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方法文章

通过逆行注射牛磺胆酸钠至胆胰管建立小鼠重症急性胰腺炎模型

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DOI：

10.3791/63129

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2022年4月1日

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1Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 2MOE Engineering Center of Hematological Disease, Soochow University, 3Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, 4National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 5MOH Key Lab of Thrombosis and Hemostasis, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Collaborative Innovation Center of Hematology, Soochow University

本文内容

摘要

本文描述了一种重症急性胰腺炎的小鼠模型。本方案操作快速、简便且易于实施，因此可能为方便地研究急性胰腺炎的分子机制及不同治疗干预措施提供有效手段。

摘要

急性胰腺炎（AP）尤其是重症急性胰腺炎（SAP）的发病率在年轻人群中每年呈上升趋势。然而，目前临床实践中缺乏有效的治疗方法。由于转基因和基因敲除品系易于获得且体型较小，所需药物剂量极低，因而具有显著优势。 体内 评估急性胰腺炎（AP）时，小鼠是该研究领域中广泛认可的实验模型。此外，通过牛磺胆酸钠（TC）诱导的重症急性胰腺炎（SAP）目前是最常用且特征最明确的模型之一。该模型已被用于探索AP进程中的新型治疗方法及潜在的分子事件。本文介绍了使用牛磺胆酸钠和一种简易自制微量注射器建立AP小鼠模型的方法，同时提供了后续组织学和血清学检测的技术流程。

引言

急性胰腺炎（AP）是一种以主胰管阻塞为特征的胰腺急性炎症，继而导致胰管扩张，并因胰酶异常激活而引发胰腺自体消化。其临床表现包括局部或全身性炎症、腹痛以及血清淀粉酶升高1,2。根据严重程度分类3，AP可分为轻度、中度和重度三种类型，其中重度急性胰腺炎（SAP）最为严重，因其死亡率超过30%4。在美国，AP是导致住院的最常见原因之一，每年影响超过20万名患者5。此外，AP尤其是SAP的发病率逐年上升，并且越来越多地影响年轻人群6。然而，目前临床实践中仍缺乏有效的治疗手段6,7。因此，有必要深入探究AP相关的分子机制，以推动治疗策略的改进。

研究急性胰腺炎（AP）的发病机制及评估不同治疗手段的有效性，需要成熟的实验动物模型。转基因和基因敲除品系动物易于获得，且体型较小，可减少药物实验所需的剂量， 体内 评估时，小鼠是急性胰腺炎（AP）研究的首选。因此，已开发出多种小鼠急性胰腺炎模型8,9.

通过静脉注射雨蛙素诱导的轻度胰腺炎大鼠模型进行研究10Niederau 等人利用相同的药物和注射途径诱导腺泡细胞坏死，建立了 SAP 小鼠模型11尽管该模型具有多种优势，包括无创性、诱导迅速、可重复性高以及适用范围广，但其主要缺点在于大多数情况下仅能诱导出轻度急性胰腺炎（AP），从而限制了其临床相关性。酒精被认为是急性胰腺炎（AP）的主要病因因素之一；然而，Foitzik 等人报道，酒精仅在与其他因素（如外分泌过度刺激）联合作用时才会导致胰腺损伤。12此外，尽管已建立了酒精诱导的AP模型 通过 不同的给药途径和药物剂量已有报道13,14,15，其主要缺点是难以重复。腹腔注射L-arginine也可在小鼠中诱导急性胰腺炎（AP）16；然而，其临床相关性较低，限制了其应用。牛磺胆酸盐是一种胆盐，Creutzfeld 等人于1965年首次提出将其用于诱导产生类似人类急性胰腺炎（AP）的病理状态。 通过 胰管灌注17尽管在其病理生理学中的临床相关性方面仍存在争议18,19，牛磺胆酸钠诱导的胰腺炎仍然是重症急性胰腺炎（SAP）不可或缺的模型。

由于该模型易于实现且在小鼠中效果显著，现已成为小型动物中最常用的急性胰腺炎（AP）模型之一 体内 研究中，Perides 等人采用牛磺胆酸钠（TC）在小鼠中诱导重症急性胰腺炎（SAP）20，为理解其病理机制提供了见解。结合基因修饰技术，该模型已帮助我们证实了多个与急性胰腺炎（AP）相关的特定基因。例如，Bicozo 等人研究表明，CD38 基因敲除可抵御TC输注型胰腺炎模型的发病，并将该保护机制归因于细胞内 Ca²⁺ 水平的改变2+ 信号转导21Fanczal 等人研究了TRPM2在小鼠胰腺腺泡细胞和导管细胞质膜上表达的生理意义，并证明在TRPM2基因敲除小鼠中，TC诱导的重症急性胰腺炎（SAP）严重程度降低22此外，该模型还为测试多种新型药物提供了一种简单而有效的方法。 体内例如，该方法实现了对咖啡因治疗效果的验证23脱氢胆酸24以及各种抗氧化剂和抗凝剂25,26。该证据表明TC诱导的SAP模型具有良好的通用性。尽管Wittel等人描述过类似的小鼠模型27，若缺乏对实施步骤的详细描述，可能导致研究结果无法重现。本文重点介绍使用简易自制微量注射器的方法，研究三氯化钛诱导的重症急性胰腺炎（SAP），从而不仅为急性胰腺炎（AP）发病机制及治疗的进一步研究提供可能的指导，也为其他多种物质的实验研究提供一种高度可适应的实验方法。

