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方法文章

连续流动微电穿孔系统的构建与操作及其通透性检测

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DOI：

10.3791/63103

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2022年1月7日

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1The Department of Biomedical Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey

本文内容

摘要

本方案描述了构建一种芯片实验室微流控电穿孔装置所需的微加工技术。该实验装置可在连续流动条件下实现可控的单细胞水平转染，并可通过基于细胞群体的控制进一步扩展至更高通量。文中提供了分析结果，展示了实时电学监测细胞膜通透化程度的能力。

摘要

目前的治疗创新，例如CAR-T细胞疗法，高度依赖病毒介导的基因递送。尽管该方法效率较高，但其制造成本高昂，这促使人们关注使用其他替代方法进行基因递送。电穿孔是一种基于电物理原理的非病毒性方法，可用于将基因及其他外源性物质递送至细胞内。当施加电场时，细胞膜会暂时允许分子进入细胞。通常，电穿孔在宏观尺度上进行，以处理大量细胞。然而，这种方法需要大量的经验性实验来优化操作方案，当处理原代细胞或难以转染的细胞类型时，成本尤为高昂。漫长的方案开发过程，加上需要施加高电压以达到足以使细胞膜通透的电场强度，促使了微尺度电穿孔装置的发展。这些微电穿孔装置采用常见的微加工技术制造，能够在保持高通量潜力的同时，实现更精确的实验控制。本研究基于一种可在连续流动条件下以单细胞分辨率检测细胞膜通透化程度的微流控-电穿孔技术。然而，该技术此前仅能以每秒处理4个细胞的速度运行，因此本文提出并展示了一种提高系统通量的新方法。这种新技术被称为基于细胞群体的反馈控制，它通过评估细胞对多种电穿孔脉冲条件的通透化响应，确定最适合待测细胞类型的电穿孔脉冲参数。随后在高通量模式下，将该“最优”脉冲应用于流动中的细胞悬液。本文详细介绍了装置的制备步骤、微流控实验的设置与运行流程，以及结果分析方法。最后，通过将编码绿色荧光蛋白（GFP）的DNA质粒递送至HEK293细胞，验证了该微电穿孔技术的有效性。

引言

当前生物医学研究中的治疗创新，例如嵌合抗原受体工程T细胞（CAR-T）疗法以及利用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas9进行基因编辑，高度依赖于将外源物质成功且高效地递送至细胞内空间的能力1。在CAR-T疗法中，细胞治疗生产过程中进行基因递送的金标准方法是使用病毒载体2。尽管病毒介导的基因递送是一种高效的递送方式，但也存在若干缺点，包括制造成本高、细胞毒性、免疫原性、潜在的致突变性或致瘤性，以及对所递送基因大小的限制3。这些局限性推动了替代性非病毒递送技术的研究与开发。

电穿孔是一种替代病毒介导基因递送的方法，依赖于施加最佳的电脉冲波形，以实现对细胞的DNA、RNA和蛋白质转染。在外加电场作用后，细胞膜会短暂受损，从而使细胞易于摄取原本无法穿透的外源性物质4。与病毒介导的递送方法相比，电穿孔具有操作安全、易于操作和运行成本低等优势。电穿孔可递送小分子和大分子物质，并且在不同谱系的细胞转染中均能实现高效转染5。为了在电穿孔后获得理想的结果，即良好的细胞存活率和高效的电转染效率，需要共同优化多种实验参数。这些参数包括细胞类型6、细胞密度、分子浓度7、电穿孔缓冲液的性质（如分子组成、导电性和渗透压）8、电极尺寸/几何形状9以及电脉冲波形（波形形状、极性、脉冲次数）10（参见图1示意图）。尽管上述每个参数都可能显著影响电穿孔实验的结果，但脉冲波形尤其受到深入研究，因为所施加脉冲的电能是决定细胞存活率与电转染效率之间内在权衡关系的根本因素8。

通常，电穿孔实验在宏观尺度上进行，即将细胞悬浮于数百微升缓冲液中，置于电穿孔比色皿内一对较大的平行板电极之间。电极通常由铝制成，电极间距为1–4 mm。细胞通过移液手动加入后，将比色皿连接至体积较大的电脉冲发生器，用户可在设备上设定并施加所需的脉冲波形参数，以对细胞悬液进行电穿孔。尽管宏观尺度或批量电穿孔能够处理较高密度的细胞 >106 细胞/mL，当优化电脉冲波形参数时，这一特性可能造成细胞浪费。对于细胞数量有限的原代细胞类型进行电穿孔时，此问题尤为突出。此外，由于电极间距较大，脉冲发生器必须能够提供较高的电压，以达到所需的电场强度 >1kV/cm11这些高电压会导致电解质缓冲液中产生电阻性功率耗散，从而引起焦耳热效应，可能对最终的细胞活力造成不利影响。12最后，在细胞密度较高的悬浮液中进行电穿孔时， invariably 会存在转染效率和细胞存活率固有的变异性。悬浮液中的每个细胞由于周围细胞的影响，可能经历不同的电场强度。根据所经历的电场强度是增强还是减弱，细胞存活率或电转染效率均可能受到负面影响。11这些宏观电穿孔技术的缺点促使人们追求并开发了可在微观尺度上运行、并在单细胞水平上实现更好控制的替代技术。

