非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝脏细胞外基质的三维成像

摘要

本方案优化了肝脏 原位 灌注/脱细胞化与双光子显微镜方法，以建立可靠的平台，用于可视化非酒精性脂肪性肝炎（NASH）过程中细胞外基质（ECM）重塑的动态变化。

摘要

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是美国最常见的慢性肝病，影响超过7000万美国人。NASH可进展为肝纤维化，并最终发展为肝硬化，而肝硬化是肝细胞癌的重要风险因素。细胞外基质（ECM）通过基质细胞信号提供结构支持并维持肝脏稳态。via肝脏纤维化源于动态ECM重塑过程中的失衡，其特征是结构成分的过度积聚以及糖胺聚糖的相关改变。NASH典型的纤维化模式被称为"鸡丝样"，通常表现为基于Masson三色染色和天狼星红染色所观察到的3区窦周/细胞周围纤维化。然而，这些传统的基于二维（2D）组织切片的薄层成像技术无法展示ECM结构的详细三维（3D）变化，从而限制了对肝脏纤维化中动态ECM重塑过程的理解。

本研究优化了一种快速高效的方法，用于对肝脏中天然细胞外基质结构进行成像 通过 脱细胞化以应对上述挑战。小鼠分别喂食普通饲料或快餐饮食持续14周。脱细胞化在之后进行 原位 门静脉灌注及双光子显微镜技术被用于成像和分析天然细胞外基质（ECM）的变化。对正常肝脏和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝脏的三维图像进行了重建与分析。执行 原位 灌注脱细胞化并结合双光子显微镜分析支架，为可视化肝脏中动态细胞外基质重塑提供了实用且可靠的平台。

引言

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是最常见的肝脏疾病，影响约20%至25%的成年人群。其中25%的NAFLD患者会进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），此时发生肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌的风险显著增加¹。预计在未来20年内，NASH将在美国导致约200万例与肝脏相关的死亡²。由于目前尚无获批的治疗方法，迫切需要阐明导致NASH患者肝纤维化的机制，并开发针对性治疗策略³。

细胞外基质（ECM）是一种动态且复杂的微环境，可与细胞进行双向通讯，从而调控组织稳态⁴。肝脏ECM由蛋白聚糖、胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白等结构成分以及其他非结构蛋白（如嗅觉蛋白和血小板反应蛋白）组成，为组织提供物理和结构支持⁴。

肝纤维化是对多种病因所致肝损伤的一种慢性伤口愈合反应，包括非酒精性脂肪性肝炎（NASH）³。其成因是动态细胞外基质（ECM）重塑过程失衡，表现为受损肝脏中结构蛋白过度沉积⁴。纤维化的发生依赖于不同肝细胞类型之间的动态细胞间通讯。肝星状细胞（HSCs） 在活化后可分化为表达平滑肌α-2肌动蛋白、具有迁移和增殖能力的类肌成纤维细胞，并合成ECM蛋白以实现伤口闭合。活化的HSCs是肝脏中主要的胶原蛋白生成细胞¹。

细胞外基质重塑的分子机制、纤维化模式及其与细胞事件的关系尚不明确。对三维（3D）结构的深入理解 细胞外基质的结构仍然至关重要，尽管质谱技术已有助于分析细胞外基质的蛋白质组成⁴传统上，Masson三色染色、苦味酸天狼星红染色以及二次谐波成像（SHG）均在二维（2D）肝组织薄切片上进行。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）典型的纤维化模式称为 "铁丝网，" 延伸至3区，表现为窦周/细胞周纤维化^5,6然而，目前尚缺乏针对天然肝脏三维结构的研究，尤其是无需组织切片的技术手段。开发强大的成像方法，以识别肝纤维化过程中动态细胞外基质重塑中纤维化的模式与特征，将显著加深对NASH机制的理解，并有助于发现新的治疗靶点。

为应对这些挑战，优化了一种快速高效的方案，用于成像天然肝细胞外基质 通过 脱细胞化⁷全肝脱细胞是一种通过洗涤剂灌注去除肝脏细胞成分，同时保留天然三维细胞外基质（ECM）网络的技术。小鼠分别接受普通饲料或快餐饮食（FFD）喂养，持续14周。脱细胞处理在喂养结束后进行。 原位 门静脉灌注温和去垢剂并采用低流速以保存三螺旋及天然纤维状胶原结构。应用双光子显微镜分析细胞外基质（ECM）中胶原结构的变化。重建并分析了正常肝脏与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝脏中天然ECM结构的三维图像。执行 原位 灌注脱细胞化并结合双光子显微镜分析支架，为观察肝脏中动态细胞外基质重塑提供了一个实用且经济的平台。

