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方法文章

利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠进行病毒感染的活体成像与定量分析

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DOI：

10.3791/63127

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2021年11月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Texas Biomedical Research Institute

本文内容

摘要

本方案利用表达荧光素酶和荧光蛋白的重组（r）SARS-CoV-2 及其 体内 在K18-hACE2转基因小鼠中使用成像系统（IVIS）以克服研究SARS-CoV-2感染所需的次级方法 体内.

摘要

新型冠状病毒病2019（COVID-19）大流行由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起。截至目前，SARS-CoV-2已在全球造成超过2.42亿例感染和逾490万例死亡。与其他病毒类似，研究SARS-CoV-2需要采用实验方法来检测病毒感染细胞和/或动物模型中的病毒存在。为克服这一限制，我们构建了可复制的表达生物发光（纳米荧光素酶，Nluc）或荧光（Venus）蛋白的重组SARS-CoV-2（rSARS-CoV-2）。这些表达报告蛋白的rSARS-CoV-2可用于追踪病毒感染过程 体外 和 体内 基于Nluc和Venus报告基因的表达。本研究描述了使用rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus在先前报道的K18人血管紧张素转换酶2（hACE2）转基因小鼠感染模型中检测和追踪SARS-CoV-2感染的方法 体内 成像系统（IVIS）。该rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus表现出与rSARS-CoV-2/WT相似的致病性及病毒复制能力 体内重要的是，Nluc 和 Venus 的表达使我们能够直接追踪病毒感染过程 体内和离体，在感染小鼠中。这些rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus是研究SARS-CoV-2生物学的优良工具 体内，以了解病毒感染及相关的新冠肺炎疾病，并确定有效的预防性和/或治疗性措施来应对SARS-CoV-2感染。

引言

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是一种有包膜的、正义单链RNA病毒，属于冠状病毒科（Coronaviridae）的乙型冠状病毒属1。该病毒家族分为甲型、乙型、丙型和丁型冠状病毒1。甲型和乙型冠状病毒主要感染哺乳动物，而丙型和丁型冠状病毒几乎 exclusively 感染鸟类2。迄今为止，已有七种冠状病毒（CoV）跨越物种屏障，成为人类冠状病毒（HCoV）：两种甲型冠状病毒（HCoV-229E 和 HCoV-NL63）以及五种乙型冠状病毒（HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒[MERS-CoV]和SARS-CoV-2）3,4,5,6。SARS-CoV、MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 具有高度致病性，可引起严重的下呼吸道感染7。在SARS-CoV-2出现之前，曾发生过两次由冠状病毒引起的疫情：2002年至2003年间在中国广东省暴发的SARS-CoV疫情，病死率（CFR）约为9.7%；以及自2012年起在中东地区持续至今的MERS-CoV疫情，病死率约为34%7,8。SARS-CoV-2的总体病死率介于3.4%至49%之间，基础疾病会增加病死率8,9。自2019年12月在中国武汉被发现以来，SARS-CoV-2已在全球范围内导致超过2.42亿例人类感染和超过490万例死亡7,10,11,12。值得注意的是，自2020年底以来，新出现的SARS-CoV-2关注变异株（VoC）和兴趣变异株（VoI）已影响病毒特性，包括传播性和抗原性9,13，并改变了COVID-19大流行的总体走向。针对SARS-CoV-2感染的治疗，目前仅有一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗性抗病毒药物（瑞德西韦），以及一种获得紧急使用授权（EUA）的药物（巴瑞替尼，需与瑞德西韦联合使用）14。此外，还有6种获得EUA授权的单克隆抗体：REGEN-COV（卡西瑞单抗和伊德维单抗，联合使用）、索托维单抗、托珠单抗，以及巴尼维单抗与艾德维单抗联合使用15,16,17,18,19。目前仅有一种FDA批准的预防性疫苗（辉瑞-生物新技术疫苗），另有两种预防性疫苗（Moderna 和 Janssen）获得EUA授权20,21,22,23,24。然而，由于感染率失控以及关注变异株和兴趣变异株的不断出现，SARS-CoV-2仍对人类健康构成威胁。因此，迫切需要开发新的方法，以识别高效预防和治疗手段，控制SARS-CoV-2感染及仍在持续的COVID-19大流行。

