分离患者特异性原代主动脉平滑肌细胞及半定量实时收缩测量 体外

摘要

本文介绍了一种基于组织块培养的方法，用于分离和培养原代的、患者特异性的许多人主动脉平滑肌细胞和皮肤成纤维细胞。此外，还提出了一种测量细胞收缩及进行后续分析的新方法，可用于研究这些细胞在不同患者间的特异性差异。

摘要

平滑肌细胞（SMCs）是主动脉中膜中的主要细胞类型。其收缩装置对于主动脉内力的传导至关重要，并调控血管收缩与舒张。编码平滑肌细胞收缩装置蛋白的基因发生突变，与主动脉疾病（如胸主动脉瘤）相关。平滑肌细胞收缩的测量 体外 具有挑战性，尤其是在高通量条件下，而高通量对于患者样本的筛选至关重要。目前可用的方法均不适用于此目的。本文介绍了一种基于细胞-基底电容抗传感（electric cell-substrate impedance sensing, ECIS）的新型方法。首先，描述了一种组织块法，用于从主动脉活检组织中分离出患者特异性的原代人主动脉平滑肌细胞（SMCs），以及患者特异性的原代人皮肤成纤维细胞，以用于主动脉瘤的研究。接着，详细阐述了一种新的收缩力检测方法，用于测量这些细胞的收缩反应，并包括后续的数据分析流程及不同组别间比较的建议。该方法可用于转化医学（心血管）研究、患者研究以及药物筛选研究中贴壁细胞收缩功能的检测。

引言

平滑肌细胞（SMCs）是主动脉中膜层的主要细胞类型，而中膜层是主动脉最厚的一层。在管壁内，这些细胞呈放射状排列，参与包括血管收缩和血管舒张在内的多种功能¹。SMC的收缩装置通过与细胞外基质的功能性连接，参与主动脉内力的传递²。编码SMC收缩装置蛋白的基因发生突变，例如平滑肌肌球蛋白重链（MYH11）和平滑肌肌动蛋白（ACTA2），已被发现与家族性胸主动脉瘤病例相关，凸显了SMC收缩在维持主动脉结构和功能完整性中的重要性^1,2。此外，TGFβ信号通路中的基因突变也与主动脉瘤相关，其在主动脉瘤病理生理学中的作用亦可在皮肤成纤维细胞中进行研究³。

高通量测量平滑肌细胞收缩 体外 具有挑战性。由于无法测量SMC的收缩力 体内 在人类中， 体外 在人体细胞上进行的检测提供了一种可行的替代方案。此外，动物模型中腹主动脉瘤（AAA）的形成通常通过化学方法诱导，例如弹性蛋白酶灌注，或由特定突变引起。因此，动物实验数据与人类腹主动脉瘤的发展不具可比性，因为后者大多由多种因素共同导致，如吸烟、年龄和/或动脉粥样硬化。 体外 SMC收缩力迄今为止主要通过牵引力显微镜进行测量^4,5Fura-2荧光法测定细胞内钙离子流⁶和胶原皱缩实验⁷尽管牵引力显微镜技术为单个细胞产生的力学力提供了宝贵的数值信息，但由于其数学数据处理复杂且每次仅能分析一个细胞，因此不适用于高通量筛选，这意味着每例供体需检测具有代表性的细胞数量时极为耗时。Fura-2染料法和胶原皱缩实验仅能对收缩能力进行表面性评估，且无法提供精确的数值输出，因而较难用于区分患者间的个体差异。通过优化一种新型平滑肌细胞收缩力检测方法，首次证实了来源于腹主动脉瘤患者主动脉的平滑肌细胞存在收缩功能受损。 体外⁸通过改造电细胞基底阻抗传感（ECIS）方法实现。ECIS是一种实时、中通量的检测方法，用于定量分析贴壁细胞的行为和收缩性^9,10,11 例如 SMC 在伤口愈合和迁移实验中的生长与行为^12,13,14确切方法详见方案部分。通过这种优化方法，ECIS还可用于研究成纤维细胞的收缩，因其具有与目标细胞相似的大小和形态。

本文的目的是逐步描述测量平滑肌细胞收缩的方法 体外 使用 ECIS⁸ 并比较对照组与患者来源的平滑肌细胞（SMCs）的收缩功能。首先，阐述了从对照组和患者主动脉活检组织中分离和培养原代平滑肌细胞的方法，这些细胞可用于收缩功能的检测。其次，描述了收缩功能的测量与分析方法，以及平滑肌细胞标志物表达的验证。此外，本文还介绍了患者特异性皮肤成纤维细胞的分离方法，其收缩能力可采用相同的技术进行测定。这些细胞可用于针对主动脉瘤或其他心血管疾病的个体化研究。¹⁵ 或使用转分化方案在动脉瘤手术前进行收缩力测量的预后研究¹⁶.

