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基于草甘膦产品对微生物组潜在影响的量化分析

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DOI：

10.3791/63109

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2022年1月10日

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1Biodiversity Unit, University of Turku, 2Department of Biology, University of Turku, 3Nutrition and Health Unit, Eurecat Technology Centre of Catalonia, 4Department of Biochemistry and Biotechnology, Rovira i Virgili University

本文内容

摘要

基于草甘膦的产品（GBP）是全球最常用的广谱除草剂。本文介绍了从田间实验到生物信息学分析，量化GBP对微生物组影响的一般性指南。

摘要

基于草甘膦的产品（GBP）是全球最常用的广谱除草剂。草甘膦的作用靶点是莽草酸途径中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）酶，该途径在植物中几乎普遍存在。该酶被抑制后，会阻断三种必需氨基酸——苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成。EPSPS同样存在于真菌以及原核生物（如古菌和细菌）中；因此，GBP的使用可能会影响土壤、植物、植食性动物及次级消费者微生物组的组成。本文旨在提供一套通用指南，以评估GBP从田间试验到生物信息学分析对微生物组的影响，并提出若干可验证的假设。文中介绍了两项田间试验，用于检测GBP对非靶标生物的影响。首先，采集并分析了10个重复设置的对照组和GBP处理组样地中的植物相关微生物，这些样地模拟了免耕种植系统。在第二项实验中，采集了施用含草甘膦残留物的家禽粪肥与未处理对照粪肥的实验样地样本。通过EPSPS蛋白序列的生物信息学分析，评估微生物对草甘膦的潜在敏感性。评估GBP对微生物组影响的第一步是确定其对靶标酶（EPSPS）的潜在敏感性。微生物序列可通过公共数据库获取，或通过PCR扩增获得。然而，在大多数田间研究中，微生物组的组成通常是基于通用DNA标记（如16S rRNA和内转录间隔区（ITS））来确定的。在此类情况下，只能通过与近缘物种的EPSPS序列进行概率分析，间接估算其对草甘膦的敏感性。基于EPSPS酶评估生物对草甘膦潜在敏感性的方法，为后续研究靶标和非靶标抗性机制提供了可靠途径。

引言

现代农业中大量使用农药显然是导致生物多样性下降的主要因素之一1。本文聚焦于草甘膦，因为基于草甘膦的产品（GBPs）由于其高效性和低廉的价格，已成为全球使用最广泛的农药2,3。除在农田中用于杀灭杂草外，GBPs 还普遍应用于林业、城市环境和家庭园艺；此外，按照生产商的说明使用时，它们曾被宣称对非靶标生物无毒。然而，越来越多的近期研究表明，草甘膦及其降解产物的残留物可能在土壤中滞留并被迁移，从而对非靶标生物产生连锁效应4,5,6,7,8。草甘膦的影响不仅限于植物——莽草酸途径也存在于许多真菌和原核生物中。草甘膦的作用靶点是莽草酸途径中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS），也称为aroA9。该酶在合成三种必需芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的莽草酸途径中处于核心地位，广泛存在于大多数原核生物、植物和真菌中10,11。一些微生物物种通过多种机制（包括EPSPS序列的突变）已发展出对草甘膦的部分或完全抗性。因此，有研究提出，GBPs的使用可能直接影响植物和动物的微生物组，包括人类肠道微生物组12,13,14。然而，GBPs的使用可能对几乎所有依赖微生物及微生物介导过程的生态系统功能和服务产生不利影响。由此带来的威胁可能涉及土壤生化过程、传粉生物学以及动物和人类的健康福祉。这迫切需要更全面地理解草甘膦如何影响莽草酸途径，并开发评估微生物对草甘膦敏感性的方法。

在本实验方案中，我们介绍了一套从田间试验到生物信息学分析的完整流程，用于检测草甘膦及其制剂（GBPs）对微生物组的影响。我们详细描述了一种近期发表的生物信息学方法，该方法可用于评估生物体对草甘膦的潜在敏感性12。据研究人员所知，这是目前首个且唯一可用于评估EPSPS酶对GBPs活性成分内在敏感性的生物信息学工具。该生物信息学方法基于在草甘膦靶标酶（EPSPS）中检测已知的氨基酸标记位点12。该流程分为五个主要工作阶段（图1）：1）简要介绍两项用于测试GBPs影响的田间试验；2）微生物组分析（16S rRNA、ITS及EPSPS基因）的简要概述；3）从公共数据库中收集EPSPS序列；4）确定生物体对草甘膦的潜在敏感性；5）基于通用微生物标记基因（16S rRNA和ITS）评估EPSPS的分类归属。

方案

1. 两项用于检测 GBPs 效应的田间试验

注意：本方案提供了两个田间实验设计示例，用于检测GBPs对植物相关微生物的影响。两项实验均在芬兰图尔库大学鲁伊萨洛植物园（60º26'N，22º10'E）的休耕地上进行，这些地块此前未使用过除草剂或用于农业生产。土壤类型为富含有机质的砂质黏土。