研究SARS-CoV-2需要繁琐的技术和间接方法，以鉴定感染细胞和/或已验证的感染动物模型中病毒的存在。反向遗传学的应用使得能够构建重组病毒，从而回答病毒学研究中的重要问题。例如，反向遗传学技术为揭示和理解病毒感染机制、致病机制及疾病过程提供了手段。同样，反向遗传学方法也为构建缺失特定病毒蛋白的重组病毒铺平了道路，以研究这些蛋白在病毒致病过程中的作用。此外，反向遗传学技术已被用于生成表达报告基因的重组病毒，用于体外（in vitro）和体内（in vivo）研究，包括筛选预防性和/或治疗性策略以应对病毒感染。由于灵敏度高、稳定性好且检测便捷，得益于新技术的进步，荧光蛋白和生物发光蛋白是最常用的报告基因25,26。在体外（in vitro）研究中，荧光蛋白更适用于病毒在感染细胞中的定位，而荧光素酶则更便于定量分析27,28,29。在体内（in vivo）成像中，全动物成像通常优先选择荧光素酶而非荧光蛋白，而荧光蛋白则更适用于感染细胞的鉴定或离体（ex vivo）成像30,31,32。表达报告基因的重组病毒已被广泛用作研究多种病毒科的重要工具，包括黄病毒科（flaviviruses）、肠道病毒属（enteroviruses）、甲病毒属（alphaviruses）、慢病毒属（lentiviruses）、沙粒病毒科（arenaviruses）以及流感病毒（influenza viruses）等28,33,34,35,36。

克服对二次方法研究SARS-CoV-2以及实时表征SARS-CoV-2感染的需求 体内我们利用先前描述的基于细菌人工染色体（BAC）的反向遗传学系统，构建了可复制的、表达生物发光（nanoluciferase, Nluc）或荧光（Venus）蛋白的重组型（r）SARS-CoV-2，该系统以单拷贝形式维持 E. coli 为了在细菌中扩增病毒序列时将其毒性降至最低37,38值得注意的是，rSARS-CoV-2/Nluc 和 rSARS-CoV-2/Venus 表现出与 rSARS-CoV-2/WT 相似的致病性 体内. rSARS-CoV-2/Venus 中 Venus 的高水平表达使得能够利用一种方法在感染的 K18 hACE2 转基因小鼠肺部检测到病毒感染 体内 成像系统（IVIS）39Venus表达水平与在肺部检测到的病毒滴度高度相关，表明利用Venus表达作为SARS-CoV-2感染的有效替代指标是可行的。通过使用rSARS-CoV-2/Nluc，我们能够实时追踪病毒感染的动态过程，并对SARS-CoV-2感染进行纵向评估。 体内 使用相同的IVIS方法在K18 hACE2转基因小鼠中进行。

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方案

涉及K18 hACE2转基因小鼠的实验方案已获得德克萨斯生物医学研究所（TBRI）机构生物安全委员会（IBC）和机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。所有实验均遵循美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》中的建议40。在操作小鼠时，必须穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

1. 使用 K18 hACE2 转基因小鼠

  1. 在生物安全二级（BSL-2）动物饲养设施中，以无特定病原体条件饲养和维持4至6周龄雌性B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J小鼠（K18 hACE2转基因小鼠）。
    1. 到达BSL2设施后，让动物适应环境7天，随后将其转移至BSL-3动物设施进行感染及其他实验操作。
    2. 根据IACUC规程，每笼放置4只小鼠。为确保动物已死亡，在小鼠感染rSARS-CoV-2后 体内 成像后，使用致死剂量的Fatal-Plus实施安乐死>100 mg/kg

2. 生物安全

注意：本研究中，rSARS-CoV-2 是使用基于 BAC 的反向遗传系统生成的，针对 SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 毒株，方法如先前所述37。所有涉及 rSARS-CoV-2/Nluc 或 rSARS-CoV-2/Venus 感染的体内操作必须在生物安全三级（BSL-3）条件下于生物安全柜中进行。