生物微机电系统（BioMEMS）领域源于微电子行业的技术进步，特别是利用微加工工艺开发用于推动生物医学研究的微型装置。这些进展包括用于体内电生理监测的微电极阵列13、用于原位电穿孔的电容式微电极14、微型化器官芯片装置15、微流控即时诊断设备16、生物传感器17以及药物递送系统18，其中包括纳米级和微米级电穿孔装置19,20,21。由于能够设计和制造与生物细胞尺寸相当的装置，纳米级和微米级电穿孔技术相较于宏观尺度的同类技术具有显著优势22,23。这些电穿孔装置通常集成了间距为数十至数百微米的电极组，从而避免了高电压脉冲的应用需求。这一特性显著降低了电解液中的电流，进而减少了有毒电解产物的积累以及焦耳热效应的影响。微米级通道还可确保在施加脉冲期间向细胞施加更加均匀且可靠的电场，从而获得更一致的实验结果24。此外，微电穿孔装置通常被集成到微流控平台中，有利于未来进一步整合为全自动技术，这在细胞治疗制造中是一项极为理想的能力25。最后，微米级电穿孔还支持对电穿孔事件进行电学检测。例如，可在单细胞水平上实时监测细胞膜通透化的程度26,27。本方法旨在描述一种微流控单细胞微电穿孔装置的微加工工艺、系统操作及分析方法，该装置能够测量细胞膜通透化程度以优化电穿孔方案，同时较以往最先进的技术显著提高了通量。

单细胞水平的电穿孔技术已不再是一种新颖的方法，早在2001年，Rubinsky等人便通过开发静态细胞电穿孔技术首次实现了该方法28。他们的微装置具有创新性，因为他们是首次展示能够通过电信号实时监测电穿孔事件的研究者。这一进展进一步推动了静态单细胞电穿孔技术的发展，使其能够以并行方式电学检测细胞膜通透化的程度，从而提高设备的处理通量。然而，即使采用并行化和批量处理方式，这些设备在单位时间内可处理的细胞总数方面仍存在严重不足29,30。这一局限性促使了流通式装置的发展，这类装置能够在高得多的通量下实现单细胞水平的微电穿孔31。然而，从静态环境向流通式环境的设备转变，限制了在施加电穿孔脉冲后对细胞膜通透化程度进行电学监测的能力。本研究所描述的方法弥合了这两类技术之间的差距，实现了一种可在连续流动、逐个细胞串联模式下，对单个细胞的膜通透化程度进行电学检测、施加脉冲并实时监测的微电穿孔技术。

该技术最近在 Zheng 等人的研究中被描述。在该研究中，通过完成一项参数化研究，介绍了该技术的能力，其中改变了电穿孔脉冲的幅度和持续时间，并探究了反映细胞膜通透化的后续电信号32。结果表明，电穿孔脉冲强度的增加（即施加的电场强度增加或脉冲持续时间延长）会导致测得的细胞膜通透化程度升高。为了进一步验证该系统，向细胞悬液中添加了一种常用的荧光指示剂——碘化丙啶33，并在施加电脉冲后立即采集了荧光图像。光学信号，即细胞内碘化丙啶的荧光强度，与细胞膜通透化程度的电学测量结果高度相关，证实了该电学测量的可靠性。然而，该研究仅考虑了小分子碘化丙啶的递送，其本身几乎没有或不具备可转化的意义。

本研究介绍了一种该技术的新型应用，旨在提高系统通量，同时递送具有生物活性的质粒DNA（pDNA）载体，并评估电穿孔后重新接种并培养的细胞的电转染效率。尽管此前的工作在能够电学测量电穿孔事件的现有微电穿孔技术中表现更优，但当前设备的状态仍需要较长的细胞通过电极组之间的时间（约250 ms），以完成细胞检测、脉冲施加以及细胞膜通透性测量。在单通道条件下，这将通量限制在每秒4个细胞。为克服这一限制，本文提出了一种基于细胞群体的反馈控制电穿孔新概念，用于实现pDNA的电转染。通过使用低生理电导率的电穿孔缓冲液，该系统可在多种电穿孔脉冲条件下对单个细胞进行电学表征。根据细胞的电学响应，确定“最优”电穿孔脉冲参数。随后启用一种“高通量”模式，在该模式下取消细胞膜通透性测定，提高流速，并将电穿孔脉冲的占空比与细胞通过时间相匹配，以确保每个在电极间流动的细胞仅接受一次脉冲。本研究将详细阐述微器件制造过程中的微加工步骤、实验所需材料/设备及其组装方法，以及器件的操作与分析流程，包括其电转染效率（eTE）的评估。

电穿孔过程示意图，包含脉冲波形、缓冲液效应及细胞恢复步骤。
图1：影响电穿孔结果的实验因素。（左侧）细胞悬液——在电穿孔开始前需考虑的重要因素包括：载荷物（本例中为质粒DNA，pDNA）、浓度、细胞密度以及电穿孔缓冲液的性质。需考虑的缓冲液性质包括电导率、渗透压以及影响这些参数的具体分子组成。（中部）脉冲施加——必须优化确切的脉冲类型（方波与指数衰减波）和脉冲波形（单脉冲与脉冲序列），以最大程度提高细胞存活率和电转染效率。电穿孔过程中常用的脉冲序列通常由一系列高压（HV）脉冲，或在高压（HV）与低压（LV）脉冲幅度之间交替的脉冲组成。（右侧）细胞恢复——下游处理步骤，特别是细胞转移后所处的恢复性细胞培养基，也应进行优化。图中未显示（最左侧）其他可实施的上游细胞处理步骤，可用于整体电穿孔过程的优化。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