方案

注意：主动脉活检样本是在荷兰阿姆斯特丹大学医学中心、阿姆斯特丹VU大学医学中心、赞丹赞斯医疗中心以及霍伦迪克兰德医院进行开放性动脉瘤修复手术期间获取的。对照组主动脉组织来自用于肾移植手术中与肾动脉相连的主动脉片段。仅纳入年龄超过18岁的患者，所有患者均签署知情同意书，自愿参与本研究。所有样本的采集均遵循《世界医学协会赫尔辛基宣言》的规定以及VU医学中心医学伦理委员会的机构指南。所有实验及实验方案均按照机构指南执行，并经VU医学中心医学伦理委员会批准。有关所用对照组和患者细胞系的完整信息，请参见⁸。

1. 从主动脉活检组织中分离原代人平滑肌细胞

注意：以下步骤均需在无菌组织培养超净工作台内进行。操作人血液和人组织样本时，应佩戴手套并采用标准的无菌技术。血管平滑肌细胞（SMCs）在231人血管平滑肌细胞基础培养基中培养，培养基中添加100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素以及平滑肌细胞生长添加剂，该完全培养基简称为SMC 培养基。

1. 将两把手术镊和一把手术刀浸入70%乙醇中进行灭菌，随后擦干。
2. 在将进行组织解剖的培养皿中加入2 mL SMC培养基。
3. 向两个T25培养瓶中各加入2.5 mL SMC培养基。轻轻旋转培养瓶，使少量培养基覆盖整个瓶内表面。
4. 将采集的人主动脉壁活检组织置于无菌塑料管中，加入冷的无菌组织转运液（见材料表）或0.9% NaCl，冰上运输，从手术室转移至实验室。
5. 在组织培养超净台内打开装有组织的管子。用已灭菌的镊子取出组织活检样本，并将其放入培养皿中（图1A）。
6. 肉眼检查活检组织，识别主动脉的三层结构：内膜（内层）、中膜（中层）和外膜（外层）。观察内膜侧是否存在动脉粥样硬化斑块，以及外膜侧是否有黏滑的结缔组织（图1B），以区分各层。
7. 为从中膜分离SMC，需去除其余两层。首先将组织内膜斑块面朝上放置（图1B）。用一把镊子夹住斑块并将其从组织上拉离，同时用另一把镊子向下压住组织，去除固态斑块。重复此操作，逐层去除斑块，直至露出粉红色、均匀的中膜层。
8. 翻转组织（图1C）。重复步骤1.7的操作，剥离外膜层（图1D）。务必尽可能多次尝试，彻底去除所有可见部分，因为该层不易与中膜完全分离。
   注：正确去除内膜和外膜层对于获得尽可能纯净的SMC细胞群体至关重要。
9. 中膜层分离完成后，将组织切成约1 mm × 1 mm × 1 mm的小立方体。用镊子压住中膜组织，使用手术刀沿单一方向切割。避免来回切割，应进行干净、单向的切口以最小化组织损伤。根据活检组织的大小，尽可能多地制备组织块（图1E）。
10. 用镊子将组织块放置于T25培养瓶的上四分之一区域。若组织量充足，每瓶放置10–20个组织块（图1F）。
    注：建议使用表面光滑的镊子，以减少组织黏附于镊齿，并便于将组织块顺利转移至培养瓶中。
11. 将组织块在T25培养瓶中于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育约10天。
    注：预计在此时间段左右可见细胞开始迁移生长。最初迁移出的细胞可能比正常SMC更小。
12. 一旦观察到细胞生长，向培养瓶中加入2.5 mL培养基，注意不要直接将液体滴加在组织块上，以防其脱落。
13. 约5天后，当在组织块周围观察到细胞簇时，更换培养基。若组织块脱落，应将其移除，因其无法重新贴壁。
14. 当细胞融合度达到80–90%时，将其传代至T75培养瓶，并继续在此条件下培养。
    注：建议按1:2或1:3的比例进行传代。早期代次应冻存备份细胞。细胞通常在第10代前保持其特性；后续代次不应用于实验。

2. 从皮肤活检组织中分离原代真皮成纤维细胞

注意：以下步骤均需在无菌的组织培养超净工作台内进行。操作人需佩戴手套，并在处理人血和人体组织样本时采用标准的无菌技术。成纤维细胞培养于基础培养基中，该培养基添加有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，此培养基简称为成纤维细胞培养基。