  1. 在执行本文所述所有实验操作之前和之后，依次使用2% Wexicide和70%乙醇消毒剂清洁生物安全柜。
  2. 每次使用前后均需对所有解剖器械（如剪刀、解剖镊等）及匀浆器进行灭菌处理。
  3. 每次使用前后，根据制造商说明，清洁分离室并使用MB10片剂进行消毒。
  4. 按照IBC和IACUC指南，妥善处理实验过程中产生的所有生物材料。

3. 在体 rSARS-CoV-2的表征

  1. 小鼠感染
    1. 将4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠放入标记好的笼子中，每笼4只，并使用耳缘打孔编码对每只小鼠进行标识。分别设立一组小鼠用于体重和存活率观察，另一组用于病毒滴定和成像分析。
    2. 感染前，从胸部腹侧乳头至腹股沟乳头区域剃除小鼠胸部毛发，以利于生物发光信号的检测。
    3. 制备含有10的rSARS-CoV-2接种物5 在无菌条件下，使用无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS），以50 µL的总体积将噬斑形成单位（PFU）/小鼠进行处理。
      注意：使用以下公式计算病毒稀释时所需的 rSARS-CoV-2 用量：所需病毒量 = (105 （每只小鼠的PFU / 50 µL）× 最终体积）/ 病毒原液滴度
    4. 将病毒接种物保持在冰上冷藏。
    5. 使用模拟感染（1× PBS）和rSARS-CoV-2/WT感染的小鼠作为内部对照。将模拟感染小鼠与rSARS-CoV-2感染小鼠分笼饲养。
    6. 在麻醉舱中使用5%异氟烷气体麻醉小鼠，并以3%异氟烷维持麻醉。
    7. 在确认姿势反应和翻正反射后，将小鼠置于仰卧位。
    8. 用食指和拇指捏住小鼠颈部的皮肤，同时用小指将尾巴固定在手掌上，使动物保持背位。
    9. 将含有50 µL病毒接种物的移液器吸头置于鼻孔处，缓慢注入溶液。通过观察接种液滴消失，确保病毒接种物已被吸入且无反流。
  2. 生物发光监测感染rSARS-CoV-2/Nluc的K18 hACE2转基因小鼠图1 和 图2)
    注意：本实验遵循示意图所示流程，并使用图中展示的病毒 图1需要使用异氟烷麻醉装置 体内 成像系统（IVIS）。参见 材料表 有关所需仪器和系统的详细信息。
    1. 启动成像软件并设置参数，点击图像模式 生物发光，打开滤光片，将曝光时间设置为自动。
    2. 启动IVIS成像系统后，在生物安全柜内将小鼠放入隔离室。以5%浓度的异氟烷对小鼠进行麻醉诱导。待姿势反应和翻正反射消失后，维持使用3%异氟烷。
    3. 小鼠麻醉后，将其从隔离舱中取出，用25 G针头经眼后静脉窦注射以1×PBS按1:10稀释的荧光素酶底物（每只小鼠终体积100 µL）。
    4. 注射荧光素酶底物后，将小鼠放回隔离室，胸部朝上，鼻腔置于混合气锥形罩内，以在成像过程中维持动物的麻醉状态。
    5. 将分离室转移至IVIS成像仪中，在关闭IVIS成像仪门后立即选择 获取 在软件程序中初始化（图2A).
    6. 为了分析所获得的生物发光图像，使用以下方法 感兴趣区域 （感兴趣区域）工具在软件中指定精确信号并测量通量（图2B).
    7. 点击 测量 并让系统开始以光子为单位评估生物发光，以提供可与不同参数提供的输出测量值相比较的绝对光子发射量。
