinez, I., et al. Establishment of human iPSC-based models for the study and targeting of glioma initiating cells. Nature Communications. 7 (1), 1-14 (2016).
  15. Rust, R., et al. Xeno-free induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells for in vivo applications. bioRxiv. , (2022).
  16. Franklin, K., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's the Mouse brain in stereotaxic coordinates, compact: The coronal plates and diagrams. , Academic Press. (2019).
  17. Baker, S., Götz, J. A local insult of okadaic acid in wild-type mice induces tau phosphorylation and protein aggregation in anatomically distinct brain regions. Acta Neuropathologica Communications. 4, 32(2016).
  18. Cao, J., et al. In vivo optical imaging of myelination events in a myelin basic protein promoter-driven luciferase transgenic mouse model. ASN Neuro. 10, (2018).
  19. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: an optimized protocol for brain studies. PLoS One. 8 (2), 55662(2013).
  20. Roth, S., et al. Brain-released alarmins and stress response synergize in accelerating atherosclerosis progression after stroke. Science Translational Medicine. 10 (432), (2018).
  21. Rust, R., Hofer, A. -S., Schwab, M. E. Stroke promotes systemic endothelial inflammation and atherosclerosis. Trends in Molecular Medicine. 24 (7), 593-595 (2018).
  22. Rust, R., Gantner, C., Schwab, M. E. Pro- and antiangiogenic therapies: current status and clinical implications. FASEB Journal. 33 (1), 34-48 (2018).
  23. Rust, R., Grönnert, L., Weber, R. Z., Mulders, G., Schwab, M. E. Refueling the ischemic CNS: guidance molecules for vascular repair. Trends in Neurosciences. 42 (9), 644-656 (2019).
  24. Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642(2018).
  25. Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
  26. Montagne, A., et al. APOE4 leads to blood-brain barrier dysfunction predicting cognitive decline. Nature. 581 (7806), 71-76 (2020).
  27. George, P. M., Steinberg, G. K. Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
  28. Weber, R. Z., et al. Deep learning based behavioral profiling of rodent stroke recovery. bioRxiv. , (2021).
  29. Nair, R. R., et al. Uses for humanised mouse models in precision medicine for neurodegenerative disease. Mammalian Genome. 30 (7), 173-191 (2019).
  30. Kirabali, T., Rust, R. iPS-derived pericytes for neurovascular regeneration. European Journal of Clinical Investigation. 51 (9), 13601(2021).
  31. Weber, R. Z., Perron, P., Rust, R. Astrocytes for brain repair: More than just a neuron's sidekick. Brain Pathology. 31 (5), Zurich, Switzerland. 12999(2021).
  32. Johansen, J., et al. Evaluation of Tet-on system to avoid transgene down-regulation in ex vivo gene transfer to the CNS. Gene Therapy. 9 (19), 1291-1301 (2002).
  33. Vogel, S., et al. Initial graft size and not the innate immune response limit survival of engrafted neural stem cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 784-793 (2018).

重印与许可

探索更多文章

细胞示踪立体定位注射慢病毒转导生物发光成像免疫荧光分析细胞迁移
颅内移植与 体内 小鼠大脑中人神经前体细胞的生物发光示踪
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。