  1. 实验1
    注意：本实验旨在模拟免耕农业的一般农作实践，在生长季前后施用草甘膦（GBP），以控制杂草。
    1. 将实验田划分为10个重复的对照组和GBP处理小区（23米×1.5米），小区之间设置植被缓冲带（本研究于2014年春季进行15）（图2）。
    2. 使用旋耕机将各小区耕作至5厘米深度，并每年处理两次。本研究中，分别在生长季初期（5月）和末期（10月）进行处理。
    3. 对照组小区喷施自来水（每小区5升），GBP处理小区喷施商用草甘膦制剂（草甘膦浓度为450 g·L-1，施用剂量为6.4 L·ha-1，溶于每小区5升自来水中），以模拟农业实践中允许的最大草甘膦用量（3 kg·ha-1）。
    4. 使用手动压力喷雾器进行施用。在施用GBP两周后，按照常规农作方式，在各小区播种燕麦（Avena sativa）、蚕豆（Vicia faba）、芜菁油菜（Brassica rapa subsp. oleifera），并种植马铃薯（Solanum tuberosum）。
    5. 在生长季期间，人工除草以尽量保持对照组与GBP处理组之间的植物竞争状况和土壤结构一致。
    6. 采集实验植物的微生物群样本。本研究中，自2017年至2020年，每年生长季期间对GBP处理组和对照组小区连续采集微生物群样本。
    7. 从田间采集十份植物样本（根部和叶片）的重复样本，立即置于冰上，并运送至实验室进行后续处理，具体方法见第2.1节。
  2. 实验2
    注意：本实验旨在评估循环食品经济相关的风险；更具体而言，旨在研究施用含有草甘膦残留的粪肥对作物植物的影响2（图3）。
    1. 从为期12个月的笼养实验中收集鹌鹑的垫料，包括木屑、粪便及部分洒落的饲料，这些鹌鹑分别饲喂含草甘膦污染或对照饲料16,17。
      注意：含草甘膦污染的饲料由有机蛋鸡饲料添加相当于160 mg草甘膦/kg的剂量组成，相当于成年日本鹌鹑每日每千克体重摄入12–20 mg草甘膦16,17。
    2. 为验证，将饲料样品分六批送至认证实验室检测草甘膦浓度。
    3. 此外，在暴露12个月后检测鹌鹑排泄物样本中的草甘膦残留。对照组饲喂相同有机饲料，但不添加草甘膦16,17。
    4. 在笼养实验期间，每两周更换一次垫料。从暴露8至12个月期间定期收集GBP处理组和对照组的使用后垫料，按处理方式分别混合，储存在密闭容器中，并置于6 °C干燥避光的储藏室中，待后续作为肥料使用。
    5. 在实验田中以6×6棋盘式布局设置18个GBP处理小区和18个对照小区（每个小区1米×1米），分别在两个时间点人工施用12升垫料。本研究中，垫料分别于2018年8月和2019年5月施用。
    6. 在垫料施用后立即取样，并送至认证实验室检测草甘膦浓度（本研究于2019年5月进行）。
    7. 在每个小区种植多年生牧草和草莓植株，以研究其根部和叶片的微生物群。
      注意：本研究中，每个小区种植四株多年生牧草（Festuca pratensis）和两株草莓（Fragaria x vescana），用于分析其根部和叶片微生物群。

2. 微生物组分析（16S rRNA、ITS 和 EPSPS 基因）

注意：大多数微生物组研究基于高通量测序技术，对细菌的16S rRNA基因和真菌群落的内转录间隔区（ITS）区域进行分析。因此，本文未提供有关EPSPS类型的详细信息。数千个物种的EPSPS序列可在公共数据库中获取（方案部分3）（图4）。

