制备用于研究T细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层

摘要

本文介绍了使用脂质双层支撑微球逐步重建合成抗原呈递细胞的方案，以及利用该系统检测活化T细胞突触输出的方法。

摘要

抗原提呈细胞（APC）通过与T细胞的直接接触传递三种活化信号：1）抗原，2）共刺激/共抑制信号，3）可溶性细胞因子。T细胞在活化后会释放两种效应颗粒：跨突触囊泡（tSVs）和超分子攻击颗粒，分别用于传递细胞间信使并介导细胞毒性作用。这些颗粒会被与T细胞直接接触的抗原提呈细胞迅速内化，导致其表征极为困难。本文介绍了构建和使用珠支持的脂双层（BSLB）作为抗原提呈细胞（APC）模拟物以捕获和分析这些跨突触颗粒的实验方案。同时描述了细胞表面蛋白密度的绝对定量方法、以生理相关水平重建BSLB的技术，以及通过流式细胞术追踪T细胞突触颗粒释放的流程。该方案可进一步拓展用于研究单个蛋白、复杂配体混合物、病原体毒力因子以及药物对各类T细胞效应输出的影响，包括辅助性T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞以及表达嵌合抗原受体的T细胞（CART）。

引言

免疫突触（IS）是一种在发生物理接触的细胞界面处形成的、关键的分子结构，可促进邻近细胞间信息的调控性交换。文献中已描述了多种不同的免疫突触，越来越多的证据表明，这些分子枢纽是细胞网络的一种保守特征。多种免疫细胞，包括B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，均通过形成短暂的接触来交换信息¹。多组学研究正在推动人们对驱动致病性细胞网络、并表达功能未知的表面蛋白的新型白细胞和基质细胞亚群的理解。作为合成性抗原呈递细胞，BSLB可直接用于研究单个蛋白质在T细胞整合激活信号（即抗原和共刺激/共抑制信号）过程中的功能作用，以及由此引发的效应分子颗粒（被称为第四信号）的释放。

本文描述了使用BSLBs模拟模型APC表面组成时所需的实验方案及关键的技术要点。文中提供了对APC表面免疫受体及其他表面蛋白进行定量测量的方案，以及根据这些测定结果重建含生理相关数量蛋白的合成APC的方案。随后介绍了T细胞与BSLB共培养的操作步骤，以及利用流式细胞术对跨突触颗粒转移进行定量检测的方案。尤为突出的是，BSLBs有助于研究一类源自质膜的tSV亚群，即突触外泌体（SEs）。该体系可富集T细胞受体（TCR）⁺) SEs 在 TCR 被激活后释放² 并被BSLBs高效捕获³，是评估抗原激动特性和模拟膜组分的优良读出指标。CD63

方案

1. 采用定量流式细胞术测量细胞表面蛋白密度

1. 准备 0.22 µm- 通过向无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中加入EDTA（终浓度2 mM）和人AB血清（终浓度10%），过滤制备人源流式细胞术缓冲液（hFCB）（见 表1）。使用滤器过滤该溶液 0.22 µm 孔滤器单元以去除血清杂质，并于 4 °C.
2. 回收细胞并通过离心在300 × g下沉淀细胞 × g 室温（RT）下孵育5分钟。
3. 用 PBS 洗涤细胞两次。每次洗涤步骤中，将细胞重悬于 PBS 中至离心前的原始体积，并在 300 × g 下离心沉淀。 × g 室温下孵育5分钟。
4. 用血细胞计数板对台盼蓝染色的细胞悬液进行计数¹¹. 或者，使用电流排斥法进行细胞计数。后者请遵循CASY-TT制造商的说明（参见 材料清单).
   注：CASY-TT 细胞计数仪可用于测定活细胞百分比、细胞大小和细胞体积。
5. 计算含有 1:1,000 稀释度的可固定活力染料 eFluor 780 或类似物（参见 材料表) 用于将细胞重悬至染色浓度 10⁷ 细胞/mL
6. 使用活率染料-....

结果

通过流式细胞术进行细胞表面蛋白质的绝对定量
重建呈现生理配体密度的合成细胞样脂质双层结构（BSLB）需要估算模型细胞亚群上的总蛋白密度。为重建 BSLB，应包含在目标信号通路中可能发挥作用的任何相关配体，以及支持 BSLB 与细胞之间黏附和功能性相互作用的蛋白，例如 ICAM-1 和共刺激分子（如 CD40、CD58 以及 B7 受体 CD80 和 CD86）。根据具体研究问题，还可添加其他蛋白，包括共刺激分子如 ICOSL³、PD-L1 和 PD-L2¹⁵。对于其他分子，可通过定量流式细胞术直接分析细胞来确定其分子密度，进而用于 BSLB 的重建。对于直接偶联抗体，BioLegend 为每一批号抗体提供荧光染料与蛋白（F/P）比值。抗体也可由实验室自行标记，并通过分光光度法测定 F/P 比值，这在缺乏商业化的特定荧光染料偶联抗体时提供了一种替代方案。由于我们使用相同的抗体来校准细胞和 BSLB 表面重组蛋白的数量，因此无需校正抗体结合价态，因其保持恒定。若需确定抗体结合价态，可使用已知 F/P 值的.......

