本方案描述了构建一种芯片实验室微流控电穿孔装置所需的微加工技术。该实验装置可在连续流动条件下实现可控的单细胞水平转染，并可通过基于细胞群体的控制进一步扩展至更高通量。文中提供了分析结果，展示了实时电学监测细胞膜通透化程度的能力。
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摘要
摘要
目前的治疗创新，例如CAR-T细胞疗法，高度依赖病毒介导的基因递送。尽管该方法效率较高，但其制造成本高昂，这促使人们关注使用其他替代方法进行基因递送。电穿孔是一种基于电物理原理的非病毒性方法，可用于将基因及其他外源性物质递送至细胞内。当施加电场时，细胞膜会暂时允许分子进入细胞。通常，电穿孔在宏观尺度上进行，以处理大量细胞。然而，这种方法需要大量的经验性实验来优化操作方案，当处理原代细胞或难以转染的细胞类型时，成本尤为高昂。漫长的方案开发过程，加上需要施加高电压以达到足以使细胞膜通透的电场强度，促使了微尺度电穿孔装置的发展。这些微电穿孔装置采用常见的微加工技术制造，能够在保持高通量潜力的同时，实现更精确的实验控制。本研究基于一种可在连续流动条件下以单细胞分辨率检测细胞膜通透化程度的微流控-电穿孔技术。然而，该技术此前仅能以每秒处理4个细胞的速度运行，因此本文提出并展示了一种提高系统通量的新方法。这种新技术被称为基于细胞群体的反馈控制，它通过评估细胞对多种电穿孔脉冲条件的通透化响应，确定最适合待测细胞类型的电穿孔脉冲参数。随后在高通量模式下，将该“最优”脉冲应用于流动中的细胞悬液。本文详细介绍了装置的制备步骤、微流控实验的设置与运行流程，以及结果分析方法。最后，通过将编码绿色荧光蛋白（GFP）的DNA质粒递送至HEK293细胞，验证了该微电穿孔技术的有效性。
引言
当前生物医学研究中的治疗创新，例如嵌合抗原受体工程T细胞（CAR-T）疗法以及利用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas9进行基因编辑，高度依赖于将外源物质成功且高效地递送至细胞内空间的能力1。在CAR-T疗法中，细胞治疗生产过程中进行基因递送的金标准方法是使用病毒载体2。尽管病毒介导的基因递送是一种高效的递送方式，但也存在若干缺点，包括制造成本高、细胞毒性、免疫原性、潜在的致突变性或致瘤性，以及对所递送基因大小的限制3。这些局限性推动了替代性非病毒递送技术的研究与开发。
电穿孔是一种替代病毒介导基因递送的方法，依赖于施加最佳的电脉冲波形，以实现对细胞的DNA、RNA和蛋白质转染。在外加电场作用后，细胞膜会短暂受损，从而使细胞易于摄取原本无法穿透的外源性物质4。与病毒介导的递送方法相比，电穿孔具有操作安全、易于操作和运行成本低等优势。电穿孔可递送小分子和大分子物质，并且在不同谱系的细胞转染中均能实现高效转染5。为了在电穿孔后获得理想的结果，即良好的细胞存活率和高效的电转染效率，需要共同优化多种实验参数。这些参数包括细胞类型6、细胞密度、分子浓度7....
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方案
注意：使用者应查阅本实验方案中所用材料和耗材的所有材料安全数据表（MSDS）。每一步操作均应佩戴适当的个人防护装备（PPE），实验过程中须采用无菌操作技术。第1至第7节讨论装置的制备。
1. 器件制备——掩模设计
注意：微加工过程的示意图请参见图2。微加工步骤需在洁净室环境中进行。需要额外的个人防护装备（发网、胡须网、口罩、洁净服、鞋套）。
- 选择一款 CAD 软件，设计微流控通道和电极的二维“掩膜”，并将设计保存为所需的文件格式（例如 .dxf、.dwg）。
注意：参见补充图 1以获取二维掩膜示意图的示例。 - 发送至选定的供应商进行打印。确保设计的尺寸在供应商的分辨率能力范围内。
2. 器件制备——光刻
注意：所提供的微加工工艺配方源自光刻胶制造商的建议，仅可作为起点使用34。对于烘焙时间、曝光时间等具体参数，需根据每项制备方案进行优化。建议使用晶圆镊子来操作硅晶圆和玻璃载片。
- 微流控通道制备
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结果
图4 展示了在单一脉冲幅度下，单细胞水平膜通透性检测的工作原理。在电穿孔实验启动后，细胞检测算法通过逐点、基于斜率的检测方法确定用于细胞识别的最佳阈值。系统随后持续监测（1）测量电流是否出现显著的负向变化，该变化表明有细胞进入。这是由于生物细胞膜具有绝缘特性，当细胞穿过电极对时，会导致阻抗瞬时升高，从而引起测量电流急剧下降，实现稳定的细胞检测（2），并最终触发切换至计算机控制的脉冲施加（4）。绝缘的细胞会置换电极之间的电解液体积，导致电流下降，其下降幅度与细胞大小成正比。这一电流变化记为 ΔIC（3）。在完成 ΔIC 计算后，系统立即向正在通过的细胞施加预设的电脉冲（4）。这一瞬时能量输入会在系统中引入短暂的检测干扰（灰色区域）。在信号重新锁定，即切换回细胞监测模式后（5），可以明显观察到电穿孔脉冲已使细胞膜发生通透化，因为细胞离开电极区域时，其所引起的电流变化幅度显著减小（6）。细胞在电穿孔脉冲施加前后因阻抗大小不同所导致的两次电流下降之间的差异称为通透化电流，记为 ΔIP
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讨论
本方案中介绍的方法主要聚焦于微流控装置的微加工，随后将其集成到专用的电穿孔实验装置中。在描述微加工过程的具体细节时，常使用“工艺参数”（recipe）这一术语，这暗示了遵循并优化每个步骤对于成功制备功能器件的重要性。然而，若某些关键步骤未经过优化，例如紫外光曝光时间/能量、物理气相沉积（PVD）溅射速率/持续时间以及氧气等离子体发生器的设置，可能会对器件的制备过程以及后续电穿孔实验的成功实施造成问题。微加工过程的故障排查主要通过试错法或更受控的实验设计（Design of Experiments）来完成。此外，还存在其他可替代的微加工技术，例如深反应离子刻蚀（DRIE），可用于替代本方案中的不同步骤（例如，使用DRIE刻蚀的模具结构来执行软光刻工艺）。此外，对于该领域的新手而言，优化工艺参数以及设计和制备器件可能耗时较长。然而，一旦微加工流程被成功建立，工程师或科研人员便可自由设计出满足其特定需求的器件。