  1. 16S rRNA基因
    1. 从上述实验中采集的离体叶片和根部样品中，鉴定内生微生物（即生活在植物组织内部的微生物）。
    2. 用自来水清洗植物样品，然后进行表面灭菌以去除附生微生物（即附着在植物组织表面的微生物）。使用3%次氯酸钠溶液处理3分钟，接着用70%乙醇溶液处理1分钟，并用高压灭菌的超纯水洗涤三次，每次1分钟。
    3. 将样品在-80 °C下冷冻保存，直至进行基因组DNA提取。
    4. 使用市售的植物DNA提取试剂盒，按照制造商提供的操作说明进行基因组DNA提取。
    5. 针对提取的DNA样品，采用嵌套PCR方法扩增16S rRNA基因的V6-V8可变区，使用特异性结合细菌DNA的鉴别性引物18，从而最大限度减少宿主植物DNA的扩增。
    6. 经过三轮聚合酶链式反应（PCR）后，为目标基因添加条形码和接头序列，以制备测序模板。请参照步骤2.1.7–2.1.11进行PCR扩增。
    7. 根据所需样品数量配制PCR主混合液，使每反应体系总体积为30 µL，包含30 ng DNA、1× PCR缓冲液、0.2 mM dNTPs、每种引物0.3 µM以及2000 U/mL DNA聚合酶。第二轮和第三轮PCR同样按照此步骤操作。
    8. 第一轮PCR使用引物799F19和1492R（经20修改）（表1）。在热循环仪上设置扩增程序：95 °C预变性3分钟，随后进行35个循环（95 °C变性45秒，54 °C退火45秒，72 °C延伸1分钟），最后在72 °C延伸5分钟。
    9. 将第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板，通过电泳检测扩增效果（取5 µL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳），然后将剩余的25 µL PCR产物按1:10比例用高压灭菌的超纯水稀释。
    10. 使用稀释后的PCR产物作为模板，结合引物uni-1062F21和uni-1390R22 （表1）进行第二轮PCR。PCR反应体系和扩增程序与步骤2.1.8相同，但循环数减少至25个。
    11. 将第二轮PCR产物按1:1比例用高压灭菌的超纯水稀释，进行第三轮PCR，使用与步骤2.1.8相同的扩增程序进行8个循环，为目标产物添加条形码和P1接头序列。
  2. 文库制备
    1. 使用生物分析仪检测PCR产物的浓度和质量，并将每个样品含有30 ng DNA的等量体积合并至一个1.5 mL离心管中，以构建等摩尔文库。
    2. 利用自动化DNA片段筛选系统，在琼脂糖凝胶卡盒中通过片段大小分选，选择350–550 bp大小的扩增子。注意此步骤同时可去除非特异性扩增产物和PCR试剂。将目标大小的扩增子洗脱液收集至卡盒中的收集管中，获得纯化的16S rRNA基因文库。
    3. 将洗脱液转移至1.5 mL离心管中，使用生物分析仪检测其纯度和浓度。用高压灭菌的超纯水将DNA文库稀释至终浓度为26 pM，样品即可用于测序。
  3. ITS
    注意：ITS 区域使用ITS特异性引物（表1）进行扩增，所得PCR产物将被标记上条形码和P1接头序列以用于测序。
    1. 按照第2.1节所述相同方案，使用ITS引物配制PCR主混合液。
    2. 在热循环仪上设置扩增程序：95 °C预变性5分钟，随后进行35个循环（95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟），最后在72 °C延伸7分钟。
    3. 取5 µL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，并将剩余25 µL产物按1:10比例用高压灭菌的超纯水稀释。将稀释后的PCR产物作为第二轮PCR的模板。
    4. 根据所需样品数量配制PCR主混合液（参考步骤2.1.6），使用带条形码的正向引物和带P1接头的反向引物。扩增程序与步骤2.3.2相同，但循环数设为8个。
    5. 按照第2.2节所述方案对所得PCR产物进行测序前处理。
  4. EPSPS基因
    1. 对微生物的EPSPS基因进行测序与分析。
      注意：为了探究草甘膦（GBP）暴露是否改变了群落中对草甘膦敏感和耐受的微生物组成，需对微生物的EPSPS基因进行测序与分析。因此，从可比对紧密基因组簇（ATGC）数据库中广泛收集了353条来自多种微生物分类群的EPSPS基因序列，并对所有蛋白序列进行了比对22。这些比对结果可在ATGC数据库23中获取，可用于从保守区域设计引物。一个易于使用的生物信息学工具已被开发，用于从多序列比对中识别保守区域，该工具可在Pere Puigbo研究页面24获得。然而，详细描述该网络服务器的使用超出了本出版物的范围。尽管如此，图4中提供了一个可行的实验方案，用于利用这些引物扩增EPSPS基因，以评估微生物组对草甘膦的敏感性。