注意：使用者应查阅本实验方案中所用材料和耗材的所有材料安全数据表（MSDS）。每一步操作均应佩戴适当的个人防护装备（PPE），实验过程中须采用无菌操作技术。第1至第7节讨论装置的制备。

1. 器件制备——掩模设计

注意：微加工过程的示意图请参见图2。微加工步骤需在洁净室环境中进行。需要额外的个人防护装备（发网、胡须网、口罩、洁净服、鞋套）。

  1. 选择一款 CAD 软件，设计微流控通道和电极的二维“掩膜”，并将设计保存为所需的文件格式（例如 .dxf、.dwg）。
    注意：参见补充图 1以获取二维掩膜示意图的示例。
  2. 发送至选定的供应商进行打印。确保设计的尺寸在供应商的分辨率能力范围内。

2. 器件制备——光刻

注意：所提供的微加工工艺配方源自光刻胶制造商的建议，仅可作为起点使用34。对于烘焙时间、曝光时间等具体参数，需根据每项制备方案进行优化。建议使用晶圆镊子来操作硅晶圆和玻璃载片。

  1. 微流控通道制备
    1. 硅片和钠钙玻璃载片清洗：按照步骤 2.1.2–2.1.3 对硅片和 1" × 3" 钠钙玻璃载片进行清洗（两者均称为“基底”）。
    2. 将基底依次浸入丙酮浴、异丙醇（IPA）浴和去离子水浴中，每种溶液中各浸泡 10 分钟。在室温下依次完成这三步清洗。
    3. 取出基底后，使用加压氮气或过滤空气气源吹干表面。将基底放入 150 °C 烘箱中至少 30 分钟，以蒸发残留的水分。
    4. 硅片上的 SU-8 光刻：按照步骤 2.1.5–2.1.14 在硅片上进行光刻。
      注：为获得 20 µm 高度的微流控通道，使用了 SU-8 2000 系列负性光刻胶。具体旋转速率取决于 SU-8 的配方（如 2010、2015 等）；然而，以下条件适用于 SU-8 2010 配方35。
    5. 将硅片从 150 °C 烘箱中取出，冷却至室温（RT）。
    6. 使用匀胶机的真空系统将硅片固定在匀胶机卡盘上。设置匀胶程序：第一步 — 500 rpm 转速下旋转 10 秒，加速度为 100 rpm/s；第二步 — 1000 rpm 转速下旋转 30 秒，加速度为 300 rpm/s。
    7. 在硅片中心滴加 4 mL SU-8 2010 光刻胶。运行程序。待系统停止后，关闭真空。
    8. 使用镊子将涂有 SU-8 的硅片转移至 95 °C 热板上，进行 4–5 分钟的前烘（软烘）。然后将硅片从热板上取下，冷却至室温。
      注：请遵循实验室特定光刻掩模对准仪的正确启动程序。
    9. 将带有二维微流控通道设计的光掩模固定在掩模支架上。将硅片（SU-8 涂层朝上）插入到硅片卡盘上。
    10. 设置曝光参数为 150 mJ/cm2，运行设备。
      警告：切勿直视紫外光源，以免造成眼睛损伤。
    11. 将涂有 SU-8 的硅片置于 95 °C 热板上，进行 4–5 分钟的后烘（曝光后烘烤）。
    12. 将硅片浸入 SU-8 显影液（见材料表）中 3–4 分钟，并轻轻搅动。将硅片从溶液中取出后，用异丙醇冲洗表面。
    13. 使用加压氮气或过滤空气气源吹干表面。使用带紫外滤光片的显微镜检查图形，确保微流控通道无明显缺陷。
    14. 将硅片放入 150 °C 烘箱中至少 30 分钟，进行坚膜烘烤（硬烘）。
    15. 冷却至室温后，使用触针式轮廓仪测量通道侧壁的精确高度和坡度。
  2. 玻璃载片上的光刻
    注：六甲基二硅氮烷（HMDS）用作 S1818 正性光刻胶的附着力促进剂36。
    1. 将玻璃载片从 150 °C 烘箱中取出，冷却至室温。
    2. 使用真空将玻璃载片固定在匀胶机卡盘上，并设置匀胶程序：第一步 — 500 rpm 转速下旋转 10 秒，加速度为 100 rpm/s；第二步 — 3000 rpm 转速下旋转 30 秒，加速度为 300 rpm/s。
    3. 在玻璃载片表面滴加 3–4 滴 HMDS。运行程序。
      注：为获得约 3 µm 厚的表面涂层，应使用 S1800 系列正性光刻胶。具体旋转速率因配方而异；以下推荐适用于 S1818 配方34。
    4. 在玻璃载片表面滴加 1 mL 光刻胶，确保足以覆盖整个表面区域。
    5. 运行程序。待系统停止后，关闭真空并取下玻璃载片。
    6. 将涂有 S1818 的玻璃载片置于 120 °C 热板上，进行 4 分钟的前烘（软烘）。取出后冷却至室温。
    7. 将带有二维电极设计的光掩模固定在掩模支架上。
    8. 将玻璃载片（S1818 涂层朝上）插入并校准至硅片卡盘上。设置曝光参数为 250 mJ/cm2，运行设备。
      注：不同型号的接触式对准仪对非圆形或厚度不均的基底的兼容性可能有所不同。
    9. 将玻璃载片浸入 MF-319 显影液中 2 分钟，并轻轻搅动。用去离子水冲洗玻璃载片表面。
    10. 使用加压氮气或过滤空气气源吹干表面，并使用带紫外滤光片的显微镜观察图形。确保光刻图形无明显缺陷。
    11. 将玻璃载片放入 150 °C 烘箱中，确保待处理表面朝上，至少坚膜烘烤（硬烘）30 分钟。从烘箱中取出后避光保存。

