方法文章

通过逆行注射牛磺胆酸钠至胆胰管建立小鼠重症急性胰腺炎模型

DOI：

10.3791/63129

⸱

2022年4月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 2MOE Engineering Center of Hematological Disease, Soochow University, 3Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, 4National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 5MOH Key Lab of Thrombosis and Hemostasis, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Collaborative Innovation Center of Hematology, Soochow University

本文内容

摘要

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本文描述了一种重症急性胰腺炎的小鼠模型。本方案操作快速、简便且易于实施，因此可能为方便地研究急性胰腺炎的分子机制及不同治疗干预措施提供有效手段。

摘要

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急性胰腺炎（AP）尤其是重症急性胰腺炎（SAP）的发病率在年轻人群中每年呈上升趋势。然而，目前临床实践中缺乏有效的治疗方法。由于转基因和基因敲除品系易于获得且体型较小，所需药物剂量极低，因而具有显著优势。 体内 评估急性胰腺炎（AP）时，小鼠是该研究领域中广泛认可的实验模型。此外，通过牛磺胆酸钠（TC）诱导的重症急性胰腺炎（SAP）目前是最常用且特征最明确的模型之一。该模型已被用于探索AP进程中的新型治疗方法及潜在的分子事件。本文介绍了使用牛磺胆酸钠和一种简易自制微量注射器建立AP小鼠模型的方法，同时提供了后续组织学和血清学检测的技术流程。

引言

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急性胰腺炎（AP）是一种以主胰管阻塞为特征的胰腺急性炎症，继而导致胰管扩张，并因胰酶异常激活而引发胰腺自体消化。其临床表现包括局部或全身性炎症、腹痛以及血清淀粉酶升高1,2。根据严重程度分类3，AP可分为轻度、中度和重度三种类型，其中重度急性胰腺炎（SAP）最为严重，因其死亡率超过30%4。在美国，AP是导致住院的最常见原因之一，每年影响超过20万名患者5。此外，AP尤其是SAP的发病率逐年上升，并且越来越多地影响年轻人群6。然而，目前临床实践中仍缺乏有效的治疗手段6,7。因此，有必要深入探究AP相关的分子机制，以推动治疗策略的改进。

研究急性胰腺炎（AP）的发病机制及评估不同治疗手段的有效性，需要成熟的实验动物模型。转基因和基因敲除品系动物易于获得，且体型较小，可减少药物实验所需的剂量， 体内 评估时，小鼠是急性胰腺炎（AP）研究的首选。因此，已开发出多种小鼠急性胰腺炎模型8,<....

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方案

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所有涉及动物的实验均经苏州大学动物伦理委员会批准。所有手术操作均在全身麻醉下进行。根据以往文献，未使用镇痛药以避免干扰疾病的自然进程28,29。苏州大学动物伦理委员会也批准了不使用镇痛的方案。

1. 准备

  1. 在手术前 8-12 小时对 C57BL/6 野生型小鼠进行禁食。
  2. 配制 5% (w/v) TC 溶液（93 mM），用 0.9% 氯化钠溶液稀释。使用 0.22 µm 滤器过滤该溶液。
  3. 使用压力灭菌器在 121 °C 下对包括镊子、剪刀、刀片架、持针器、止血夹、血管夹和无菌手术单在内的手术器械和材料进行高压灭菌，持续 30 分钟。
  4. 准备自制的微量注射器。将一次性胰岛素针头和延长的塑料移液器吸头手动安装到 25 µL 平头微量注射器上。通过辐照进行灭菌。

2. 麻醉与术前准备

  1. 称取6至8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠（体重约21–23 g），按50 mg/kg剂量经腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液以诱导全身麻醉。
  2. 用胶带将小鼠仰卧位固定于无菌泡沫平板上。
  3. 使用脱毛膏去除小鼠剑突水平至....

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结果

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通过严格遵循上述操作步骤，我们获得的平均手术时长约为40分钟。术后24小时、48小时和72小时，小鼠活动略有减少，体重分别平均减轻约0.5–1.75 g、0.85–1.85 g和0.5–4.73 g（图2）。

从手术完成到术后24小时，随着疾病的发展，小鼠活动减少，反应和动作变得迟缓。

术后72小时，对照组小鼠和SAP小鼠的存活率分别为100%（8/8）和72.7%（8/11）（图3）。

根据胰腺组织切片的H&E染色结果（图4）和病理评分（图5），与对照组小鼠相比，重症急性胰腺炎（SAP）小鼠的胰腺组织中可见明显的水肿（评分：3.14 ± 0.51 vs. 0.10 ± 0.08）、炎症（评分：1.41 ± 0.81 vs. 0.......

