本方案利用表达荧光素酶和荧光蛋白的重组（r）SARS-CoV-2 及其 体内 在K18-hACE2转基因小鼠中使用成像系统（IVIS）以克服研究SARS-CoV-2感染所需的次级方法 体内.
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摘要
摘要
新型冠状病毒病2019（COVID-19）大流行由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起。截至目前，SARS-CoV-2已在全球造成超过2.42亿例感染和逾490万例死亡。与其他病毒类似，研究SARS-CoV-2需要采用实验方法来检测病毒感染细胞和/或动物模型中的病毒存在。为克服这一限制，我们构建了可复制的表达生物发光（纳米荧光素酶，Nluc）或荧光（Venus）蛋白的重组SARS-CoV-2（rSARS-CoV-2）。这些表达报告蛋白的rSARS-CoV-2可用于追踪病毒感染过程 体外 和 体内 基于Nluc和Venus报告基因的表达。本研究描述了使用rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus在先前报道的K18人血管紧张素转换酶2（hACE2）转基因小鼠感染模型中检测和追踪SARS-CoV-2感染的方法 体内 成像系统（IVIS）。该rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus表现出与rSARS-CoV-2/WT相似的致病性及病毒复制能力 体内重要的是，Nluc 和 Venus 的表达使我们能够直接追踪病毒感染过程 体内和离体，在感染小鼠中。这些rSARS-CoV-2/Nluc和rSARS-CoV-2/Venus是研究SARS-CoV-2生物学的优良工具 体内，以了解病毒感染及相关的新冠肺炎疾病，并确定有效的预防性和/或治疗性措施来应对SARS-CoV-2感染。
引言
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是一种有包膜的、正义单链RNA病毒，属于冠状病毒科（Coronaviridae）的乙型冠状病毒属1。该病毒家族分为甲型、乙型、丙型和丁型冠状病毒1。甲型和乙型冠状病毒主要感染哺乳动物，而丙型和丁型冠状病毒几乎 exclusively 感染鸟类2。迄今为止，已有七种冠状病毒（CoV）跨越物种屏障，成为人类冠状病毒（HCoV）：两种甲型冠状病毒（HCoV-229E 和 HCoV-NL63）以及五种乙型冠状病毒（HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒[MERS-CoV]和SARS-CoV-2）3,4,5,6。SARS-CoV、MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 具有高度致病性，可引起严重的下呼吸道感染7。在SARS-CoV-2出现之前，曾发生过两次由冠状病毒引起的疫情：2002年至2003年间在中国广东省暴发的SARS-CoV疫情，病死率（CFR）约为9.7%；以及自2012年....
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方案
涉及K18 hACE2转基因小鼠的实验方案已获得德克萨斯生物医学研究所（TBRI）机构生物安全委员会（IBC）和机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。所有实验均遵循美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》中的建议40。在操作小鼠时，必须穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
1. 使用 K18 hACE2 转基因小鼠
- 在生物安全二级（BSL-2）动物饲养设施中，以无特定病原体条件饲养和维持4至6周龄雌性B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J小鼠（K18 hACE2转基因小鼠）。
- 到达BSL2设施后，让动物适应环境7天，随后将其转移至BSL-3动物设施进行感染及其他实验操作。
- 根据IACUC规程，每笼放置4只小鼠。为确保动物已死亡，在小鼠感染rSARS-CoV-2后 体内 成像后，使用致死剂量的Fatal-Plus实施安乐死>100 mg/kg
2. 生物安全
注意：本研究中，rSARS-CoV-2 是使用基于 BAC 的反向遗传系统生成的，针对 SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 毒株，....
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结果
K18 hACE2 转基因小鼠中 rSARS-CoV-2/Nluc 感染图1 2）
图1A 显示了用于评估感染的 rSARS-CoV-2/WT（上图）和 rSARS-CoV-2/Nluc（下图）的示意图 体内. 图1B 展示了用于评估K18 hACE2转基因小鼠中rSARS-CoV-2/Nluc感染动态的示意图流程。4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠（N = 4）分别以1×PBS进行模拟感染或以105 经鼻接种 rSARS-CoV-2/WT 或 rSARS-CoV-2/Nluc 的 PFU。感染后第 1、2、4 和 6 天，使用隔离舱对小鼠进行麻醉，随后经眶后注射 Nluc 底物。立即将隔离舱放入 IVIS 系统中检测 Nluc 信号 体内 使用成像软件进行检测。在感染rSARS-CoV-2/Nluc的小鼠中可明显检测.......