1. 将两把手术镊子和一把手术刀浸入70%乙醇中进行灭菌，随后擦干。
2. 在将用于组织解剖的培养皿中加入2 mL成纤维细胞培养基。
3. 向两个T25培养瓶中各加入2.5 mL成纤维细胞培养基。轻轻旋转培养瓶，使少量培养基覆盖整个瓶底表面。
4. 将采集的皮肤活检组织置于冰上，用冷的无菌组织转运液（见材料表）或0.9% NaCl溶液装入无菌塑料管中，从手术室转运至实验室。
5. 在组织培养超净台内打开装有组织的管子。用已灭菌的镊子取出活检组织，并将其放入培养皿中（图2A）。
6. 肉眼检查活检组织，识别皮肤的三层结构：表皮、真皮和皮下脂肪。寻找可辨认的皮肤表面，有时可见毛发，以确定表皮位置；在另一侧，寻找通常呈黄色且黏滑的皮下脂肪。位于表皮与皮下脂肪之间的层即为真皮——这是可存活成纤维细胞的来源（图2B）。
7. 为从真皮中分离成纤维细胞，需去除另外两层，并将组织侧放，以便清晰观察三层结构。
   注意：与主动脉组织不同，皮肤各层无法通过牵拉分离，因此必须使用切割方式。组织质地较橡胶状，切割难度较大，请使用锋利的手术刀。
8. 用镊子固定组织，沿表皮与真皮之间的边界平行切割，完整切除表皮。尽量以单一直线完成切割，避免来回移动，以防损伤组织。
9. 翻转组织，重复步骤2.8的操作；此次在真皮层内沿其与皮下脂肪的边界平行切割。
10. 真皮组织分离后，将其切成约1 × 1 × 1 mm³的小块。用镊子压住组织，使用手术刀沿单一方向切割。禁止来回切割，应进行干净、单向的切割以最大限度减少损伤。根据活检组织的大小，尽可能多地制备组织块（图2C）。
11. 用镊子将组织块放置于T25培养瓶的上四分之一区域。若材料充足，每瓶放置10–20个组织块（图2D）。
    注意：建议使用表面光滑的镊子，以减少组织黏附于镊齿，并便于将组织顺利转移至培养瓶中。
12. 将组织块置于T25培养瓶中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育约10天。
    注意：此时应可见初始的细胞迁移生长。最初迁移出的细胞可能比正常成纤维细胞更小。
13. 一旦观察到细胞生长，向培养瓶中加入2.5 mL培养基，注意不要直接将液体滴加在组织块上，以防其脱落。
14. 约5天后，当可见组织块周围出现细胞集落时，更换培养基。若组织块脱落，应将其移除，因其无法重新贴壁。
15. 当细胞融合度达到80–90%时，将其传代至T75培养瓶中，并继续在此条件下培养。
    注意：建议按1:2或1:3的比例进行传代。早期代次应冻存备份细胞。细胞通常在第10代前保持其特性；后续代次不应用于实验。