3. 器件制备：氢氟酸（HF）刻蚀

警告：此步骤涉及氢氟酸（HF）的操作与处置，氢氟酸可导致深层且疼痛的化学灼伤。操作人员应使用额外的个人防护装备（面罩、肘长耐化学腐蚀手套、带袖耐化学腐蚀围裙）。葡萄糖酸钙酸中和剂及皮肤凝胶应放置在实验台附近。此步骤不得单独操作。氢氟酸绝不能储存在玻璃容器中或倾倒至玻璃容器内，因为酸会腐蚀容器表面。

注意：氢氟酸（HF）会均匀地蚀刻暴露的玻璃（即电极设计部分），在玻璃上形成凹槽，从而在金属沉积后（第4节）实现更优的电极图案边缘分辨率。

  1. 将载玻片浸入聚四氟乙烯容器中的10:1缓冲氢氟酸溶液中1分钟。转移载玻片并用去离子水清洗。重复清洗步骤3次。
  2. 使用加压氮气或过滤空气气源吹干表面。将玻璃基底置于65 °C烘箱中过夜，以去除任何残留水分。用遮光材料覆盖基底。

4. 器件制备：物理气相沉积

注意：此步骤涉及在玻璃载片基底上沉积金属以定义电极图案。常用的金属电极为铬/金和钛/铂。金和铂无法直接粘附于玻璃基底，因此需要分别使用铬或钛作为种子粘附层以增强粘附性37。

  1. 按照洁净室专用规程操作自制的物理气相沉积（PVD）系统。本实验采用直流溅射系统，在约 8 mTorr 的压力下使用 100 SCCM 氩气，以 200 W 功率进行溅射。
  2. 以约 100 Å/min 的速率溅射钛 8 分钟，再以约 200 Å/min 的速率溅射铂 10 分钟。随后将基底从 PVD 腔室中取出。

5. 器件制备：光刻胶剥离工艺

注意：此步骤需在丙酮溶液中溶解光刻胶层，从而在玻璃载片上留下已粘附的铂电极图案。

  1. 将镀有金属的玻璃载玻片浸入丙酮浴中约 10 分钟。
  2. 对丙酮浴进行超声处理，以产生扰动，破坏未附着的金属膜。如有必要，使用浸有丙酮的擦拭布去除任何残留物。
  3. 待所有光刻胶/金属去除后，用去离子水清洗电极图案，并将其置于 65 °C 的烘箱中过夜，以除去表面残留的水分。
  4. 使用触针式轮廓仪测量图案化电极的轮廓。

6. 器件制备：软光刻技术

注意：此步骤涉及使用弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS）将微流控通道通过复制模塑转印到SU-8模具的浮雕结构上。

  1. 硅片硅烷化处理
    注意：此步骤为可选步骤；然而，它将延长在第2.1小节中制备的SU-8微结构的使用寿命。该步骤应在化学通风橱中进行。
    1. 将硅片固定在培养皿底部，并将培养皿放入干燥器中。
    2. 在硅片周围滴加约50 µL的三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷。连接真空泵（或中央真空系统），抽真空20分钟。
  2. PDMS复制成型
    1. 在一次性容器（例如称量舟、塑料杯）中，使用电子天平按10:1的质量比混合PDMS弹性体基料与固化剂。将PDMS溶液浇注到硅片上，并将混合物置于真空环境中以去除所有气泡。
    2. 在65 °C下固化至少4小时，使PDMS完全固化。使用剃刀刀尖切割出成型的PDMS，并从硅片上剥离下来。
    3. 使用锋利的活检打孔器，去除器件进样口和出样口处的PDMS。本器件分别使用0.75 mm和3 mm的活检打孔器处理进样口和出样口。
      注意：所用活检打孔器的直径应略小于连接管路的外径，以确保管路在储液池中形成紧密密封。
  3. PDMS超声清洗
    1. 将PDMS器件浸入异丙醇（IPA）中，并放入超声仪中超声处理30–45分钟，以清除进样口和出样口处的PDMS碎屑。PDMS在IPA溶液中可能发生溶胀。
    2. 用去离子水冲洗后，置于65 °C烘箱中过夜，使PDMS恢复至正常尺寸。
      注意：残留碎屑可能在实验过程中堵塞器件。在超声处理前，可使用一小段透明胶带去除PDMS表面较大的碎屑。

7. 器件制备：PDMS 键合/导线连接

注意：此步骤涉及使用氧气等离子体处理PDMS和玻璃基底的表面，以在PDMS与玻璃之间形成不可逆的键合38。所提供的实验条件可能需要根据实验室所使用的具体系统进行调整。

  1. 将装置切割至所需尺寸，并确保PDMS装置表面清洁。若不洁净，请按照第6.3小节的步骤重新清洗。
  2. 设置等离子体发生器程序：将功率 设为70 W，时间 设为35 s，压力 设为325 mTorr，氧气气体的流速设为60 SCCM。将PDMS和带有电极的玻璃载片放入系统中，使结构面朝上，然后运行程序。
  3. 取出装置，使用体视显微镜快速将PDMS通道结构与电极对齐。从PDMS中心向两侧均匀施加压力，以排除键合界面处可能存在的气泡。
  4. 将装置置于95 °C的加热板上至少2分钟，以完成键合过程，随后在室温下自然冷却。
  5. 剪取两段长约6英寸的22号实心导线，并剥离两端的绝缘层。
  6. 使用银导电环氧树脂将导线键合至电极焊盘上。将完成的装置放入65 °C烘箱中过夜。