为此，本方案中描述的装置是在我们先前研究32的基础上进一步拓展而开发的。该装置延续了单细胞膜通透性电学检测的方法，但实现了更高通量.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢美国国家科学基金会（NSF CBET 0967598，DBI IDBR 1353918）以及美国教育部精准与个性化医学新兴领域研究生培训项目（P200A150131）为研究生 J.J.S. 提供的资助 。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 150 毫米直径培养皿 | VWR | 25384-326 | 步骤 6.1.1 用于固定晶圆 |
| 24 孔组织培养板 | VWR | 10062-896 | 步骤 10.3.6 用于接种电穿孔后的细胞 |
| 33220A 波形/函数发生器 | Agilent | 步骤 9.2.3 电穿孔脉冲发生器 | |
| 4 英寸硅晶圆 | University Wafer | 第 2.1 小节，用于微流控通道的制备 | |
| 6 孔组织培养板 | VWR | 10062-892 | 步骤 8.1.8 用于接种细胞 |
| 丙酮 | Fisher Scientific | A18-4 | 步骤 2.1.2 用于清洗， 以及步骤 5.1 光刻胶剥离 |
| Allegra X-22R 离心机 | Beckman Coulter | 步骤 8.1.4、8.3.2 和 8.3.3 用于离心收集细胞 | |
| AutoCAD 2018 | Autodesk | 第 1.1.1 小节，用于设计透明掩模 | |
| 缓冲氧化物刻蚀液 10:1 | VWR | 901621-1L | 第 3.1 小节，用于氢氟酸刻蚀 |
| CCD 单色显微镜相机 | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | 步骤 11.2.3 用于成像 |
| CMOS 相机 - Sensicam QE 1.4MP | PCO | 第 9.3 小节，实验装置的一部分 | |
| 导电环氧树脂 | CircuitWorks | CW2400 | 第 7.6 小节，用于导线连接 |
| 锥形离心管，15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | 步骤 8.1.4，用于细胞离心 |
| Dektak 3ST 表面轮廓仪 | Veeco (Sloan/Dektak) | 步骤 2.1.15 和 5.4，用于表面轮廓测量 | |
| 一次性活检打孔器，0.75 毫米 | Robbins Instruments | RBP075 | 步骤 6.2.3，用于入口通路 |
| 一次性活检打孔器，3 毫米 | Robbins Instruments | RBP30P | 步骤 6.2.3，用于出口通路 |
| DRAQ5 | abcam | ab108410 | 步骤 11.2.2，用于活细胞染色 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 | ThermoFisher Scientific | 11885084 | 步骤 8.1.2，培养基成分的一部分 |
| E3631A 双极三路直流电源 | Agilent | 步骤 9.2.1–9.2.2，实验装置的一部分 | |
| Eclipse TE2000-U 倒置 显微镜 | Nikon | 第 9.3 小节，实验装置的一部分 | |
| EVG620 紫外光刻系统 | EVG | 步骤 2.1.9 和 2.2.7，用于紫外曝光 | |
| 胎牛血清 | Neuromics | FBS001 | 步骤 8.1.2，培养基成分的一部分 |
| FS20 超声波清洗机 | Fisher Scientific | 第 5.1 小节，用于光刻胶剥离 | |
| 带盖玻璃培养基瓶，100 mL | Fisher Scientific | FB800100 | 步骤 8.2.1，用于缓冲液储存 |
| 带盖玻璃培养基瓶，500 mL | Fisher Scientific | FB800500 | 步骤 8.1.2，用于培养基储存 |
| HEK-293 细胞系 | ATCC | CRL-1573 | 第 8.1 小节，用于细胞培养 |
| HEPES 缓冲液 | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | 步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分 |
| 六甲基二硅氮烷 | Sigma Aldrich | 379212-25ML | 步骤 2.2.3，作为附着促进剂 |
| HF2LI 锁相放大器 | Zurich Instruments | 第 9.2 小节，实验装置的一部分 | |
| HF2TA 电流放大器 | Zurich Instruments | 第 9.2 小节，实验装置的一部分 | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | A459-1 | 步骤 2.1.2 用于清洗，步骤 2.1.14 用于 SU-8 显影后晶圆的冲洗，以及步骤 6.3.1 用于清洗 PDMS |
| IX81 荧光显微镜 | Olympus | 步骤 11.2.3 用于成像 | |
| L-谷氨酰胺溶液 | Sigma Aldrich | G7513-20ML | 步骤 8.1.2，培养基成分的一部分 |
