本方案描述了细胞膜亲和色谱（CMAC）柱的制备方法，其中固定化了含有功能性跨膜原肌球蛋白激酶受体B蛋白的细胞膜片段。同时阐述了CMAC柱在鉴定复杂天然混合物中与这些受体相互作用的特化植物代谢物中的应用。
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本文内容
摘要
摘要
植物、真菌、细菌和海洋无脊椎动物合成的化学物质一直是新药发现和先导化合物的重要来源。临床上常用的他汀类药物、青霉素、紫杉醇、雷帕霉素和青蒿素等药物，最初均是从天然产物中鉴定并分离得到的。然而，从天然来源中鉴定和分离具有生物活性的特化代谢物是一个具有挑战性且耗时的过程。传统方法通常是在生物量提取后，从复杂的混合物中逐一分离和纯化单个代谢物，随后通过功能检测来验证这些分离分子的生物活性。本文介绍了使用细胞膜亲和色谱（CMAC）柱直接从复杂混合物中鉴定生物活性化合物的方法。CMAC柱能够鉴定与固定在天然磷脂双分子层环境中的功能性跨膜蛋白（TMP）相互作用的化合物。这是一种靶向策略，要求研究者事先明确希望用新发现的小分子候选药物进行调控的跨膜蛋白靶点。在本实验方案中，我们介绍了一种制备固定化原肌球蛋白激酶受体B（TrkB）的CMAC柱的方法，TrkB已被认为是多种神经系统疾病药物发现的可行靶点。本文提供了详细的实验步骤，介绍如何利用过表达TrkB受体的神经母细胞瘤细胞系构建固定化TrkB受体的CMAC柱，并进一步阐述了评估该色谱柱功能性的方法，以及将其应用于鉴定与TrkB受体相互作用的植物特化代谢物的策略。
引言
植物混合物富含药理活性化合物1，是发现新药物候选物和先导化合物的良好来源2,3,4,5. 从天然产物中发现新药物一直是一种卓有成效的方法，许多目前获批的药物都源于最初在自然界中发现的化合物。天然化合物的化学多样性难以被人工合成的分子库所匹敌。许多天然化合物能够与人类蛋白质靶点相互作用并调节其功能，可被视为在进化过程中优化而成的类药物分子6这些天然化合物特别适用于神经系统疾病药物先导化合物的筛选。6目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗阿尔茨海默病（AD）的两种药物来源于天然生物碱，分别为加兰他敏和利斯的明（毒扁豆碱的衍生物）。6左旋多巴（L-DOPA）是目前治疗帕金森病最常处方的药物，最初是从蚕豆中分离得到的Vicia faba L.)7. 溴隐亭和利舒脲是多巴胺受体激动剂，为寄生真菌天然麦角生物碱的衍生物 Claviceps purpurea8
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方案
1. SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞（TrkB 和 TrkB-NULL（亲代）细胞系）的细胞培养
注意：细胞系（SH-SY5Y 细胞系 (TrkB, BR6) 和 SH-SY5Y 亲本细胞系 (TrkB NULL))49,50 购自 Kerafast。培养的细胞用作固定化跨膜受体的来源，以制备 CMAC 柱。以下步骤描述了如何获得细胞膜片段并组装功能性的 CMAC 柱。
- 在150 mm细胞培养皿中，于37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养细胞，培养基为RPMI培养基450 mL、胎牛血清50 mL、青霉素/链霉素溶液5 mL和遗传霉素（G418）0.3 mg/mL混合配制而成。
2. 细胞收获
- 使用显微镜确认细胞汇合度（80%-90%），该状态通常在细胞传代后3-4天达到。
- 吸除细胞上方的培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS，1×，pH 7.4）洗涤细胞两次。去除PBS后，加入2 mL低浓度胰蛋白酶（0.25%）以解离细胞。
- 轻轻摇晃培养皿，使胰蛋白酶溶液均匀覆盖所有细胞，并在37 °C、含5% CO2
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结果
根据实验方案，组装了两根CMAC色谱柱：一根装填了过表达TrkB的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞膜片段，另一根装填了SH-SY5Y TrkB-NULL细胞膜片段。正确组装的CMAC色谱柱如图1所示，细胞膜片段固定化的具体步骤如图2所示。
由于此前尚未尝试将 TrkB 受体固定在 IAM.PC.DD2 色谱固定相上，因此通过抗体染色和使用标记配体 7,8-DHF 的前沿亲和色谱法验证了受体成功固定。抗体染色实验的示意图见图2。采用优化后的方案，将来源于过表达 TrkB 受体的神经母细胞瘤细胞系的细胞膜片段以及来源于不表达 TrkB 受体（TrkB-NULL）的亲本细胞系的细胞膜片段固定在 IAM.PC.DD2 颗粒上。随后，将固定有细胞膜片段的颗粒与 BDNF（生理配体）孵育，再与一抗及荧光标记的二抗孵育（图2）。结果显示，固定有神经母细胞瘤 Tr.......