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方案

所有涉及动物的实验均经苏州大学动物伦理委员会批准。所有手术操作均在全身麻醉下进行。根据以往文献，未使用镇痛药以避免干扰疾病的自然进程28,29。苏州大学动物伦理委员会也批准了不使用镇痛的方案。

1. 准备

  1. 在手术前 8-12 小时对 C57BL/6 野生型小鼠进行禁食。
  2. 配制 5% (w/v) TC 溶液（93 mM），用 0.9% 氯化钠溶液稀释。使用 0.22 µm 滤器过滤该溶液。
  3. 使用压力灭菌器在 121 °C 下对包括镊子、剪刀、刀片架、持针器、止血夹、血管夹和无菌手术单在内的手术器械和材料进行高压灭菌，持续 30 分钟。
  4. 准备自制的微量注射器。将一次性胰岛素针头和延长的塑料移液器吸头手动安装到 25 µL 平头微量注射器上。通过辐照进行灭菌。

2. 麻醉与术前准备

  1. 称取6至8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠（体重约21–23 g），按50 mg/kg剂量经腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液以诱导全身麻醉。
  2. 用胶带将小鼠仰卧位固定于无菌泡沫平板上。
  3. 使用脱毛膏去除小鼠剑突水平至双侧髂前上棘连线区域的毛发，并以左右腋前线为界平行延伸，完成各动物手术区域的准备。
  4. 准备无菌手术区域，重点包括动物体表已处理区域及术者前方操作区域。
    1. 对实验台面进行消毒。
    2. 用外科擦洗液多次清洁切口部位，再用0.5%碘伏擦拭皮肤2至3次，每次擦拭后静置干燥1–2分钟。
    3. 用无菌手术单覆盖小鼠身体。

3. 手术步骤

注意：图1展示了通过显微注射将TC逆行注入胆胰管前后小鼠胰腺的解剖结构和形态。

  1. 在腹部正中做一条长约2至3厘米的切口。
  2. 从胃部由左向右定位十二指肠。用手术镊和浸有消毒液的棉签轻轻将十二指肠拉出并移向左侧，以暴露胰腺、胆胰管和十二指肠乳头。注意避免损伤肠壁及相关血管。
  3. 使用8-0缝线穿过乳头周围十二指肠与胰腺的连接处，并将缝线拉至小鼠身体左侧，以固定十二指肠。
  4. 轻轻牵拉皮肤和肝脏下缘至一侧。夹闭肝总管，注意避免夹闭门静脉或胰腺。同时夹闭近端胆胰管。
  5. 将微量注射器逆行穿刺入远端胆胰管。用夹子固定针尖于十二指肠乳头附近。以5 µL/min的速度向胰管内注入10 µL的5% TC溶液。
  6. 保持胆胰管闭合5分钟，以维持稳定压力。随后拔出微量注射器，并移除夹子。
  7. 将十二指肠复位至原始解剖位置，并检查有无出血。
  8. 用6-0缝线缝合伤口，并用0.5%碘伏消毒。

4. 恢复与术后管理

  1. 在37 °C的加热垫上使动物从麻醉中恢复。所有动物完全苏醒前，不得将手术后的动物送至术后观察室。
  2. 皮下缓慢注射0.8 mL的0.9%生理盐水，以补充体液。
  3. 术后密切监测动物的一般状况，以及感染或疾病的迹象。

5. 血清学检测与组织学评估

  1. 术后24小时，使用相同剂量和注射途径的戊巴比妥钠麻醉小鼠。
  2. 从腹主动脉采集全部血液（每只小鼠约0.8 mL），在1,500 ×g 条件下离心15分钟，分离血清用于后续检测。
  3. 采集胰腺组织。
  4. 打开胸腔采集肺组织。
  5. 使用商业试剂盒，根据生产商说明书检测血清中的生化功能指标，包括淀粉酶、脂肪酶、肝功能（丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST））以及肾功能（尿素和肌酐）。
  6. 将肺和胰腺组织匀浆，使用商业试剂盒根据生产商说明书测定髓过氧化物酶（MPO）水平。
  7. 打开胸腔，用20 mL磷酸盐缓冲液（PBS）灌注两次，然后采集胰腺。将其浸入4%多聚甲醛溶液中固定24小时，经梯度酒精脱水后进行石蜡包埋。
  8. 使用切片机制备5 µm厚的胰腺组织切片。
  9. 对胰腺组织切片进行H&E染色，用于组织学评估。
  10. 根据Schmidt等人30提出的标准评估病理学评分。