3. 从公共数据库收集EPSPS蛋白序列

  1. 用于宏观进化研究的EPSPS序列
    1. 从公共数据库中收集EPSPS蛋白，例如PFAM23（蛋白家族数据库25）、GenBank24​（基因、基因组和蛋白质数据库26）、COG25 （直系同源蛋白簇27；来自古菌和细菌的直系同源蛋白数据库）以及PDB26 （蛋白质数据库28；蛋白质结构数据库）。
      注：研究人员最近的一项研究表明，这些蛋白可用于对具有莽草酸途径的生物体中草甘膦潜在影响进行微观进化和比较分析12。作者开发了一个用户友好的网站，汇总了数万个EPSPS蛋白序列的信息29，其中包括来自人类肠道微生物组的手动整理蛋白数据集12。这些预计算数据集中的信息包括当前将EPSPS分为对草甘膦可能敏感和耐受的分类、物种的分类学信息、EPSPS活性位点的注释，以及链接至PDB和NCBI数据库的信息。此外，该网络服务器还包含EPSPS的ID代码以及多个外部数据库的链接（表2）。
  2. 用于微观进化研究的EPSPS序列ATGC
    注：通用蛋白序列数据库适用于在进化关系较远的生物之间进行比较研究；然而，从进化角度看，草甘膦的潜在影响相对较新。因此，在某些研究中，有必要比较亲缘关系较近的物种（例如同一细菌物种的不同菌株），以确定草甘膦的影响14。在这种情况下，包含大量亲缘关系密切的古菌和细菌基因组的可比对紧密基因组簇（ATGC）数据库30是更合适的资源。ATGC数据库包含来自数千个基因组的数百万个蛋白信息，这些基因组被组织成数百个簇30。每个基因组簇都是可比对的（基因组在≥85%长度上共享共线性）且紧密的（同义替换率低于饱和水平）。研究人员在最近的一项研究中使用ATGC数据集分析了EPSPS蛋白的微观进化变化14。以下步骤用于在ATGC中识别EPSPS蛋白序列：
    1. 从链接31下载完整的ATGC数据库，并将COG0128（数据库中对应EPSPS蛋白的编码）32的所有蛋白下载至本地项目中。
      注：如果研究人员/实验人员位于芬兰，CSC-IT科学中心33提供存储和软件设施。重要的是将所有序列以FASTA格式收集。
    2. 基于COG0128构建一个包含原核生物代表性物种中EPSPS蛋白直系同源物的BLAST数据库。CSC已预装BLAST程序34，可使用命令 makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot 创建EPSPS序列的参考数据库。
    3. 使用迭代BLAST搜索命令 blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150 将ATGC数据库比对到COG0128.fa（EPSPS蛋白）上。
    4. 结果将生成每个簇内的EPSPS蛋白序列数据集。一个来自ATGC数据库的亲缘关系密切的EPSPS蛋白序列预计算数据集已可获取29。

4. 确定生物体对草甘膦潜在敏感性的算法（EPSPSClass 网络服务器：输入、处理与输出）

注意：研究人员已开发一个易于使用的服务器，可免费在29获取，用于确定EPSPS蛋白序列的类别12,35。该服务器仅需输入FASTA格式的蛋白序列，即可确定该序列与各类EPSPS的序列相似性百分比及其对草甘膦的潜在敏感性。此外，用户还可利用该网络服务器检测自定义的参考序列和氨基酸标记。首先，算法（图5）使用多序列比对程序35将查询序列与参考序列比对，以确定氨基酸位点；随后，通过检测氨基酸标记的存在情况，判定查询序列所属的EPSPS类别（I、II、III或IV）。

  1. 将 FASTA 格式的 EPSPS 蛋白质序列输入到文本框中，以确定该酶的类别（图 6A），然后点击 发送。
  2. 根据服务器提供的输出结果，评估查询序列对草甘膦的潜在敏感性（图 6B-E）：
    输出 1：查询序列中存在的氨基酸标记物比例（即一致性，对应 I、II 和 IV 类），以及基序数量（对应 III 类）。
    输出 2：基于标记残基的查询序列与参考序列的比对结果。
    输出 3：查询序列与参考序列的完整成对比对结果。
    输出 4：EPSPS 参考序列：Vibrio cholerae（vcEPSPS，I 类）、Coxiella burnetii（cbEPSPS，II 类）、Brevundimonas vesicularis（bvEPSPS，III 类）、Streptomyces davawensis（sdEPSPS，IV 类）。
  3. 在输出页面末尾，可找到指向 blastp 和保守结构域等外部工具的链接，用于进一步分析查询的 EPSPS 序列（图 6F）。

5. 利用通用微生物标记基因（16S rRNA 和 ITS）评估 EPSPS 类别

注意：大多数微生物组研究基于对16S rRNA和/或ITS36的分析。在这种情况下，无法对EPSPS序列进行直接分析。因此，有必要采用一种概率方法来估计生物体对草甘膦的潜在敏感性。该分析方法简单，可对微生物组项目中EPSPS序列类型提供合理的估计。该过程分为三个步骤（图7和图8）：

  1. 从公共数据库中鉴定EPSPS序列。已从PFAM37、GenBank38、COG39、PDB40、ATGC30中整理并预先计算了一个包含代表性序列的综合性EPSPS类别数据集。可通过EPSPSClass服务器主页访问这些数据集，其中包含超过50,000条序列的分类学信息及其EPSPS类别（图7）。
  2. 在生长季节期间每两周测量一次实验植株的高度，并在野外试验季结束时称量植株的地上生物量，以比较GBP处理区与对照区植株的生长情况。
    注：来自野外试验的微生物组分析尚未完全完成。
  3. 使用电子表格将微生物组实验中获得的细菌OTU（基于16S rRNA或ITS）映射到预先计算的数据集中。
    注：先前的研究表明，EPSPS类别（即对草甘膦的内在敏感性）在系统发育群内高度保守14。因此，可以相对安全地推断，高度保守分类单元中亲缘关系较近的物种可能对草甘膦具有相似的EPSPS响应（图8）。
  4. 在同一电子表格中，基于概率评分计算对草甘膦的内在敏感性（S = s / (s + r + u)，其中S：敏感性评分；s：潜在敏感序列数量；r：潜在抗性序列数量；u：未分类序列数量），该评分由公共数据库中已知的EPSPS序列计算得出。
    注：该评分范围为0（某一分类单元中未发现敏感EPSPS序列）至1（某一分类单元中所有序列均对草甘膦敏感）（图8）。此外，还存在介于两者之间的值，即含有敏感、抗性或未知菌株的物种。