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讨论
在复杂的特化代谢物混合物中鉴定活性化合物是一项极具挑战性的任务23。传统方法通常先分离单个化合物，再通过不同的检测方法测试其活性。该方法耗时长、成本高，且常常导致仅分离和鉴定出丰度最高且已被充分表征的化合物23。 目前常用的高通量筛选方法主要依赖于对组合化学文库进行筛选，并针对已知靶点设计，难以用于鉴定和分离复杂混合物中存在的生物活性化合物53。
CMAC 可用于鉴定靶向 TMPs 的化合物23,24,54。该技术将含有 TMPs 的细胞膜片段固定在 IAM 固定相颗粒表面23,24。CMAC 是一种独特的方法，可将含有靶蛋白的细.......
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披露
Lukasz Ciesla 与 IAM.PC.DD2 颗粒的供应商 Regis Technologies 合作。
致谢
Z.C.A. 受土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）2219 国际博士后研究奖学金项目资助。本研究的资助来自美国国立卫生研究院国家补充与综合医学中心，资助编号为 1R41AT011716-01。本工作还部分得到了美国药学科学学会研究启动基金以及 Regis Technologies 向 L.C. 提供的基金支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 7-8 二羟基黄酮水合物 | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
| 腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物 (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| 乙酸铵 | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| BDNF 抗体 | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | 一抗；浓度为 2 mg/mL |
| 盐酸苄脒水合物 | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| 人源脑源性神经营养因子 (BDNF) | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | 重组型，大肠杆菌表达，冻干粉末，适用于细胞培养 |
| 氯化钙 | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
| 胆酸钠盐 | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| 杜恩斯匀浆器 (Dounce homogenizer) | VWR | 71000-516 | 40 mL，总长 285 mm，32 x 140 mm (外径 x 高) |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | 经无菌过滤，适用于细胞培养 |
| G418 硫酸双盐溶液 | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL 溶于 H2O，0.1 μm 过滤，适用于细胞培养 |
| 甘油 | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| 固定化人工膜 (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| 六水合氯化镁 | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon C2 DUVb | Nikon | 共聚焦激光扫描显微镜 | |
| 正常山羊血清 (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| 苯甲基磺酰氟 (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| 氯化钾 | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | 蛋白质组学级，含 50 mM AEBSF、30 µM 抑肽酶、1 mM 亮抑蛋白酶肽、1 mM E-64 和 1 mM 亮抑蛋白酶肽 |
| RPMI-1640 培养基 | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | 含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养 |
| 二抗 山羊抗兔 IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| 表达 Trk-B 的 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞系 | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL 细胞系 | Kerafast | ECP005 | |
| 蛇皮透析管 | Thermo Scientific | 88245 | 10K 截留分子量，干燥内径 35 mm |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 氯化钠 | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
| Tricorn 5/20 层析柱 | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%，经无菌过滤，适用于细胞培养，含 2.5 g 猪胰蛋白酶和 0.2 g EDTA |
参考文献
- Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578(2018).
- Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M.
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重印与许可