    8. 在感染后第1、2、4和6天对小鼠进行成像。
    9. 之后 成像 将小鼠放回笼中。
  3. K18 hACE2 转基因小鼠感染 rSARS-CoV-2/Venus 后的荧光分析图3 和 图4)
    注意：本实验遵循图示方案及所示的rSARS-CoV-2 图3参见 材料表 有关所需仪器和系统的详细信息。
    1. 启动成像软件并设置参数，设定激发波长（500 nm）和发射滤光片（530 nm），点击图像模式以 荧光 并将曝光时间设置为自动。
    2. 腹腔注射致死剂量的 Fatal-Plus 处死小鼠（>100 mg/kg）。安乐死后，用70%乙醇对切口部位进行消毒。
    3. 使用镊子拉起皮肤，从胸骨向腹部做一纵向切口，并用剪刀从切口两侧向旁侧剪开。剪断肝静脉以减少肺部血液量，避免成像时产生高背景信号。
    4. 用剪刀剪开胸骨并打开肋骨笼。接着用剪刀剪断气管末端，并用镊子取出肺脏。
    5. 将切除的肺组织置于含有2 mL 1x PBS的6孔板中，冲洗以去除多余血液。在样品间使用70%乙醇对手术器械进行消毒和清洁，以尽量减少样品间的交叉污染。
    6. 启动IVIS仪器后，将肺组织放入黑色托盘中，并将各组织彼此分开。
    7. 将托盘放入生物安全柜内的隔离舱中，然后将隔离舱转移至IVIS。关闭舱门并点击 获取 启动成像系统（图 4A).
    8. 为了分析荧光，使用 感兴趣区域 工具并在每只肺周围绘制感兴趣区域（ROI）。手动测量每个ROI，然后使用所提供的平均辐射效率值，并减去假感染小鼠的值（图4B).
    9. 成像完成后，将组织置于冰上用于当天分析，或放入冻存管中用干冰速冻，随后于 -80 °C 保存以备后续处理。
  4. K18-hACE2 转基因小鼠感染 rSARS-CoV-2/Nluc 后的肺部明场成像与病理评分图2A- C）和 rSARS-CoV-2/Venus（图4A- C)
    1. 在对感染了 rSARS-CoV-2/Nluc、rSARS-CoV-2/WT 以及模拟感染的小鼠进行生物发光成像后，将小鼠放回笼中。随后进行安乐死及后续操作。 离体 小鼠肺组织的明场成像（图2A).
    2. 成像后 离体 感染小鼠肺部的荧光，拍摄肺部的明场图像（图 4A).
    3. 使用 ImageJ 分析肺表面的大体病变图2C 和 4C).
    4. 在 ImageJ 中打开待分析的肺部图像。
    5. 计算像素与厘米的比值，使用 直的 工具并测量图像的实际长度。
    6. 选择后，点击 分析 > 测量 用于计算长度方向上的像素长度。
    7. 点击 分析 > 设定比例尺 并输入从上一步计算得出的数值。
    8. 使用 自由选择 工具并选择整个肺表面。点击 分析 > 测量 测量总肺面积。
    9. 点击 编辑 > 选择 > 制作倒置图像 选择肺部其余区域，然后按删除键或退格键以去除背景。
    10. 移除选定区域，然后单击 图像 > 调节 > 颜色阈值.
    11. 选择病理病变区域，调整 亮度 根据存在的充血和出血程度，将数量调整至最低（1到50之间）和最高（50到200之间）。
    12. 选择病理性病变后，单击 选择 阈值颜色面板底部，然后单击 分析 > 测量 用于测量病理区域。