方案

动物实验根据斯坦福大学和帕洛阿尔托退伍军人事务医院的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的实验程序进行。6至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分别喂食普通饲料或含4.2%高果糖玉米糖浆（见材料表）的快餐饮食，持续14周⁵。小鼠饲养于标准笼具中，维持12小时明暗循环环境。

1. 肝脏灌注的手术准备与操作步骤

1. 在操作前称量小鼠的体重。
2. 通过腹腔注射氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉（参见 材料表通过腹腔注射给药。在进行下一步操作前，通过脚趾夹捏法确认小鼠已完全麻醉。
   注意：由于这是非存活手术，此处不需要异氟烷。
3. 使用毛发修剪器剃除腹部毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。将小鼠仰卧放置，用胶带将其四肢固定在手术板上。
4. 通过夹捏脚趾再次确认麻醉深度后，使用梅奥剪刀和艾德森镊子（参见 材料表在下腹部外侧做一条3 cm的横向切口，然后从下腹部至剑突做一条5 cm的纵向切口。注意避免打开胸腔。
5. 打开腹膜后，将肠管轻柔地移至动物左侧，并用棉签轻轻抬起肝脏右叶（参见 材料表暴露门静脉。
6. 使用24G静脉导管插管门静脉。将导管插入门静脉远端，导管尖端置于门静脉分支进入肝叶之前的位置。
7. 当导管进入静脉时，立即拔出针头。使用1 mL注射器向肝内灌注PBS，以确认导管在静脉内的位置是否正确。 通过 导管
   ​注意：PBS 灌注后，所有叶应立即变白。若导管位置正确，静脉血将迅速流经导管。
8. 使用 Dumont 显微镊子、Castroviejo 显微持针器和 4-0 缝线（参见 材料表在门静脉分叉下方缝合一针，并在其下方1厘米处缝合第二针以固定导管。

2. 组织脱细胞

1. 使用鲁尔接头将导管连接至一段硅胶管（长约1 m，内径3 mm，外径4.1 mm）。将硅胶管连接至蠕动泵和盛有去离子水的储液瓶（见材料表）。
2. 仔细去除管路内的气泡，并在灌注过程中避免产生新的气泡。将蠕动泵设置为流速0.2 mL/min（即288 mL/24 h）。
3. 首先用去离子水灌注（约50 mL/只小鼠），持续2 h。灌注过程中肝脏颜色将由红色变为黄色。
   注意：动物在灌注10分钟后将死亡。
4. 更换灌注液为0.5%（wt/vol）脱氧胆酸钠（DOC，见材料表），继续灌注过夜（18 h，约250 mL/只小鼠）。灌注结束时肝脏将变为白色（图1）。
5. 再次更换灌注液为去离子水（约50 mL/只小鼠），继续灌注2 h。
6. 使用Dumont显微镊和显微弹簧剪（见材料表）取出脱细胞肝脏，并在培养皿中用PBS小心清洗。
7. 将脱细胞组织切成小块，用于立即成像，或于-80 °C冷冻保存，以进行后续生化分析，如串联质谱、ELISA或Western blot。

3. 成像用载玻片的制备（使用多光子/共聚焦荧光显微镜）

1. 取一小块脱细胞肝脏组织（<3 × 3 × 3 mm）置于显微镜载玻片上，并将组织放置于中央位置。
2. 用移液器向组织中加入 10 µL 抗荧光淬灭封片液（见材料表），以防止组织干燥。
3. 用盖玻片覆盖组织，并施加轻微压力以压平样品。用无色透明指甲油密封盖玻片边缘（图2）。
   ​注意：由于使用的是直立式双光子显微镜，因此样品上需加盖玻片。但如果使用倒置显微镜，样品的放置方式可有所不同。