结果

本实验方案的目的是提供一个从田间实验到生物信息学分析的通用流程，用于量化生物体对除草剂草甘膦的潜在敏感性。在实验2中，鹌鹑饲料中的平均草甘膦浓度为164 mg/kg，排泄物样本（尿液和粪便混合）的平均草甘膦浓度为199 mg/kg。饲喂含草甘膦（GBP）污染饲料的鹌鹑所收集的垫料中，草甘膦平均含量为158 mg/kg，而对照组垫料中草甘膦含量为0.17 mg/kg（表3）。在田间实验中，植物物种对土壤中残留的草甘膦表现出不同的响应（第1节）。燕麦和芜菁油菜在对照土壤中的生物量高于经GBP处理的土壤。然而，在生长季末期，蚕豆和马铃薯似乎从GBP处理中受益15。家禽粪便中的草甘膦抑制了草地羊茅（Festuca pratensis）和草莓（Fragaria x vescana）的生长（第1节）。田间实验的微生物群分析尚未完全完成，因此此处未予展示（第2节）。本实验方案的结果，无论是直接读取（如第3和第4节所示）还是间接推断（第5节），均可用于衡量数据集中对草甘膦潜在敏感和耐受的生物体比例（图9）。该方法已在一组从公共数据库获取的核心人类肠道微生物组微生物物种的EPSPS蛋白序列集合上进行了测试12。在该研究中，使用EPSPSClass方法分析了101种最丰富的细菌物种中的890个菌株，以量化敏感和耐受细菌的比例。结果表明，核心人类肠道微生物组中54%的物种对草甘膦具有潜在敏感性12。这一趋势在大多数原核生物中也普遍存在；此外，在真核生物（主要是植物和真菌）中，潜在敏感物种的比例甚至更高12。此外，我们已利用该方法在微进化水平上量化EPSPS蛋白敏感性的变化（图10）14。在分析的32个亲缘关系密切的原核生物类群中，我们发现了其中12个类群的敏感性状态发生了变化（表4）14。因此，持续使用含草甘膦产品（GBPs）可能导致植物、动物和土壤微生物组中出现微生物失调（即敏感与耐受细菌物种之间的失衡）。此外，已有假说认为，草甘膦耐受细菌的增加可能促进多重耐药微生物组的形成14,41,42。因此，本实验方案有助于解释上述各种情形，因为EPSPS分类方法可直接估算微生物组对草甘膦的内在敏感性。由于EPSPS蛋白对草甘膦的内在敏感性在系统发育上具有保守性14，因此可以将已有数据集的结果外推至未知的微生物组（图8）。

草甘膦暴露敏感性示意图；田间试验，EPSPS 数据流，敏感性分析。
图 1：总体流程图 本图展示了从田间试验到生物信息学分析的草甘膦敏感性研究总体流程。请点击此处查看此图的放大版本。

轮作计划示意图，包括对照组（C1-C10）和草甘膦残留处理组（G1-G10），种植作物为芜菁、燕麦、蚕豆和马铃薯。
图2：田间试验1，用于检测草甘膦残留物对作物相关微生物的影响。 试验田由10个对照小区和10个草甘膦残留处理小区（23 m × 1.5 m）交替排列组成，小区之间设有1.5 m宽的缓冲带。自2014年起，每年施用两次，草甘膦处理小区施用市售草甘膦产品（草甘膦浓度为450 g L⁻¹，施用量为每小区6.4 L ha⁻¹，溶于5 L自来水中），对照小区则仅施用等量不含草甘膦的自来水。施药时使用手动加压喷雾罐，并在喷头处加装塑料罩，以防止草甘膦扩散至处理小区外。在草甘膦施用后经过两周的安全期，于各小区播种燕麦（Avena sativa）、蚕豆（Vicia faba）和芜菁油菜（Brassica rapa subsp. oleifera），并种植马铃薯（Solanum tuberosum）。自2014年试验开始以来，已多次采集所研究作物的叶片和根部微生物群落样本。 请点击此处查看该图的放大版本。