    13. 使用以下公式计算大体病变的百分比：病变区域百分比 =（病变区域测量值 / 肺总表面积）× 100。
  5. 病毒滴定（图2D 和 图 4D)
    1. 成像完成后，对小鼠实施安乐死，并采集肺、脑和鼻黏膜组织。
    2. 将肺、脑和鼻黏膜分别放入无菌组织匀浆器中，并各加入1 mL冰冷的1×PBS。
    3. 以 21,500 x g 离心均质样品 g 离心10分钟以沉淀细胞碎片。收集上清液并转移至新的无菌离心管中，弃去沉淀。
    4. 若当天进行病毒滴度测定，将上清液置于 4 °C 保存。或者，将匀浆样本的上清液于 -80 °C 冻存，待后续检测时使用。
    5. 利用组织匀浆上清液进行10倍系列稀释，并用每种稀释度的上清液1 mL感染融合的Vero E6细胞单层（6孔板格式，1.2 × 106 细胞/孔，设三个重复
    6. 在37 °C、湿润的5% CO₂条件下孵育1小时，使病毒吸附2 培养箱
    7. 病毒吸附后，用 1 mL 1x PBS 洗涤细胞，并在含有 1% 琼脂的 2 mL 感染后培养基中孵育，孵育环境为湿度控制的 5% CO₂ 培养箱2 37 °C 培养箱中孵育 72 小时。
    8. 孵育后，将培养板置于4 °C条件下，用10%中性缓冲甲醛溶液灭活24小时，确保整个培养板完全浸没。
    9. 从BSL3中取出培养板，用1 mL 1×PBS洗涤细胞3次，再加入1 mL 0.5% Triton X-100，在室温（RT）下透化10 min。
    10. 用1 mL含2.5%牛血清白蛋白（BSA）的1x PBS于37 °C封闭细胞1 h，随后在1 mL用2.5% BSA稀释的1 µg/mL SARS-CoV核衣壳（N）蛋白交叉反应性单克隆抗体（1C7C7）中于37 °C孵育1 h。
    11. 用1 mL 1×PBS洗涤细胞3次，然后根据制造商说明书，使用ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒进行斑块显色。
    12. 以 PFU/mL 计算病毒滴度。
      ​注意：使用公式 PFU/mL = 稀释倍数 × 空斑数 × (1 mL/接种体积) 进行计算。
  6. K18-hACE2 转基因小鼠感染 rSARS-CoV-2/Nluc 后组织中的 Nluc 活性图 2E)
    1. 使用荧光素酶检测试剂盒，按照制造商说明书对模拟感染、rSARS-CoV-2/WT感染及rSARS-CoV-2/Nluc感染的K18 hACE2转基因小鼠器官匀浆中的Nluc存在情况进行定量分析。
  7. 发病率与死亡率评估（图2F，G 和 图4E，F)
    1. 通过鼻腔感染4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠，剂量为105 PFU 的 rSARS-CoV-2/WT、rSARS-CoV-2/Venus、rSARS-CoV-2/Nluc 或模拟感染，操作如第 3.1 节所述。
    2. 在12天内每天同一时间监测并称量小鼠体重，以尽量减少因进食导致的体重波动。对于体重下降达到初始体重25%的小鼠，应实施安乐死，因其已达到人道终点，并记录这些小鼠为死于病毒感染。
    3. 12天后，处死存活的小鼠，计算体重变化百分比和存活率。

