本方案利用表达荧光素酶和荧光蛋白的重组(r)SARS-CoV-2 及其 体内 在K18-hACE2转基因小鼠中使用成像系统(IVIS)以克服研究SARS-CoV-2感染所需的次级方法 体内.
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本方案利用表达荧光素酶和荧光蛋白的重组(r)SARS-CoV-2 及其 体内 在K18-hACE2转基因小鼠中使用成像系统(IVIS)以克服研究SARS-CoV-2感染所需的次级方法 体内.
新型冠状病毒病2019(COVID-19)大流行由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起。截至目前,SARS-CoV-2已在全球造成超过2.42亿例感染和逾490万例死亡。与其他病毒类似,研究SARS-CoV-2需要采用实验方法来检测病毒感染细胞和/或动物模型中的病毒存在。为克服这一限制,我们构建了可复制的表达生物发光(纳米荧光素酶,Nluc)或荧光(Venus)蛋白的重组SARS-CoV-2(rSARS-CoV-2)。这些表达报告蛋白的rSARS-CoV-2可用于追踪病毒感染过程 体外 和 体内 基于Nluc和Venus报告基因的表达。本研究描述了使用rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus在先前报道的K18人血管紧张素转换酶2(hACE2)转基因小鼠感染模型中检测和追踪SARS-CoV-2感染的方法 体内 成像系统(IVIS)。该rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus表现出与rSARS-CoV-2/WT相似的致病性及病毒复制能力 体内重要的是,Nluc 和 Venus 的表达使我们能够直接追踪病毒感染过程 体内和离体,在感染小鼠中。这些rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus是研究SARS-CoV-2生物学的优良工具 体内,以了解病毒感染及相关的新冠肺炎疾病,并确定有效的预防性和/或治疗性措施来应对SARS-CoV-2感染。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是一种有包膜的、正义单链RNA病毒,属于冠状病毒科(Coronaviridae)的乙型冠状病毒属1。该病毒家族分为甲型、乙型、丙型和丁型冠状病毒1。甲型和乙型冠状病毒主要感染哺乳动物,而丙型和丁型冠状病毒几乎 exclusively 感染鸟类2。迄今为止,已有七种冠状病毒(CoV)跨越物种屏障,成为人类冠状病毒(HCoV):两种甲型冠状病毒(HCoV-229E 和 HCoV-NL63)以及五种乙型冠状病毒(HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒[MERS-CoV]和SARS-CoV-2)3,4,5,6。SARS-CoV、MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 具有高度致病性,可引起严重的下呼吸道感染7。在SARS-CoV-2出现之前,曾发生过两次由冠状病毒引起的疫情:2002年至2003年间在中国广东省暴发的SARS-CoV疫情,病死率(CFR)约为9.7%;以及自2012年起在中东地区持续至今的MERS-CoV疫情,病死率约为34%7,8。SARS-CoV-2的总体病死率介于3.4%至49%之间,基础疾病会增加病死率8,9。自2019年12月在中国武汉被发现以来,SARS-CoV-2已在全球范围内导致超过2.42亿例人类感染和超过490万例死亡7,10,11,12。值得注意的是,自2020年底以来,新出现的SARS-CoV-2关注变异株(VoC)和兴趣变异株(VoI)已影响病毒特性,包括传播性和抗原性9,13,并改变了COVID-19大流行的总体走向。针对SARS-CoV-2感染的治疗,目前仅有一种美国食品药品监督管理局(FDA)批准的治疗性抗病毒药物(瑞德西韦),以及一种获得紧急使用授权(EUA)的药物(巴瑞替尼,需与瑞德西韦联合使用)14。此外,还有6种获得EUA授权的单克隆抗体:REGEN-COV(卡西瑞单抗和伊德维单抗,联合使用)、索托维单抗、托珠单抗,以及巴尼维单抗与艾德维单抗联合使用15,16,17,18,19。目前仅有一种FDA批准的预防性疫苗(辉瑞-生物新技术疫苗),另有两种预防性疫苗(Moderna 和 Janssen)获得EUA授权20,21,22,23,24。然而,由于感染率失控以及关注变异株和兴趣变异株的不断出现,SARS-CoV-2仍对人类健康构成威胁。因此,迫切需要开发新的方法,以识别高效预防和治疗手段,控制SARS-CoV-2感染及仍在持续的COVID-19大流行。