禽舍实验图表：鹌鹑粪便对植物样地的影响；微生物组分析的数据采样。
图3：田间实验2检验了饲喂含草甘膦（GBP）饲料的日本鹌鹑粪便残留物对两种多年生作物及其相关微生物组的影响。 从为期12个月的禽舍实验中收集垫料，该实验中日本鹌鹑被喂食对照饲料或含草甘膦（GBP）污染的饲料，随后将这些垫料作为有机肥用于田间实验。实验田由18个对照样地和18个GBP样地（每个1 m × 1 m）组成，以6 × 6棋盘式排列。垫料分别于2018年8月和2019年5月两次施用于实验田（每样地25 L）。对照样地施用来自喂食对照饲料鹌鹑的垫料，GBP样地则施用来自喂食含GBP饲料鹌鹑的垫料。对照垫料中草甘膦残留量为0.17 mg/kg，GBP垫料中为158 mg/kg。2018年9月，即首次施用垫料约一个月后，每个样地种植了两种内生真菌共生型（E+）、两种无内生真菌型（E-）的Festuca pratensis以及两种Fragaria x vescana。在连续两个生长季（2019年和2020年）期间，对植物生长表现与适应性进行了测定，并采集了与根部和叶片相关的微生物组样本。请点击此处查看该图的放大版本。

用于基因测序的PCR过程示意图；微生物上的引物；测序文库的构建。
图4：利用16S rRNA基因/ITS 区域分析微生物分类群，以及利用EPSPS基因分析微生物组对草甘膦的敏感性。（A）分析16S rRNA或ITS序列以鉴定微生物分类群。（B）分析EPSPS序列以鉴定微生物对草甘膦的敏感性（GS—草甘膦敏感型/GR—草甘膦抗性型）请点击此处查看该图的放大版本。

显示EPSPS类别及同源性标记百分比的DNA序列比对示意图。
图5：用于鉴定EPSPS蛋白序列类别的算法。 输入为FASTA格式的EPSPS蛋白序列。该算法通过与参考蛋白序列中已知的氨基酸标记进行比对，判断其对草甘膦的潜在敏感性。该算法已在可免费访问的网络服务器EPSPSClass29上实现。请点击此处查看该图的放大版本。

EPSP 合酶序列分析设置、序列输入、比对结果、分类身份图表、BLAST 运行。
图 6：EPSPSClass 网络服务器的基本输入与输出。（A）输入：以 FASTA 格式提供的 EPSPS 蛋白质序列。（B）输出 1 — 身份识别：查询序列中存在于各分类（I–IV 类）及基序（III 类）的氨基酸标记所占比例。（C）输出 2 — 身份识别：查询序列与参考序列的比对结果。（D）输出 3 — 查询序列与参考序列的成对比对。（E）参考 EPSPS 序列：Vibrio cholerae（vcEPSPS，I 类）、Coxiella burnetii（cbEPSPS，II 类）、Brevundimonas vesicularis（bvEPSPS，III 类）、Streptomyces davawensis（sdEPSPS，IV 类）。（F）用于执行额外 blastp 搜索及保守结构域鉴定的链接 请点击此处查看该图的放大版本。

EPSPS 合酶分类示意图；预计算数据集、分类学数据、物种预测。
图 7：获取EPSPS序列的预计算数据集。 按照图中指示操作，以访问EPSPS序列的预计算数据集。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示微生物敏感性分类、数据集以及从金黄色葡萄球菌到岛屿硫化叶菌的微生物组项目图表。
图8：在无EPSPS序列的情况下，估算微生物组项目中潜在敏感性的示例。 本示例使用了可比对紧密基因组簇数据库中的数值30，该数据库包含原核生物物种的序列。微生物组项目中的假想物种包括Staphylococcus aureus、Corynebacterium diphtheriae、Campylobacter jejuni、Chlamydia psittaci 和 Sulfolobus islandicus。草甘膦敏感性评分的计算方式为：敏感序列数 / 序列总数。请点击此处查看此图的放大版本。

微生物组对草甘膦的响应；敏感型、耐药型、未分类；示意图，时间进程。
图 9：本实验方案结果的解释示意图及假设的进化情景。（A）在某一微生物组中，潜在敏感型（绿色）与耐药型（红色）细菌的比例约为50:50。黑点表示未分类的微生物物种，因此其对草甘膦的敏感性未知。在某些微生物组中，敏感型细菌的比例略高，例如人类肠道微生物组12。（B）随着时间推移，草甘膦的使用可能导致微生物失调（即敏感型与耐药型细菌比例失衡），从而引发不同的假设情景。（C）假设情景1（无选择压力）：草甘膦的使用对微生物组无影响，因此敏感型与耐药型细菌的比例保持不变。（D）假设情景2：草甘膦的使用清除了对草甘膦敏感的细菌。我们推测该情景可能具有剂量依赖性。（E）假设情景3：草甘膦使用带来的选择压力促进了EPSPS基因的突变，从而改变细菌的敏感性状态。因此，整个微生物群落均变为对草甘膦耐药。此外，在此情景下，多重耐药细菌的数量可能增加。（F）假设情景4：草甘膦的使用改变了某些细菌物种的组成，导致向耐药型细菌偏移的失衡状态，而部分细菌物种则保持不变，可能由于存在其他耐药机制，如外排泵或EPSPS基因的过表达13。该情景也可能导致草甘膦耐药细菌增加，以及细菌对其他抗生素的耐药性增强。请点击此处查看该图的放大版本。