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结果

K18 hACE2 转基因小鼠中 rSARS-CoV-2/Nluc 感染图1 2）
图1A 显示了用于评估感染的 rSARS-CoV-2/WT（上图）和 rSARS-CoV-2/Nluc（下图）的示意图 体内. 图1B 展示了用于评估K18 hACE2转基因小鼠中rSARS-CoV-2/Nluc感染动态的示意图流程。4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠（N = 4）分别以1×PBS进行模拟感染或以105 经鼻接种 rSARS-CoV-2/WT 或 rSARS-CoV-2/Nluc 的 PFU。感染后第 1、2、4 和 6 天，使用隔离舱对小鼠进行麻醉，随后经眶后注射 Nluc 底物。立即将隔离舱放入 IVIS 系统中检测 Nluc 信号 体内 使用成像软件进行检测。在感染rSARS-CoV-2/Nluc的小鼠中可明显检测...

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讨论

本方案展示了利用表达报告基因的重组SARS-CoV-2（rSARS-CoV-2）监测病毒感染的可行性 体内两种表达报告基因的重组病毒均为研究SARS-CoV-2感染提供了优良工具 体内. 所述的 离体 (rSARS-CoV-2/Venus) 和 体内 (rSARS-CoV-2/Nluc) 成像系统是研究 SARS-CoV-2 感染动态、病毒致病机制以及在病毒感染后不同时间点鉴定受感染细胞/器官的优良选择。为开展 离体 (rSARS-CoV-2/Venus) 和 体内 (rSARS-CoV-2/Nluc) 研究中，准确且可重复的感染以及对 rSARS-CoV-2/Nluc 进行充分的接种至关重要。

当研究时 体内 使用rSARS-CoV-2/Nluc进行感染实验时，应剃除小鼠毛发以利于在IVIS下观察Nluc信号。同时需要接种Nluc底物以实现Nluc的可视化。这可能需要一些预实验来确定Nluc底物的浓度和用量，以确保获得较强的Nluc信号。在研究过程中

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披露

作者声明，本研究所涉及的工作不存在任何商业、财务、非财务或个人利益冲突。

致谢

我们感谢本研究所（德克萨斯生物医学研究所）的成员在 COVID-19 大流行期间为保障设施正常、安全运行所付出的努力。我们还要感谢本机构生物安全委员会（IBC）和机构动物照护与使用委员会（IACUC）以高效的方式审阅我们的实验方案。感谢西奈山伊坎医学院的 Thomas Moran 博士提供了SARS-CoV交叉反应性单克隆抗体1C7C7核衣壳（N）蛋白。Martinez-Sobrido 实验室目前的 SARS-CoV-2 研究得到了美国国家过敏与传染病研究所（NIAID/NIH）基金项目 RO1AI161363-01、RO1AI161175-01A1 和 R43AI165089-01 的资助；美国国防部（DoD）基金项目 W81XWH2110095 和 W81XWH2110103；圣安东尼奥精准治疗合作伙伴计划；德克萨斯生物医学研究所论坛；德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心；圣安东尼奥医学基金会；以及由 NIAID 资助的流感致病机制与传播研究中心（CRIPT），即流感研究与应对卓越研究中心（CEIRR，合同号 #75N93021C00014）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% Triton X-100J.T.BakerX198-07室温（RT）保存
1% DEAE-葡聚糖MP Biomedicals195133
10% 甲醛溶液，中性缓冲Sigma-AldrichHT501128
琼脂OxoidLP0028
24孔细胞培养板Greiner Bio-one662160
5% 碳酸氢钠Sigma AldrichS-5761
6孔细胞培养板Greiner Bio-one657160
96孔细胞培养板Greiner Bio-one655-180
非洲绿猴肾上皮细胞（Vero E6）ATCCCRL-1586
Ami HTSpectral Instruments Imaging
Aura成像软件 3.2.0Spectral Instruments Imaging图像分析软件
牛血清白蛋白（BSA），35%Sigma-AldrichA96474°C 下保存 °C
细胞培养级水康宁25-055-CV
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基Corning Cellgro15-013-CV4°C 下保存 °C
麻醉气体机Veterinary Anesthesia Systems, Inc.VAS 2001R
胎牛血清（FBS）Seradigm1500-050-20℃保存 °C
4至6周龄雌性K18-hACE2转基因小鼠杰克逊实验室34860
Graphpad Prism 版本 9.1.0GraphPad
异氟烷巴克斯特1001936040室温保存
MARS 数据分析软件BMG LABTECH
MB10 片剂QUIP 实验室MBTAB1.5室温保存
Nano-Glo 荧光素酶检测试剂PromegaN1110该试剂用于检测Nluc活性。储存于-20℃ °C
Nunc MicroWell 96孔微孔板赛默飞世尔科技269620
Nunc MicroWell 96孔微孔板赛默飞世尔科技269620
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）100倍浓缩液康宁30-009-CI-20℃保存 °C
PHERAstar FSXBMG LABTECHPHERAstar FSX
Precelleys Evolution 匀浆器Bertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
软组织匀浆 CK14 – 7 mLBertin InstrumentsP000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask赛默飞世尔科技156499
VECTASTAIN ABC-HRP 试剂盒，辣根过氧化物酶Vector LaboratoriesPK-4002ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒

参考文献

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SARS CoV 2 K18 hACE2 SARS CoV 2
利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠进行病毒感染的活体成像与定量分析
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