研究SARS-CoV-2需要繁琐的技术和间接方法,以鉴定感染细胞和/或已验证的感染动物模型中病毒的存在。反向遗传学的应用使得能够构建重组病毒,从而回答病毒学研究中的重要问题。例如,反向遗传学技术为揭示和理解病毒感染机制、致病机制及疾病过程提供了手段。同样,反向遗传学方法也为构建缺失特定病毒蛋白的重组病毒铺平了道路,以研究这些蛋白在病毒致病过程中的作用。此外,反向遗传学技术已被用于生成表达报告基因的重组病毒,用于体外(in vitro)和体内(in vivo)研究,包括筛选预防性和/或治疗性策略以应对病毒感染。由于灵敏度高、稳定性好且检测便捷,得益于新技术的进步,荧光蛋白和生物发光蛋白是最常用的报告基因25,26。在体外(in vitro)研究中,荧光蛋白更适用于病毒在感染细胞中的定位,而荧光素酶则更便于定量分析27,28,29。在体内(in vivo)成像中,全动物成像通常优先选择荧光素酶而非荧光蛋白,而荧光蛋白则更适用于感染细胞的鉴定或离体(ex vivo)成像30,31,32。表达报告基因的重组病毒已被广泛用作研究多种病毒科的重要工具,包括黄病毒科(flaviviruses)、肠道病毒属(enteroviruses)、甲病毒属(alphaviruses)、慢病毒属(lentiviruses)、沙粒病毒科(arenaviruses)以及流感病毒(influenza viruses)等28,33,34,35,36。
克服对二次方法研究SARS-CoV-2以及实时表征SARS-CoV-2感染的需求 体内我们利用先前描述的基于细菌人工染色体(BAC)的反向遗传学系统,构建了可复制的、表达生物发光(nanoluciferase, Nluc)或荧光(Venus)蛋白的重组型(r)SARS-CoV-2,该系统以单拷贝形式维持 E. coli 为了在细菌中扩增病毒序列时将其毒性降至最低37,38值得注意的是,rSARS-CoV-2/Nluc 和 rSARS-CoV-2/Venus 表现出与 rSARS-CoV-2/WT 相似的致病性 体内. rSARS-CoV-2/Venus 中 Venus 的高水平表达使得能够利用一种方法在感染的 K18 hACE2 转基因小鼠肺部检测到病毒感染 体内 成像系统(IVIS)39Venus表达水平与在肺部检测到的病毒滴度高度相关,表明利用Venus表达作为SARS-CoV-2感染的有效替代指标是可行的。通过使用rSARS-CoV-2/Nluc,我们能够实时追踪病毒感染的动态过程,并对SARS-CoV-2感染进行纵向评估。 体内 使用相同的IVIS方法在K18 hACE2转基因小鼠中进行。
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涉及K18 hACE2转基因小鼠的实验方案已获得德克萨斯生物医学研究所(TBRI)机构生物安全委员会(IBC)和机构动物护理与使用委员会(IACUC)的批准。所有实验均遵循美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》中的建议40。在操作小鼠时,必须穿戴适当的个人防护装备(PPE)。
1. 使用 K18 hACE2 转基因小鼠
2. 生物安全
注意:本研究中,rSARS-CoV-2 是使用基于 BAC 的反向遗传系统生成的,针对 SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 毒株,方法如先前所述37。所有涉及 rSARS-CoV-2/Nluc 或 rSARS-CoV-2/Venus 感染的体内操作必须在生物安全三级(BSL-3)条件下于生物安全柜中进行。
3. 在体 rSARS-CoV-2的表征
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K18 hACE2 转基因小鼠中 rSARS-CoV-2/Nluc 感染图1 2)
图1A 显示了用于评估感染的 rSARS-CoV-2/WT(上图)和 rSARS-CoV-2/Nluc(下图)的示意图 体内. 图1B 展示了用于评估K18 hACE2转基因小鼠中rSARS-CoV-2/Nluc感染动态的示意图流程。4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠(N = 4)分别以1×PBS进行模拟感染或以105 经鼻接种 rSARS-CoV-2/WT 或 rSARS-CoV-2/Nluc 的 PFU。感染后第 1、2、4 和 6 天,使用隔离舱对小鼠进行麻醉,随后经眶后注射 Nluc 底物。立即将隔离舱放入 IVIS 系统中检测 Nluc 信号 体内 使用成像软件进行检测。在感染rSARS-CoV-2/Nluc的小鼠中可明显检测...