微流控通道工艺流程示意图，展示包含电极集成步骤的器件组装过程。
图 2：微器件的制备。（A）微流控通道制备关键步骤：硅片清洗（步骤 2.1.1–2.1.3）、光刻胶涂覆与前烘（步骤 2.1.7–2.1.8）、紫外曝光（步骤 2.1.10）、显影（步骤 2.1.12）以及 PDMS 浇注（第 6.2 节）。（B）电极制备关键步骤：玻璃片清洗（步骤 2.1.1–2.1.3）、HMDS 涂覆与光刻胶涂覆（步骤 2.2.3–2.2.4）、紫外曝光（步骤 2.2.8）、显影（步骤 2.2.9）、氢氟酸刻蚀（第 3 节）、物理气相沉积（第 4 节）以及光刻胶剥离（第 5 节）。（C）器件最终化关键步骤：进样口/出样口开孔与超声处理（步骤 6.2.3 及第 6.3 节）、PDMS 键合以及导线连接（第 7 节）。请点击此处查看该图的放大版本。

8. 细胞培养与收获

注意：应采用标准的细胞培养和无菌操作程序。遵循细胞类型特异性的细胞培养方案。

  1. 细胞培养
    1. 细胞传代：按照步骤 8.1.2-8.1.5 进行细胞的培养和传代。
    2. 在 T25 培养瓶中，使用完全 DMEM 溶液（88% DMEM、10% 热灭活胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素），于 37 °C、95% O2、5% CO2 的培养箱中培养 HEK293 细胞。当细胞融合度达到约 80% 时，按计划进行传代。
    3. 使用移液器或真空系统吸除培养基，在 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（2 mL-T25 培养瓶）中于 37 °C 孵育 2 分钟。用两倍体积的培养基中和胰蛋白酶。
    4. 将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 770 × g 条件下离心 2 分钟。使用移液器或真空系统吸除上清液。
    5. 用 1 mL 预热的 DMEM 重悬 HEK293 细胞。
    6. 细胞铺板：按照步骤 8.1.7-8.1.8 进行细胞铺板。
    7. 以 10:1 至 20:1 的稀释比例将细胞接种于 T25 培养瓶（含 5 mL DMEM）中以继续培养。
    8. 以 5:1 至 20:1 的稀释比例将细胞接种于 6 孔板（每孔 2 mL DMEM）中，用于后续电穿孔实验。
      注：为在细胞收获时达到约 70% 的融合度（见第 8.3 小节），应在电穿孔实验前 24 小时进行细胞铺板。不一致的收获时间可能导致电穿孔结果的变异。
  2. 电穿孔缓冲液
    1. 制备电穿孔缓冲液
      注：有关电穿孔缓冲液制备的具体信息，请参考 Sherba 等人的研究8。缓冲液组成为 285 mM 蔗糖、0.7 mM MgCl2、1 mM KCl、10 mM HEPES、3 mM NaOH（pH：7.4；渗透压：310 mOsm，电导率：500 µS/cm）。电穿孔缓冲液应以无菌方式配制，并在 4 °C 保存，有效期约为 1 个月。电穿孔缓冲液的配方应根据具体细胞类型进行优化。
  3. 细胞收获与质粒 DNA 添加
    1. 按照细胞传代的相同步骤（8.1.2-8.1.4）进行操作。
    2. 用无菌 1× PBS 洗涤细胞，将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 770 × g 条件下离心 2 分钟。
    3. 用电穿孔缓冲液洗涤 HEK293 细胞沉淀，在 770 × g 条件下离心 2 分钟。将细胞重悬于电穿孔缓冲液中，浓度约为 500 万个细胞/mL。
      注：细胞密度应根据具体细胞类型进行优化。
    4. 加入编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒 DNA，使其终浓度为 20 µg/mL。轻轻混匀质粒 DNA 与细胞悬液，并将悬液转移至 1 cc 注射器中用于实验。

9. 硬件/实验装置

注意：在收获细胞进行实验之前，应确保实验装置已准备就绪，以尽量减少细胞在电穿孔缓冲液中悬浮的时间。实验开始前20-30分钟打开电子设备，使其预热。有关单细胞检测模块操作的实验装置示意图，请参见图3。

注意：已研制一种定制的PA90运算放大器电路，以同时满足使用锁相放大器进行单细胞水平检测所需的灵敏度，以及施加足够强电穿孔脉冲所需的高电压。有关推荐电路的详细参数，请参阅PA90数据手册39。

  1. 根据算法设置并初始化带有电流前置放大器的锁相放大器。有关锁相放大器设置的具体细节，请参考 Zheng 等人的研究32。
  2. 电源、函数发生器和放大器
    1. 电源 1：设置为 -15 V，用于为电路的负端供电。
    2. 电源 2（函数发生器）：设置为输出直流信号，并将幅度设为 2 V。连接至 50 倍放大器输入端。
    3. 编程电穿孔脉冲发生器以产生方波：设置所需的脉冲宽度（占空比）和所需的脉冲幅度（伏特）。
    4. 将输出设置为触发模式（单次脉冲）。将输出连接至 50 倍放大器的输入端。
      注意：编程脉冲幅度时需考虑 50 倍的增益。例如，为实现 1 kV/cm 的电场强度，总共需要 30 V（30 V / 300 µm，即电极间距），因此函数发生器的输出应设置为 30/50，即 600 mV。
    5. 使用示波器验证 50 倍放大器的输出。输出 1：来自电源 2（9.2.2）的 1-100 V。输出 2：用于电穿孔脉冲的可变幅度信号（9.2.4）。
    6. 将 10 倍探头连接至示波器通道，并连接至第 7.6 步中已完成的微装置（待测器件，DUT），即电穿孔脉冲将施加的位置。在实验过程中监测系统，确保脉冲正确施加。
    7. 确保锁相放大器的 USB 已连接并注册。仔细检查算法代码中的所有锁相设置（最重要的是锁相输出频率）。
  3. 显微镜/CCD 相机
    1. 通过载玻片夹具将微装置放置在显微镜载物台上。打开 CCD 相机，并将微流控通道调至清晰对焦状态。使用 4 倍或 10 倍物镜。