4. 图像采集

1. 在盖玻片顶部滴加一滴浸油，将玻片放置在显微镜载物台上。降低20倍油镜物镜，使其接触浸油。
2. 切换至紫色（405 nm）通道，打开快门，并对样品进行聚焦。导航并定位待成像的兴趣区域。在切换至使用激光光进行图像采集前，关闭快门。
3. 切换至计算机控制并启动双光子激光器。首先打开双光子激光器（图3A），然后打开双光子激光控制器（见材料表）和快门（图3B、C）。确保输出功率高于2.5 W。
   降低激光功率以防止荧光淬灭。选择并调节探测器（包括光电倍增管和混合探测器），以适配所选用的荧光染料。
   注：双光子成像在860 nm激发波长下进行。分别选择两个通道用于胶原蛋白二次谐波生成（SHG）和双光子激发荧光（TPEF） 成像。其中一个通道对应415–445 nm波长范围，用于检测来自SHG信号的胶原蛋白精细结构；另一通道覆盖465–669 nm范围，用于收集TPEF信号。
4. 选择同时或顺序图像采集模式。将针孔调整至最大值。调节激光波长、增益、功率和偏移量。调节像素驻留时间、像素尺寸、平均次数和缩放倍数（图4A）。
5. 滚动计算机z轴控制器，设置z轴范围，定义起始点和终止点，并选择在体积内（z-stack）采集的图像数量。开始采集图像。
   注：此处选择20 µm的Z轴扫描范围和1 µm的Z步进尺寸（图4B）。

结果

采用二次谐波生成和双光子显微镜检测胶原纤维。信号来源于易碎的三螺旋结构以及天然的纤维状胶原结构。未使用特异性抗体来分析胶原蛋白亚型；但该方法可被添加至成像技术中。

在未进行脱细胞处理的情况下研究肝组织时，很难获得胶原网络的高分辨率图像（图5A）。在脱细胞后的细胞外基质（ECM）中，胶原纤维（绿色）呈现平行或交织排列（图5B）。普通饮食（Chow）组与高脂饮食（FFD）组小鼠肝脏中细胞外基质成分的形态和空间分布存在明显差异。普通饮食小鼠的胶原纤维呈现出交织且结构良好的网络；而在高脂饮食小鼠中，胶原纤维束的连接性较差（图5B）。

为了进一步研究肝脏细胞外基质（ECM）的三维结构，采集了切片在20 µm Z轴体积（厚度）和1 µm Z轴步长条件下的图像。食...

讨论

本方案表明，通过低流速十二烷基碳酸钠（DOC）进行脱细胞化 原位 灌注法可保护脆弱的三螺旋及天然纤维状胶原结构，为捕捉非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝纤维化过程中动态的细胞外基质（ECM）重塑提供了可靠且经济有效的平台。尽管在鉴定ECM组分或构建用于细胞培养的生物支架前，已对正常和纤维化肝脏进行了脱细胞处理，但肝纤维化中ECM重塑的动态过程尚未得到充分研究^8,9,10该方法使研究者能够对不同纤维化模型进行比较。

目前，已有多种灌注方案使用脱氧核糖核酸酶（DNase）、十二烷基硫酸钠（SDS）或曲拉通X-100¹¹。由于需要大量溶液，DNase的成本较高。SDS是一种强烈的变性溶液，属于阴离子去垢剂，可破坏细胞膜并使蛋白质变性，因此在SDS灌注后完整保留整个胶原网络具有挑战性。相比之下，曲拉通X-100是一种温和的非变性非离子型去垢剂...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-0 MONOCRYL 无色 1 x 18" P-3	MONOCRYL	Y494G
4-0 缝合线	Fisher Scientific	10-000-649	https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
盐酸赛拉嗪注射液（xylazine）	AnaSed	NDC 59399-110-20	本药物须由持证兽医开具处方或在其指导下使用。
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. 导管（含 BC 技术）	BD	382612
标准饲料	Envigo	# 2918	对照饮食。一种固定配方、不可高压灭菌的饲料，采用优质原料制成，旨在支持啮齿类动物的妊娠、哺乳和生长。
快餐饮食（AIN76A 西式饮食）	测试饮食	1810060	https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
苏木精和伊红染色试剂盒	Vector Laboratories	H-3502	https://vectorlabs.com/苏木精和伊红染色试剂盒.html
Kent Scientific 大鼠手术套件	Fisher Scientific	13-005-205	https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
盐酸氯胺酮注射液	Vedco	NDC 50989-996-06 - 10 mL - 小瓶	除给药与剂量部分列出的物种外，KetaVed 还在非人灵长类动物中进行了临床研究。
Leica SP5 直立式共聚焦多光子显微镜	Leica	SP5
鲁尔接头（带SPIN-LOCK的三通旋塞阀）®)	bbraun	D300	https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red 染色试剂盒	Polysciences, Inc.	24901	https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
棉签	清教徒	25-806 1PR
脱氧胆酸钠	sigmaaldrich	D6750-100G
糖浆	www.target.com	710 毫升	该链接为商品购买页面，不属于 JoVE 教育与科学内容范畴，无需翻译。
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VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000-10	https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html