| M16878/1BFA 22 号导线 | AWC | B22-1 | 第 7.5 小节，用于器件制备 |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich | 208337-100G | 步骤 8.1.2，电穿孔缓冲液成分的一部分 |
| MF 319 显影液 | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | 步骤 2.2.9，光刻胶显影液 |
| Microposit S1818 光刻胶 | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | 步骤 2.2.4，用于电极图案化的正性光刻胶 |
| 显微镜载玻片，75 × 25 毫米 | VWR | 16004-422 | 步骤 2.2.1，电极所用的钠钙玻璃基底 |
| Model 2350 高压放大器 | TEGAM | 2350 | 步骤 9.2.5，实验装置的一部分 |
| National Instruments LabVIEW | National Instruments | 数据采集 | |
| 针头，30G × 1 英寸 | BD Scientific | 305128 | 步骤 10.1.1，系统引液的一部分 |
| PA90 IC OPAMP 电源电路 | Digi-key | 598-1330-ND | 定制电路的一部分 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma Aldrich | P4458-20ML | 步骤 8.1.2，培养基成分的一部分 |
| 质粒 pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | 步骤 8.3.4，用于细胞内递送 |
| 塑料管，0.010'' × 0.030" | VWR | 89404-300 | 步骤 10.1.2，用于系统引液 |
| 铂靶材 | Kurt J. Lesker | 第 4.2 小节，用于物理气相沉积 | |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P9333-500G | 步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分 |
| Pump 11 PicoPlus 微流控注射泵 | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | 步骤 10.1.4，用于系统引液 |
| PVD75 物理气相沉积系统 | Kurt J. Lesker | 第 4.1 小节，用于物理气相沉积 | |
| PWM32 旋涂系统 | Headway Research | 步骤 2.1.6 和 2.2.2，用于基底上的光刻胶涂覆 | |
| PX-250 等离子体处理系统 | March Instruments | 第 7.2 小节，用于 PDMS 与玻璃基底的键合 | |
| SDG1025 函数/波形发生器 | Siglent | 步骤 9.2.2，实验装置的一部分 | |
| 氢氧化钠 | Sigma Aldrich | S8045-500G | 步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分 |
| SU-8 2010 负性光刻胶 | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | 步骤 2.1.7，用于微流控通道图案化 |
| SU-8 显影液 | Microchem | Y010200 | 步骤 2.1.12，用于光刻胶显影 |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S7903-1KG | 步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分 |
| Sylgard 184 弹性体试剂盒 | Dow Corning | 3097358-1004 | 步骤 6.2.1 PDMS 聚合物与固化剂的 10:1 混合物 |
| 注射器，1 mL | BD Scientific | 309628 | 步骤 8.3.4，系统引液的一部分 |
| SZ61 体视显微镜系统 | Olympus | 第 7.3 小节，用于通道与电极的对准 | |
| 组织培养处理 T25 培养瓶 | Falcon | 353108 | 步骤 8.1.2，用于细胞培养 |
| 钛靶材 | Kurt J. Lesker | 第 4.2 小节，用于物理气相沉积 | |
| 透明掩模 | CAD/ART Services | 步骤 2.1.9 和 2.2.7，用于光刻 | |
| 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 | Sigma Aldrich | 448931-10G | 步骤 6.1.2，用于晶圆硅烷化 |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma Aldrich | T4049-100ML | 步骤 8.1.3 和 8.3.1，用于细胞收获 |
参考文献
- Gao, Q. Q., et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).
- Aijaz, A., et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nature Biomedical En....
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