静态平衡示意图；PA 90 放大器电路；电穿孔脉冲设置；系统监测。
图 3：实验装置示意图——单细胞检测。 高功率运算放大器（PA-90）可将高压电穿孔脉冲叠加到用于单细胞检测的锁相输出交流信号上。该激励信号通过微电穿孔装置（待测器件，DUT），产生的电流经由电流前置放大器放大后输入算法系统。系统持续监测细胞检测事件。当细胞进入时，锁相放大器会生成一个数字信号，以触发对正在通过的细胞施加电穿孔脉冲。图注：PA-90（高功率运算放大器），DUT（待测器件），DIO（数字输入/输出），FG-EP（函数发生器/电穿孔脉冲），50X（50倍放大器），PS-V-（电源/PA 90 的负电压），FG-V+（函数发生器，PA 90 的正电压）。请点击此处查看该图的放大版本。

10. 实验操作

  1. 微流控通道预处理
    1. 从装载细胞的注射器中去除所有气泡。将一根30 G针头连接到装载细胞的注射器上。
    2. 使用镊子将Tygon管沿针头全长滑下。用恢复培养基（与步骤8.1.2相同，但不含抗生素）预先填充出口储液池，体积约为40–50 µL。
    3. 用拇指轻轻推动推杆，使液体缓慢到达管路末端。
    4. 将注射器固定在注射泵上。打开注射泵，并确保其设置为正向灌注模式。
    5. 根据注射器的正确直径对泵进行编程，以确保流速准确。具体参数请参考泵的操作手册。
      注意：为防止细胞在注射器中沉降，应将注射泵固定在夹具架上，使其以垂直方向运行，且注射器端朝下。
    6. 设置注射泵流速约为10–20 µL/min，并让泵持续运行，直至液体到达管路末端。将管路固定至微流控装置。
    7. 降低注射泵流速至约5–10 µL/min，并让泵继续运行，直至微流控装置中的所有空气被排出，且细胞开始向装置出口移动。
    8. 通过移液器吸除出口处的细胞。用恢复培养基（与步骤8.1.2相同，但不含抗生素）重新填充出口储液池，体积约为40–50 µL。
  2. 单细胞电穿孔——细胞膜通透化图谱绘制
    注意：请参考图4和图5，以更好地理解指示细胞膜通透化的电学数据以及细胞膜通透化图谱。
    1. 将注射泵流速设置为约0.1–0.3 µL/min，以确保单个细胞依次通过电极组。细胞在电极之间的通过时间应约为250 ms。
    2. 点击运行启动计算机程序。确保系统正在保存电学数据。
    3. 确保系统能够可靠地检测细胞，以触发计算机控制的脉冲施加。根据需要调整检测阈值。
    4. 设置初始最低电能电穿孔脉冲的脉冲参数。本研究中的电穿孔脉冲参数请参见表1。
    5. 打开电穿孔脉冲发生器的输出通道（步骤9.2.3）。
    6. 按照预定数量进行细胞检测/脉冲施加（n = 100）。每种测试条件结束后，从微流控装置出口吸除细胞，并用恢复培养基补充出口储液池。
    7. 逐步迭代至下一个电穿孔脉冲条件。重复此过程，直至所有电穿孔脉冲条件均完成测试。
    8. 确定每次脉冲施加所导致的细胞膜通透化程度。（后处理验证方法见第11.1节）。生成细胞膜通透化图谱（图5）。
    9. 确定用于高通量、基于群体反馈的电穿孔脉冲参数。
    10. 关闭注射泵，从出口储液池中移除细胞，并用恢复培养基重新填充出口。
  3. 基于群体反馈控制的电穿孔——高通量操作
    注意：请参考图6，了解基于群体反馈过程的示意图。
    1. 将注射泵流速设置为约1–3 µL/min，以确保单个细胞依次通过电极组。细胞在电极之间的通过时间应约为25 ms。
    2. 将脉冲幅度设置为“优化”条件（10.2.9），关闭触发模式，并将脉冲宽度设置为与细胞通过时间相匹配。
    3. 设置占空比，使脉冲开启时间符合“优化”条件。具体参数请参见表1。
    4. 将函数发生器的输出通道设置为开启，启动注射泵，并让系统持续运行，直至完成目标数量细胞的电穿孔处理。
    5. 操作完成后，关闭注射泵和函数发生器。
    6. 将出口储液池中的细胞转移至适当尺寸的细胞培养瓶/板中，其中已加入预热的恢复培养基，并将培养瓶/板放入培养箱中。