草甘膦抗性系统发育树图；分类学、生活方式、GC 含量分析。
图 10：草甘膦预测敏感性在物种系统发育树中的分布。 饼状图表示对草甘膦可能敏感（绿色）或耐药（红色）的物种比例，以及未分类的物种（黑色）。本图经 Rainio 等人许可改编。14 请点击此处查看此图的放大版本。

用于蛋白质分析的序列插入界面；包含FASTA和氨基酸标记输入字段。
图11：EPSPSClass网络服务器的输入与输出，用于测试用户自定义的参考序列。（A）输入1：查询序列。（B）输入2：参考序列。（C）输入3：参考序列中的氨基酸标记。（D）输出：同一性：查询序列中氨基酸标记的比例（I-IV类及用户自定义的参考序列）。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：微生物组分析中用于16S rRNA基因和ITS区PCR扩增的引物列表 请点击此处下载该表格。

表2：不同数据库中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的编码信息 请点击此处下载该表格。

表3：草甘膦平均浓度 请点击此处下载该表格。

表4：对草甘膦敏感/耐药的物种百分比汇总表。 本表格经Rainio等人14许可改编。 请点击此处下载该表格。

表5：参考序列中氨基酸标记物的位置 请点击此处下载该表格。

讨论

本方案提供了基于EPSPS蛋白分析来量化草甘膦（GBP）对微生物组影响的一般性指导。该方案包含三个关键步骤：（i）从微生物组数据中定量EPSPS蛋白。此步骤至关重要，因为EPSPS是除草剂的直接作用靶标酶。因此，携带EPSPS基因拷贝的物种可能受到GBP使用的影响。然而，即使缺乏EPSPS基因拷贝的物种，也可能通过非靶向的其他机制受到除草剂的影响43,44。（ii）如果研究设计中未包含对EPSPS基因 的分析，则可通过分析16S rRNA（细菌）或ITS（真菌）获得较为可靠的估算结果。在此情况下，必须依赖一个全面的参考数据库（例如，ATGC数据库提供了多种近缘物种的EPSPS蛋白序列）。（iii）根据EPSPS活性位点的特定氨基酸残基，可将EPSPS蛋白划分为对草甘膦可能敏感或耐受的类型。然而，单个氨基酸的突变可能改变这种分类45，且不同类别之间的转变可能在相对较短的时间内发生14。

通过参考基因组、氨基酸标记和序列比对，可以确定生物体对草甘膦的潜在敏感性。（i）参考基因组： 根据氨基酸标记和基序（对于III类）的存在情况，EPSPS酶可被归类为对草甘膦潜在敏感（I类[α或β]46,47）或耐受（II类48,49、III类50和IV类51）。这些氨基酸标记和基序基于Vibrio cholerae（vcEPSPS，I类）、Coxiella burnetii（cbEPSPS，II类）、Brevundimonas vesicularis（bvEPSPS，III类）和Streptomyces davawensis（sdEPSPS，IV类）中EPSPS蛋白的氨基酸残基位置。（ii）氨基酸标记：草甘膦与EPSPS酶相互作用，并与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP，EPSPS酶的第二个底物）竞争52,53。在某些物种中，EPSPS序列中的少量氨基酸变化可提高对PEP的亲和力，从而产生对草甘膦的抗性12, 14, 52, 54, 55。在其他序列中，草甘膦以非抑制性构象结合EPSPS序列45。尽管已有大量关于对草甘膦具有抗性12,14,48,49,52,54,55和耐受性56,57的EPSPS序列的报道，目前EPSPS的分类系统仍分为四大类（I–IV）12（表5）。（iii）序列比对：为了对一种EPSPS酶进行分类，我们使用多序列比对程序的默认参数35-，将待测序列分别与各参考序列（vcEPSPS、cbEPSPS、bvEPSPS和sdEPSPS）进行成对比对。这些比对对于识别待测序列中氨基酸标记的位置至关重要。最终，根据是否存在氨基酸标记，将酶归类为I类、II类和/或IV类；而III类则依据基序标记进行判定12-。

该方案基于四种已知类型的EPSPS：一种类型敏感，其余三种具有抗性。然而，原核生物中约有10%的EPSPS序列尚未分类（古菌中占16%，细菌中占8%）12。因此，后续研究应分析这些序列以确定其对草甘膦的敏感性。EPSPSClass服务器提供了一个选项，可用于测试新的遗传标记。已知EPSPS类别的鉴定过程简单明了，如第4.4节和图5所示。此外，在用户希望比较自身查询序列与参考蛋白的情况下，服务器还提供了一个选项，允许手动添加参考序列及一组氨基酸标记（图11）。该功能可用于识别EPSPS的新类别，以及测试其他除草剂及其靶标序列。