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结果

通过严格遵循上述操作步骤，我们获得的平均手术时长约为40分钟。术后24小时、48小时和72小时，小鼠活动略有减少，体重分别平均减轻约0.5–1.75 g、0.85–1.85 g和0.5–4.73 g（图2）。

从手术完成到术后24小时，随着疾病的发展，小鼠活动减少，反应和动作变得迟缓。

术后72小时，对照组小鼠和SAP小鼠的存活率分别为100%（8/8）和72.7%（8/11）（图3）。

根据胰腺组织切片的H&E染色结果（图4）和病理评分（图5），与对照组小鼠相比，重症急性胰腺炎（SAP）小鼠的胰腺组织中可见明显的水肿（评分：3.14 ± 0.51 vs. 0.10 ± 0.08）、炎症（评分：1.41 ± 0.81 vs. 0...

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讨论

由雨蛙肽诱导的重症急性胰腺炎（SAP）模型是一种优秀的研究工具。如本研究所示，该模型在普通实验室中非常容易实现，无需使用特殊设备。当结合组织学和生物化学分析使用时，该方法提供了一种经济（试剂廉价）且省时（24小时时间窗）的急性胰腺炎（AP）诱导与评估手段。通过调整雨蛙肽的浓度，还可实现轻度和中度急性胰腺炎的制备。Perides等也曾采用雨蛙肽在小鼠中诱导SAP20，主要区别在于他们使用泵进行雨蛙肽输注，这可能提供更精确的输注剂量。

根据我们的经验，在造模手术过程中，最重要的因素包括充分暴露胆胰管、微注射针穿刺顺畅，以及以相对恒定的速度将TC注入胆胰管和胰管。手术过程中应注意以下几点。首先，应轻柔地牵拉十二指肠，避免施加过大的力量，以免导致十二指肠坏死。胆胰管开口位于十二指肠内侧缘（也称为十二指肠乳头），可据此定位胆胰管。若操作成功，应能辨认出白色的十二指肠乳头以及构成胆胰管并穿过叶状胰腺的管状结构。充分暴露胆胰管有助于后续操作。其次，当使用缝线将十二指肠固定于仰卧位小鼠的左下侧时，应施加适度的牵拉力，以使胆胰管伸直且无张力丢失。牵拉力...

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致谢

我们感谢以下基金的支持：国家临床研究中心转化研究基金 [2020WSA01]、苏州市卫生健康委员会青年学者科技项目基金 [KJXW2020002]、苏州市科技计划项目（SKY2021038 和 SKJY2021050）、江苏省高校优势学科建设工程（PAPD）以及一项基础研究基金 & 江苏省社会发展计划（BE2018659）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% 碘伏上海利康消毒高科技公司3101024 mL/只小鼠
0.9% 氯化钠国药集团化学试剂有限公司100193180.8 mL/只小鼠
1% 戊巴比妥钠SigmaP37610.2–0.25 mL/只小鼠
25 μL 平头微量注射器高戈，上海A124019
4% 多聚甲醛碧云天，南通，中国P0099-500ml
5% 牛磺胆酸钠（TC）阿拉丁S100834-5g10 μL/SAP 小鼠
6-0 带针线圈尼龙无菌显微缝合线（1/2 圆）成和20093
75% 酒精国药集团化学试剂有限公司100092184 mL/只小鼠
8-0 带针线圈尼龙无菌显微缝合线（3/8 圆）成和19064
丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国ALT0012
淀粉酶检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国AMY0012
带12 mm钳口（3 cm）的弯型小型止血夹成和HC-X022
用于小鼠垫料的白杨木屑或碎屑北京维通利华实验动物技术有限公司VR03015
天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国AST0012
血尿素氮（BUN）检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国BUN0011
C57BL/6 小鼠北京维通利华实验动物技术有限公司213
肌酸检测试剂盒恩普诺康，安徽，中国CRE0012
切片机专用刀片碧云天，南通，中国E0994
止血钳（9.5 cm，弯型）上医器材，上海医疗器械有限公司JC3901
脂肪酶检测试剂盒建成，南京，中国A054-2-1
切片机Leica 生物系统，德国RM2245
迈瑞生化分析仪迈瑞，深圳，中国BS-420
髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒建成，南京，中国A044-1-1
正常小鼠饲料南通特洛菲饲料科技有限公司LAD 1000
磷酸盐缓冲液碧云天，南通，中国C0221A
带5 mm钳口（1.5 cm）的直型微型止血夹上医器材，上海医疗器械有限公司W40130
直型或弯型镊子（11.0 cm）成和HC-X091A 或 HC-X090A
直剪刀（10.0 cm）成和，宁波，中国HC-J039102
Thermo Scientific 离心机Thermo Scientific，美国Multifuge X1R

参考文献

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