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讨论
本方案展示了利用表达报告基因的重组SARS-CoV-2（rSARS-CoV-2）监测病毒感染的可行性 体内两种表达报告基因的重组病毒均为研究SARS-CoV-2感染提供了优良工具 体内. 所述的 离体 (rSARS-CoV-2/Venus) 和 体内 (rSARS-CoV-2/Nluc) 成像系统是研究 SARS-CoV-2 感染动态、病毒致病机制以及在病毒感染后不同时间点鉴定受感染细胞/器官的优良选择。为开展 离体 (rSARS-CoV-2/Venus) 和 体内 (rSARS-CoV-2/Nluc) 研究中，准确且可重复的感染以及对 rSARS-CoV-2/Nluc 进行充分的接种至关重要。
当研究时 体内 使用rSARS-CoV-2/Nluc进行感染实验时，应剃除小鼠毛发以利于在IVIS下观察Nluc信号。同时需要接种Nluc底物以实现Nluc的可视化。这可能需要一些预实验来确定Nluc底物的浓度和用量，以确保获得较强的Nluc信号。在研究过程中
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披露
作者声明，本研究所涉及的工作不存在任何商业、财务、非财务或个人利益冲突。
致谢
我们感谢本研究所（德克萨斯生物医学研究所）的成员在 COVID-19 大流行期间为保障设施正常、安全运行所付出的努力。我们还要感谢本机构生物安全委员会（IBC）和机构动物照护与使用委员会（IACUC）以高效的方式审阅我们的实验方案。感谢西奈山伊坎医学院的 Thomas Moran 博士提供了SARS-CoV交叉反应性单克隆抗体1C7C7核衣壳（N）蛋白。Martinez-Sobrido 实验室目前的 SARS-CoV-2 研究得到了美国国家过敏与传染病研究所（NIAID/NIH）基金项目 RO1AI161363-01、RO1AI161175-01A1 和 R43AI165089-01 的资助；美国国防部（DoD）基金项目 W81XWH2110095 和 W81XWH2110103；圣安东尼奥精准治疗合作伙伴计划；德克萨斯生物医学研究所论坛；德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心；圣安东尼奥医学基金会；以及由 NIAID 资助的流感致病机制与传播研究中心（CRIPT），即流感研究与应对卓越研究中心（CEIRR，合同号 #75N93021C00014）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | 室温（RT）保存 |
| 1% DEAE-葡聚糖 | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% 甲醛溶液，中性缓冲 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 琼脂 | Oxoid | LP0028 | |
| 24孔细胞培养板 | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6孔细胞培养板 | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96孔细胞培养板 | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| 非洲绿猴肾上皮细胞（Vero E6） | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura成像软件 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | 图像分析软件 | |
| 牛血清白蛋白（BSA），35% | Sigma-Aldrich | A9647 | 4°C 下保存 °C |
| 细胞培养级水 | 康宁 | 25-055-CV | |
| 杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基 | Corning Cellgro | 15-013-CV | 4°C 下保存 °C |
| 麻醉气体机 | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| 胎牛血清（FBS） | Seradigm | 1500-050 | -20℃保存 °C |
| 4至6周龄雌性K18-hACE2转基因小鼠 | 杰克逊实验室 | 34860 | |
| Graphpad Prism 版本 9.1.0 | GraphPad | ||
| 异氟烷 | 巴克斯特 | 1001936040 | 室温保存 |
| MARS 数据分析软件 | BMG LABTECH | ||
| MB10 片剂 | QUIP 实验室 | MBTAB1.5 | 室温保存 |
| Nano-Glo 荧光素酶检测试剂 | Promega | N1110 | 该试剂用于检测Nluc活性。储存于-20℃ °C |
| Nunc MicroWell 96孔微孔板 | 赛默飞世尔科技 | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96孔微孔板 | 赛默飞世尔科技 | 269620 | |
| 青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）100倍浓缩液 | 康宁 | 30-009-CI | -20℃保存 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution 匀浆器 | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| 软组织匀浆 CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | 赛默飞世尔科技 | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP 试剂盒，辣根过氧化物酶 | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒 |
参考文献
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome cor....
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重印与许可