11. 分析

  1. 单细胞水平膜通透性检测
    注意：为确保在高通量模块中使用了“最佳”脉冲参数，应在实验后对第10.2小节导出的电学数据进行分析验证。请参见图4，以获取代表电穿孔引起膜通透性的电信号的图示。
    1. 将数据载入分析软件（如MATLAB、Python等），针对每种脉冲条件生成电流-时间曲线图。
    2. 手动确定细胞膜通透化程度（ΔIP/ΔIC）。参见图4。在所有测试的脉冲条件下，生成细胞膜通透化图谱（ΔIP / ΔIC 与电能的关系图，图5），并验证“最佳”脉冲条件。
  2. 电转染效率（eTE）
    1. 在完成24小时孵育后，从孵箱中取出电穿孔后的细胞。
    2. 进行活细胞染色。将DRAQ5按1:1000稀释，使其在细胞培养容器中的终浓度为5 µM。轻柔混匀细胞与染色液，并在37 °C下孵育5–30分钟。
      注意：此步骤中可使用其他染料，但需确保其荧光特性不与指示电转染成功的荧光标记重叠（例如GFP为绿色波长，DRAQ5为远红波长）。
    3. 开启落射荧光显微镜、光源和相机（参见材料表）。
    4. 将细胞从孵箱中取出，并在显微镜下聚焦。
    5. 采集所选视野的相差图像（明场）。
    6. 使用FITC（GFP）和远红（DRAQ5）滤光片采集同一视野的落射荧光图像。通过人工或算法分析图像集。
      注意：代表性图像参见图7。
    7. 统计所有图像中GFP阳性细胞的总数，以及DRAQ5染色细胞的总数，计算eTE（GFP阳性细胞数与DRAQ5染色细胞数的比值）。

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结果

图4 展示了在单一脉冲幅度下，单细胞水平膜通透性检测的工作原理。在电穿孔实验启动后，细胞检测算法通过逐点、基于斜率的检测方法确定用于细胞识别的最佳阈值。系统随后持续监测（1）测量电流是否出现显著的负向变化，该变化表明有细胞进入。这是由于生物细胞膜具有绝缘特性，当细胞穿过电极对时，会导致阻抗瞬时升高，从而引起测量电流急剧下降，实现稳定的细胞检测（2），并最终触发切换至计算机控制的脉冲施加（4）。绝缘的细胞会置换电极之间的电解液体积，导致电流下降，其下降幅度与细胞大小成正比。这一电流变化记为 ΔIC（3）。在完成 ΔIC 计算后，系统立即向正在通过的细胞施加预设的电脉冲（4）。这一瞬时能量输入会在系统中引入短暂的检测干扰（灰色区域）。在信号重新锁定，即切换回细胞监测模式后（5），可以明显观察到电穿孔脉冲已使细胞膜发生通透化，因为细胞离开电极区域时，其所引起的电流变化幅度显著减小（6）。细胞在电穿孔脉冲施加前后因阻抗大小不同所导致的两次电流下降之间的差异称为通透化电流，记为 ΔIP

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讨论

本方案中介绍的方法主要聚焦于微流控装置的微加工，随后将其集成到专用的电穿孔实验装置中。在描述微加工过程的具体细节时，常使用“工艺参数”（recipe）这一术语，这暗示了遵循并优化每个步骤对于成功制备功能器件的重要性。然而，若某些关键步骤未经过优化，例如紫外光曝光时间/能量、物理气相沉积（PVD）溅射速率/持续时间以及氧气等离子体发生器的设置，可能会对器件的制备过程以及后续电穿孔实验的成功实施造成问题。微加工过程的故障排查主要通过试错法或更受控的实验设计（Design of Experiments）来完成。此外，还存在其他可替代的微加工技术，例如深反应离子刻蚀（DRIE），可用于替代本方案中的不同步骤（例如，使用DRIE刻蚀的模具结构来执行软光刻工艺）。此外，对于该领域的新手而言，优化工艺参数以及设计和制备器件可能耗时较长。然而，一旦微加工流程被成功建立，工程师或科研人员便可自由设计出满足其特定需求的器件。