3. 测量收缩（示例 SMCs）

1. 准备一个96w10e ECIS阵列（代表性阵列图像见图3A，图中电极及接种在电极上的细胞已放大显示）。
   注意：以下所有步骤均需在无菌组织培养超净工作台内进行。
   1. 每孔加入200 µL 10 mM L-半胱氨酸溶液，对无菌96w10e阵列进行包被，室温孵育30分钟。
   2. 用无菌水洗涤板子两次。将板盖略微打开，在组织培养超净台中过夜晾干。
      注意：仅在首次使用该板时需要使用L-半胱氨酸进行包被。
   3. 次日，将板和板盖置于紫外线下灭菌30分钟。将板盖翻转朝上，确保其内表面被灭菌。板子灭菌后，不得在超净台外打开。
2. 在ECIS阵列上接种细胞
   1. 将1%无菌明胶溶液在水浴中预热30分钟。
      注意：该溶液通常储存于冰箱中，可能凝固，导致移液困难。
   2. 随后，每孔加入100 µL 1%明胶溶液进行包被，并将板子置于37 °C孵育至少1小时。
   3. 吸除各孔中的明胶溶液。
   4. 使用自动细胞计数仪计数细胞，并以每孔30,000个细胞的密度，将平滑肌细胞（SMCs）以200 µL SMC培养基每孔的形式接种，设三个重复。
   5. 将接种了SMCs的板子放入细胞培养孵箱中的ECIS 96孔板支架内。双击ECIS Applied Biophysics软件打开程序，然后点击Setup按钮。
   6. 在左下角标有Well Configuration的面板中，检查所有电极是否与支架接触良好（绿色表示正常连接，红色表示无连接）。若电极连接不良，应在开始测量前调整板子在支架中的位置。
   7. 在同一面板中，点击Array type，选择板子类型（96孔阵列）。
   8. 在右上角的Data Collection Setup面板中，点击single frequency，将阻抗值设为4000 Hz，间隔设为8 s。
   9. 点击Start按钮开始测量。等待新面板弹出，以便保存ECIS数据文件。
   10. 让细胞贴壁并形成单层，持续48小时。
       注意：细胞在电极上的贴附和铺展会产生一个基础电阻值（见图3B）。
3. 刺激细胞以诱导收缩
   1. 通过使用10 µg/mL钙离子载体离子霉素（ionomycin）刺激细胞，诱导SMC收缩。
      注意：离子霉素将促进细胞外Ca²⁺内流，激活收缩级联反应；非刺激和刺激后收缩细胞的代表性图像见图4A。
   2. 将1 mg离子霉素粉末溶于100 µL二甲基亚砜（DMSO）中，配制成10 mg/mL的储存液，分装为10 µL每管，于-20 °C保存。使用前，将离子霉素溶液用SMC培养基按1:10稀释，制备成工作液用于加样。
   3. 在阵列仍置于细胞培养孵箱内支架中且电极与系统连接的状态下进行细胞刺激。
      1. 刺激时，取下板盖并将其放置在孵箱内无菌表面上。准备两支移液器，分别设定为2 µL和150 µL。
      2. 开始刺激前，在软件中点击Mark并添加注释。
         注意：这将有助于在数据分析时准确定位刺激发生的时间点。
      3. 尽可能快速地向每孔加入2 µL离子霉素工作液。所有细胞刺激完成后，使用第二支移液器轻轻混匀各孔中的培养基。
         注意：由于效应迅速，不同细胞系和条件之间无需更换枪头。刺激和混匀过程应迅速操作，因为离子霉素具有急性作用。若刺激整块板，每次最多刺激3列。每次刺激后，需等待至少30分钟再进行下一次刺激，以使细胞从因打开孵箱门导致的温度和CO₂变化中恢复。
      4. 刺激完成后，立即再次点击Mark，添加“刺激完成”的注释。
   4. 结束刺激实验
      1. 在离子霉素刺激后继续记录约5分钟的阻抗值。点击Finish结束记录。
      2. ECIS阵列最多可重复使用三次：用无菌水洗涤孔两次，并在37 °C下用胰蛋白酶或类似试剂孵育2–3小时。重复步骤3.1.2和3.1.3。
4. 导出数据
   1. 导出数据时，点击File | Export data | To Excel (Selected)，选择保存文件的文件夹。
   2. 当程序询问是否合并或分离工作表时，点击Separate。
5. 分析收缩输出结果
   1. 为计算收缩反应，使用以下公式（1），其中C表示收缩（以相对于基线的变化百分比表示），prestimulation（PrS）表示离子霉素刺激前的电阻值（单位为Ω），post-stimulation（PoS）表示刺激结束后2分钟时的电阻值（单位为Ω）。
      （1）
      注意：如公式（1）所示，在最终计算中，需从所有结果中减去未接种细胞、仅含培养基的孔的阻抗值（290 Ω）。建议每次实验中每组均设三个重复以测量收缩反应，并对同一细胞系进行三次独立实验，以消除实验间和实验内的变异。
   2. 完成三次独立实验后，按步骤3.5.2所述方法，计算三次测量值的平均值并包含标准差（SD）。
6. 比较不同组别
   1. 为定义正常收缩的范围并进一步探讨特定研究问题，可使用对照组定义“正常收缩”，并与患者组或处理组的收缩反应进行比较。
   2. 计算整个对照组的均值和标准差（SD），即所有细胞系终末值的均值和SD，方法如步骤3.5.2所述。
   3. 使用均值±2SD的范围来识别其他组中落在该范围之外的细胞，表明其收缩反应异常。
      注意：异常收缩反应背后的机制取决于具体研究问题，且与细胞类型和实验条件相关，本实验方案中不作讨论。