EPSPS 类别的分析基于序列分析以及氨基酸标记的存在/缺失情况。这是一种可用于田间假设检验的初步估计。文献中已根据实证和观察研究确定了氨基酸标记46,47,48,49,50,51。然而，用于确定 EPSPS 类别的参考蛋白序列仅在有限数量的物种中经过验证，可能偶尔无法解释草甘膦抗性。补偿性突变的影响以及与 EPSPS 相关的结构域（主要存在于真菌中）也可能影响对草甘膦的敏感性58。本文的分析基于四类 EPSPS。对人类肠道微生物组中细菌的调查显示，约 30% 的细菌未被分类（即这些物种的 EPSPS 蛋白不属于任何已知类别），尚需进一步研究以鉴定其他 EPSPS 类别。此外，应注意细菌和植物中的 EPSPS 蛋白为单结构域，而真菌的 EPSPS 蛋白包含多个结构域59。因此，真菌中蛋白质的折叠可能导致 EPSPS 酶对草甘膦产生不同的反应。此外，本文未考虑其他非靶标介导的抗性机制（例如外排泵及 EPSPS 基因的过表达13）或敏感性机制（例如草甘膦对线粒体转运链的影响12）。

尽管草甘膦自1974年起作为除草剂使用，并自1991年以来被广泛使用，但这是首个用于确定生物体对草甘膦潜在敏感性的生物信息学方法。该方法基于在目标序列中识别已知的氨基酸残基，因此可为草甘膦对物种的潜在影响提供基础性评估。在不久的将来，新的生物信息学方法应纳入更多类别的EPSPS蛋白，以确定未分类序列对草甘膦的潜在敏感性12,54,55此外，鉴于EPSPS酶的具体行为可能因单个氨基酸的改变而有所不同12,14,52,54,55此外，进一步的计算机模拟实验应考虑EPSPS蛋白折叠过程中的微小变异，以及与EPSPS相关的结构域对真菌中该蛋白结构的影响。58此外，已有研究表明，通过过表达EPSPS蛋白可产生对草甘膦的耐受性56,57；因此，基于生物信息学的分析依赖于 改善 密码子使用偏好60 可用于鉴定新的 EPSPS 最大化或最小化基因表达的序列。

农民、政策制定者和决策者迫切需要深入了解大量使用农药所带来的风险。因此，既需要能够揭示生物体对农药潜在敏感性的生物信息学工具，也需要在不同环境中开展的具有充分重复、随机化设计且贴近田间实际情况的实验研究。本文介绍的用于分析生物体对草甘膦敏感性的生物信息学方法，可经调整后应用于其他农药的研究。同样，实验生态学方法也可用于探讨任何相关的生态学问题。结合使用这两类方法，可有效揭示田间观测结果、基因组数据与农药使用之间的因果关系。所有这些方法在风险评估中均具有重要价值。例如，生物信息学方法可用于监测微生物对农用化学品的适应性，为评估潜在的其他相关风险提供定量手段，包括病原体对农用化学品抗性的增强、对综合害虫管理（IPM）中用作生物防治剂的微生物产生的负面影响，以及细菌抗生素抗性的增加等。

致谢

本工作由芬兰科学院资助（资助号 311077，授予 Marjo Helander）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2100 Bioanalyzer 仪器AgilentG2939B用于检测 PCR 产物的浓度和质量
dNTP 混合液（各 10 mM）ThermoFisher ScientificR0192用于 PCR 反应
GoTaq G2 DNA 聚合酶试剂盒PromegaM7848用于 PCR 扩增的 PCR 缓冲液和 DNA 聚合酶
Invisorb Spin Plant Mini 试剂盒INVITEK Molecular1037100300用于从植物组织中提取基因组 DNA
Ion Chip MinifugeThermoFisher Scientific4479672用于微生物 PCR 产物的靶向测序
Ion PGM 系统ThermoFisher Scientific4462921用于微生物 PCR 产物的靶向测序
Ion PGM Torrent 服务器ThermoFisher Scientific4483643用于微生物 PCR 产物的靶向测序
PippinprepSageSciencePIP0001用于 PCR 扩增子的片段大小分选
压力罐Berthoud102140用于田间喷洒基于草甘膦的产品
引物Sigma Aldrich定制合成用于 PCR 扩增
旋耕机Grillo984511用于实验地块的土壤耕作
S1000 ThermalCyclerBIO-RAD1852196用于 PCR 扩增

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草甘膦对微生物组的影响EPSPS酶莽草酸途径微生物组组成16S rRNA测序ITS区扩增生物信息学分析植物微生物群微生物敏感性
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