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讨论

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由雨蛙肽诱导的重症急性胰腺炎（SAP）模型是一种优秀的研究工具。如本研究所示，该模型在普通实验室中非常容易实现，无需使用特殊设备。当结合组织学和生物化学分析使用时，该方法提供了一种经济（试剂廉价）且省时（24小时时间窗）的急性胰腺炎（AP）诱导与评估手段。通过调整雨蛙肽的浓度，还可实现轻度和中度急性胰腺炎的制备。Perides等也曾采用雨蛙肽在小鼠中诱导SAP20，主要区别在于他们使用泵进行雨蛙肽输注，这可能提供更精确的输注剂量。

根据我们的经验，在造模手术过程中，最重要的因素包括充分暴露胆胰管、微注射针穿刺顺畅，以及以相对恒定的速度将TC注入胆胰管和胰管。手术过程中应注意以下几点。首先，应轻柔地牵拉十二指肠，避免施加过大的力量，以免导致十二指肠坏死。胆胰管开口位于十二指肠内侧缘（也称为十二指肠乳头），可据此定位胆胰管。若操作成功，应能辨认出白色的十二指肠乳头以及构成胆胰管并穿过叶状胰腺的管状结构。充分暴露胆胰管有助于后续操作。其次，当使用缝线将十二指肠固定于仰卧位小鼠的左下侧时，应施加适度的牵拉力，以使胆胰管伸直且无张力丢失。牵拉力.......

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致谢

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我们感谢以下基金的支持：国家临床研究中心转化研究基金 [2020WSA01]、苏州市卫生健康委员会青年学者科技项目基金 [KJXW2020002]、苏州市科技计划项目（SKY2021038 和 SKJY2021050）、江苏省高校优势学科建设工程（PAPD）以及一项基础研究基金 & 江苏省社会发展计划（BE2018659）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% 碘伏上海利康消毒高科技公司3101024 mL/只小鼠
0.9% 氯化钠国药集团化学试剂有限公司100193180.8 mL/只小鼠
1% 戊巴比妥钠SigmaP37610.2–0.25 mL/只小鼠
25 μL 平头微量注射器高戈，上海A124019
4% 多聚甲醛碧云天，南通，中国P0099-500ml
5% 牛磺胆酸钠（TC）阿拉丁S100834-5g10 μL/SAP 小鼠
6-0 带针线圈尼龙无菌显微缝合线（1/2 圆）成和20093
75% 酒精国药集团化学试剂有限公司100092184 mL/只小鼠
8-0 带针线圈尼龙无菌显微缝合线（3/8 圆）成和19064
丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国ALT0012
淀粉酶检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国AMY0012
带12 mm钳口（3 cm）的弯型小型止血夹成和HC-X022
用于小鼠垫料的白杨木屑或碎屑北京维通利华实验动物技术有限公司VR03015
天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国AST0012
血尿素氮（BUN）检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国BUN0011
C57BL/6 小鼠北京维通利华实验动物技术有限公司213
肌酸检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国CRE0012
切片机专用刀片碧云天，南通，中国E0994
止血钳（9.5 cm，弯型）上医器材，上海医疗器械有限公司JC3901
脂肪酶检测试剂盒建成，南京，中国A054-2-1
切片机Leica 生物系统，德国RM2245
迈瑞生化分析仪迈瑞，深圳，中国BS-420
髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒建成，南京，中国A044-1-1
正常小鼠饲料南通特洛菲饲料科技有限公司LAD 1000
磷酸盐缓冲液碧云天，南通，中国C0221A
带5 mm钳口（1.5 cm）的直型微型止血夹上医器材，上海医疗器械有限公司W40130
直型或弯型镊子（11.0 cm）成和HC-X091A 或 HC-X090A
直剪刀（10.0 cm）成和，宁波，中国HC-J039102
Thermo Scientific 离心机Thermo Scientific，美国Multifuge X1R

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
  2. Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research.....

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