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本方案展示了利用表达报告基因的重组SARS-CoV-2(rSARS-CoV-2)监测病毒感染的可行性 体内两种表达报告基因的重组病毒均为研究SARS-CoV-2感染提供了优良工具 体内. 所述的 离体 (rSARS-CoV-2/Venus) 和 体内 (rSARS-CoV-2/Nluc) 成像系统是研究 SARS-CoV-2 感染动态、病毒致病机制以及在病毒感染后不同时间点鉴定受感染细胞/器官的优良选择。为开展 离体 (rSARS-CoV-2/Venus) 和 体内 (rSARS-CoV-2/Nluc) 研究中,准确且可重复的感染以及对 rSARS-CoV-2/Nluc 进行充分的接种至关重要。
当研究时 体内 使用rSARS-CoV-2/Nluc进行感染实验时,应剃除小鼠毛发以利于在IVIS下观察Nluc信号。同时需要接种Nluc底物以实现Nluc的可视化。这可能需要一些预实验来确定Nluc底物的浓度和用量,以确保获得较强的Nluc信号。在研究过程中
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作者声明,本研究所涉及的工作不存在任何商业、财务、非财务或个人利益冲突。
我们感谢本研究所(德克萨斯生物医学研究所)的成员在 COVID-19 大流行期间为保障设施正常、安全运行所付出的努力。我们还要感谢本机构生物安全委员会(IBC)和机构动物照护与使用委员会(IACUC)以高效的方式审阅我们的实验方案。感谢西奈山伊坎医学院的 Thomas Moran 博士提供了SARS-CoV交叉反应性单克隆抗体1C7C7核衣壳(N)蛋白。Martinez-Sobrido 实验室目前的 SARS-CoV-2 研究得到了美国国家过敏与传染病研究所(NIAID/NIH)基金项目 RO1AI161363-01、RO1AI161175-01A1 和 R43AI165089-01 的资助;美国国防部(DoD)基金项目 W81XWH2110095 和 W81XWH2110103;圣安东尼奥精准治疗合作伙伴计划;德克萨斯生物医学研究所论坛;德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心;圣安东尼奥医学基金会;以及由 NIAID 资助的流感致病机制与传播研究中心(CRIPT),即流感研究与应对卓越研究中心(CEIRR,合同号 #75N93021C00014)的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | 室温(RT)保存 |
| 1% DEAE-葡聚糖 | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% 甲醛溶液,中性缓冲 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 琼脂 | Oxoid | LP0028 | |
| 24孔细胞培养板 | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6孔细胞培养板 | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96孔细胞培养板 | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| 非洲绿猴肾上皮细胞(Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura成像软件 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | 图像分析软件 | |
| 牛血清白蛋白(BSA),35% | Sigma-Aldrich | A9647 | 4°C 下保存 °C |
| 细胞培养级水 | 康宁 | 25-055-CV | |
| 杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基 | Corning Cellgro | 15-013-CV | 4°C 下保存 °C |
| 麻醉气体机 | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| 胎牛血清(FBS) | Seradigm | 1500-050 | -20℃保存 °C |
| 4至6周龄雌性K18-hACE2转基因小鼠 | 杰克逊实验室 | 34860 | |
| Graphpad Prism 版本 9.1.0 | GraphPad | ||
| 异氟烷 | 巴克斯特 | 1001936040 | 室温保存 |
| MARS 数据分析软件 | BMG LABTECH | ||
| MB10 片剂 | QUIP 实验室 | MBTAB1.5 | 室温保存 |
| Nano-Glo 荧光素酶检测试剂 | Promega | N1110 | 该试剂用于检测Nluc活性。储存于-20℃ °C |
| Nunc MicroWell 96孔微孔板 | 赛默飞世尔科技 | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96孔微孔板 | 赛默飞世尔科技 | 269620 | |
| 青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(PSG)100倍浓缩液 | 康宁 | 30-009-CI | -20℃保存 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution 匀浆器 | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| 软组织匀浆 CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | 赛默飞世尔科技 | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP 试剂盒,辣根过氧化物酶 | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒 |
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