为此，本方案中描述的装置是在我们先前研究32的基础上进一步拓展而开发的。该装置延续了单细胞膜通透性电学检测的方法，但实现了更高通量...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢美国国家科学基金会（NSF CBET 0967598，DBI IDBR 1353918）以及美国教育部精准与个性化医学新兴领域研究生培训项目（P200A150131）为研究生 J.J.S. 提供的资助 。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
150 毫米直径培养皿VWR25384-326步骤 6.1.1 用于固定晶圆
24 孔组织培养板VWR10062-896步骤 10.3.6 用于接种电穿孔后的细胞
33220A 波形/函数发生器Agilent步骤 9.2.3 电穿孔脉冲发生器
4 英寸硅晶圆University Wafer第 2.1 小节，用于微流控通道的制备
6 孔组织培养板VWR10062-892步骤 8.1.8 用于接种细胞
丙酮Fisher ScientificA18-4步骤 2.1.2 用于清洗， 以及步骤 5.1 光刻胶剥离
Allegra X-22R 离心机Beckman Coulter步骤 8.1.4、8.3.2 和 8.3.3 用于离心收集细胞
AutoCAD 2018Autodesk第 1.1.1 小节，用于设计透明掩模
缓冲氧化物刻蚀液 10:1VWR901621-1L第 3.1 小节，用于氢氟酸刻蚀
CCD 单色显微镜相机HamamatsuOrca 285 C4742-96-12G04步骤 11.2.3 用于成像
CMOS 相机 - Sensicam QE 1.4MPPCO第 9.3 小节，实验装置的一部分
导电环氧树脂CircuitWorksCW2400第 7.6 小节，用于导线连接
锥形离心管，15 mLFisher Scientific14-959-70C步骤 8.1.4，用于细胞离心
Dektak 3ST 表面轮廓仪Veeco (Sloan/Dektak)步骤 2.1.15 和 5.4，用于表面轮廓测量
一次性活检打孔器，0.75 毫米Robbins InstrumentsRBP075步骤 6.2.3，用于入口通路
一次性活检打孔器，3 毫米Robbins InstrumentsRBP30P步骤 6.2.3，用于出口通路
DRAQ5abcamab108410步骤 11.2.2，用于活细胞染色
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基ThermoFisher Scientific11885084步骤 8.1.2，培养基成分的一部分
E3631A 双极三路直流电源Agilent步骤 9.2.1–9.2.2，实验装置的一部分
Eclipse TE2000-U 倒置 显微镜Nikon 第 9.3 小节，实验装置的一部分
EVG620 紫外光刻系统EVG 步骤 2.1.9 和 2.2.7，用于紫外曝光
胎牛血清NeuromicsFBS001步骤 8.1.2，培养基成分的一部分
FS20 超声波清洗机Fisher Scientific第 5.1 小节，用于光刻胶剥离
带盖玻璃培养基瓶，100 mLFisher ScientificFB800100步骤 8.2.1，用于缓冲液储存
带盖玻璃培养基瓶，500 mLFisher ScientificFB800500步骤 8.1.2，用于培养基储存
HEK-293 细胞系ATCCCRL-1573第 8.1 小节，用于细胞培养
HEPES 缓冲液Sigma Aldrich83264-100ML-F步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分
六甲基二硅氮烷Sigma Aldrich379212-25ML步骤 2.2.3，作为附着促进剂
HF2LI 锁相放大器Zurich Instruments第 9.2 小节，实验装置的一部分
HF2TA 电流放大器Zurich Instruments第 9.2 小节，实验装置的一部分
异丙醇Fisher ScientificA459-1步骤 2.1.2 用于清洗，步骤 2.1.14 用于 SU-8 显影后晶圆的冲洗，以及步骤 6.3.1 用于清洗 PDMS
IX81 荧光显微镜Olympus步骤 11.2.3 用于成像
L-谷氨酰胺溶液Sigma AldrichG7513-20ML步骤 8.1.2，培养基成分的一部分
M16878/1BFA 22 号导线AWCB22-1第 7.5 小节，用于器件制备
氯化镁Sigma Aldrich208337-100G步骤 8.1.2，电穿孔缓冲液成分的一部分
MF 319 显影液Kayaku Advanced Materials10018042步骤 2.2.9，光刻胶显影液
Microposit S1818 光刻胶Kayaku Advanced Materials1136925步骤 2.2.4，用于电极图案化的正性光刻胶
显微镜载玻片，75 × 25 毫米VWR16004-422步骤 2.2.1，电极所用的钠钙玻璃基底
Model 2350 高压放大器TEGAM2350步骤 9.2.5，实验装置的一部分
National Instruments LabVIEWNational Instruments数据采集
针头，30G × 1 英寸BD Scientific305128步骤 10.1.1，系统引液的一部分
PA90 IC OPAMP 电源电路Digi-key598-1330-ND定制电路的一部分
青霉素-链霉素Sigma AldrichP4458-20ML步骤 8.1.2，培养基成分的一部分
质粒 pMAX-GFPLonzaVCA-1003步骤 8.3.4，用于细胞内递送
塑料管，0.010'' × 0.030"VWR89404-300步骤 10.1.2，用于系统引液
铂靶材Kurt J. Lesker第 4.2 小节，用于物理气相沉积
氯化钾Sigma AldrichP9333-500G步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分
Pump 11 PicoPlus 微流控注射泵Harvard ApparatusMA1 70-2213步骤 10.1.4，用于系统引液
PVD75 物理气相沉积系统Kurt J. Lesker第 4.1 小节，用于物理气相沉积
PWM32 旋涂系统Headway Research步骤 2.1.6 和 2.2.2，用于基底上的光刻胶涂覆
PX-250 等离子体处理系统March Instruments第 7.2 小节，用于 PDMS 与玻璃基底的键合
SDG1025 函数/波形发生器Siglent步骤 9.2.2，实验装置的一部分
氢氧化钠Sigma AldrichS8045-500G步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分
SU-8 2010 负性光刻胶Kayaku Advanced MaterialsY111053步骤 2.1.7，用于微流控通道图案化
SU-8 显影液MicrochemY010200步骤 2.1.12，用于光刻胶显影
蔗糖Sigma AldrichS7903-1KG步骤 8.2.1，电穿孔缓冲液成分的一部分
Sylgard 184 弹性体试剂盒Dow Corning3097358-1004步骤 6.2.1  PDMS 聚合物与固化剂的 10:1 混合物
注射器，1 mLBD Scientific309628步骤 8.3.4，系统引液的一部分
SZ61 体视显微镜系统Olympus第 7.3 小节，用于通道与电极的对准
组织培养处理 T25 培养瓶Falcon353108步骤 8.1.2，用于细胞培养
钛靶材Kurt J. Lesker第 4.2 小节，用于物理气相沉积
透明掩模CAD/ART Services步骤 2.1.9 和 2.2.7，用于光刻
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷Sigma Aldrich448931-10G步骤 6.1.2，用于晶圆硅烷化
胰蛋白酶-EDTA 溶液Sigma AldrichT4049-100ML步骤 8.1.3 和 8.3.1，用于细胞收获

参考文献

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