4. 检测 SMC 特异性标志物的存在

1. RNA 提取
   1. 将用于收缩力测定的相同患者特异性细胞系接种于6孔板中，每种细胞系接种一孔。使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，并以每孔200,000个细胞的密度将细胞接种于平滑肌细胞（SMC）培养基中，过夜培养使细胞贴壁。
   2. 用无菌PBS洗涤细胞一次。
   3. 根据制造商说明书裂解细胞并提取RNA。
2. cDNA 合成
   1. 在20 µL逆转录反应体系中进行cDNA合成。根据制造商提供的说明，调整所提取总RNA的浓度。
3. qPCR
   1. 检测平滑肌细胞标志物基因（如 ACTA2, CNN1, SMTN 和 TAGLN）的基因表达，以确认所提取的细胞确为平滑肌细胞（SMCs）并检测其标志物表达情况。检查基因表达结果与收缩功能输出之间是否存在相关性。
   2. 使用至少两个看家基因对数据进行标准化处理，例如 YWHAZ 和 TBP。
      注意：qPCR扩增及数据分析可使用不同的PCR仪及配套软件完成，具体选择取决于实验室现有设备及其优化条件。引物序列见补充表S1。

结果

为了检验该方法的可重复性，首先仅使用对照平滑肌细胞（SMCs）对该方法进行了验证。为了确定不同实验间测量结果的可重复性，将所有纳入的对照组和患者细胞系的两次独立测量结果以Bland-Altman图表示（图3B）。该图显示，除一个离群细胞系外，该方法的变异均未超出置信区间。此外，这些结果表明，在同一实验中接种并同时受到刺激的两个孔中的细胞表现出几乎相同的收缩反应曲线（图4C）。为了验证所观察到的反应是细胞收缩而非由离子霉素刺激引起的渗透压应激，我们在刺激后更换了培养基，并记录了细胞的行为变化。结果显示，受到刺激的细胞开始重新在电极上伸展（图4D）。

作为该新方法的首次应用，测量了来自健康非扩张主动脉（n=6）和腹主动脉瘤（AAA）患者（n=21；图5A）的平滑肌细胞（SMC）的收缩反应，如先前所述⁸。...

讨论

本文介绍了一种测量平滑肌细胞收缩的方法 体外，基于阻抗和表面占有率的变化。首先描述患者特异性原代人平滑肌细胞和皮肤成纤维细胞的分离、培养与扩增，随后介绍如何利用这些细胞进行收缩力测量。

本研究的一个局限性在于通过组织块法获取细胞。从活检组织中增殖出的细胞可能具有与原始组织不同的特性 体内此外，本文所述的组织块培养方案并非创新性方法，但为了展示从患者特异性主动脉瘤组织到收缩功能测量的完整工作流程，仍将其纳入。细胞的培养 体外 也可能由于缺乏系统性因子和不同的基质刚度而影响其某些特性。这可能解释了平滑肌细胞标志物表达的变异性。由于缺乏可靠的成纤维细胞标志物，通常通过与其他细胞相比缺乏特定标志物的方式来区分成纤维细胞。因此，我们未对本方案分离的成纤维细胞进行表征。另一个局限性在于，将收缩力作为表面积变化的测量指标仍具有一定间接性。可能的结果是，检测信号来源于包含数千个细胞的整个孔板反应的平均值，因此无法确定是所有细胞的收缩均减弱，还是存在部分细胞拉低了整体平均值。

SMC 收缩...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔阵列	Applied Biophysics	96W10idf PET	用于ECIS系统中测量收缩的阵列
Custodiol	Dr. Franz Höhler Chemie GmbH	RVG 12801	用于将组织从手术室转移至实验室的溶液
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	472301	用于稀释离子霉素的溶液
胎牛血清	Gibco	26140079	细胞培养基添加物
Ham's F-10营养混合物	Gibco	11550043	用于培养皮肤成纤维细胞的培养基
人血管平滑肌细胞基础培养基（原“Medium 231”）	Gibco	M231500	用于培养平滑肌细胞的培养基
Invitrogen Countess II	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	自动细胞计数仪
链球菌钙霉素离子霉素	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	用于刺激收缩的化合物
0.9%氯化钠溶液	Fresenius Kabi	B230561	用于将组织从手术室转移至实验室的溶液
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	用于细胞培养基的抗生素
磷酸盐缓冲液	Gibco	10010023	用于洗涤细胞
Quick-RNA Miniprep 试剂盒	Zymo Research	R1055	用于RNA提取的试剂盒
平滑肌细胞生长添加剂（SMGS）	Gibco	S00725	添加至平滑肌细胞培养基中的补充剂
SuperScript VILO cDNA合成试剂盒	Thermo Fisher Scientific	11754250	用于cDNA合成的试剂盒
SYBR Green PCR 主混合液	Thermo Fisher Scientific	4309155	qPCR用试剂
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15400-054	用于细胞消化
ZTheta	Applied Biophysics	ZTheta	用于收缩测量的ECIS仪器