讨论

BSLB 是研究 T 细胞受模拟 APC 膜刺激后颗粒产物的多功能工具。该方法具有高度灵活性，可重构复杂或简化的膜组成，用于研究配体及其信号对 tSV 和大分子攻击颗粒及其组分分泌的影响。我们已在多种 T 细胞上验证了该技术，包括预激活的 TH、CTL、Treg 和 CART¹⁵。本方案同样适用于检测新分离的静息态 T 细胞的突触颗粒释放。使用新分离 T 细胞的一个局限性在于，这些静息态细胞群产生的跨突触颗粒谱型不同，这与其细胞表面组成相关（详见 ¹⁵）。

作为一个简单的流式细胞术检测方案，我们推荐使用抗TCR克隆IP26、抗CD81克隆5A6、抗穿孔素（PRF1）克隆B-D48或抗CD40L克隆24-31，以及含ATTO 390或ATTO 565的脂质（使BSLB具有内在荧光）。为帮助区分单个细胞、单个BSLB以及共轭复合物，我们建议使用抗CD4克隆OKT4和/或抗CD45克隆HI30，尽管这些分子在细胞表面高度表达，但仅以有限程度转移至BSLB上（有关荧光染料及其他已验证抗体的更多细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰基]（镍盐）	Avanti Polar Lipids	790404C-25mg	氯仿中的18:1 DGS-NTA(Ni)
PIPETMAN L 多通道 P8x200L，20-200 µL	Gilson	FA10011
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱	Avanti Polar Lipids	850375C-25mg	18:1 (Δ9-顺式)磷脂酰胆碱（DOPC）的氯仿溶液
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(帽酰生物素)（钠盐）	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	氯仿中的18:1生物素酰化PE
200 µL 黄色吸头 10 x 96 个/盒，堆叠式包装	Starlab	S1111-0206
5 mL 聚苯乙烯圆底管	Falcon®	352052
5.00 ± 0.05 µm 非功能化二氧化硅微珠	Bangs Laboratories Inc.	SS05003
96孔细胞培养板，U型底，带盖，组织培养处理，无热原	Costar®	3799	用于BSLB与细胞的流式细胞术染色及共培养。
96孔细胞培养板，V型底，带盖，组织培养处理，无热原	Costar®	3894	用于悬浮细胞或微珠的流式细胞术染色。
Alexa Fluor 488 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）	赛默飞世尔科技，英吉瑞™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）	Thermo Fisher Scientific，Invitrogen™	A37573 和 A20006
Allegra X-12R 离心机	Beckman Coulter		用于流式细胞术生物样本的管内常规染色
铝箔	任何品牌		用于保护细胞和 BSLB 免受光照
抗人 CD154（CD40L），克隆 24-31	BioLegend	310815 和 310818	Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。
抗人 CD185（CXCR5） Brilliant Violet 711，克隆号 J252D4	BioLegend	356934	用于图1E所示扁桃体细胞的定量流式细胞术分析
抗人 CD19 Brilliant Violet 421，克隆 HIB19	BioLegend	302234	用于图1E中扁桃体细胞的定量流式细胞术分析
抗人 CD2，克隆 RPA-2.10	BioLegend	300202	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD2，克隆 TS1/8	BioLegend	309218	Brilliant Violet 421 偶联物
抗人 CD252（OX40L），克隆 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD28，克隆 CD28.2	eBioscience	16-0289-85	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD317（BST2，PDCA-1），克隆 26F8	赛默飞世尔科技，英潍捷基	53-3179-42	Alexa Fluor 488 偶联物，我们发现该克隆的背景比克隆 RS38E 更干净。
抗人 CD38，克隆 HB-7	BioLegend	356624	Alexa Fluor 700 偶联物
抗人 CD38，克隆 HIT2	BioLegend	303514	Alexa Fluor 647 标记物
抗人 CD39，克隆 A1	BioLegend		使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD4 Brilliant Violet 650，克隆号 OKT4	BioLegend	317436	用于图1E中扁桃体细胞的定量流式细胞术分析
抗人 CD4，克隆 A161A1	BioLegend	357414 和 357421	PerCP/Cyanine5.5 和 Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD4，克隆 OKT4	BioLegend	317414 和 317422	PE/Cy7 和 Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD40，克隆 5C3	BioLegend	334304	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD40，克隆 G28.5	BioLegend		使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记
抗人 CD45，克隆 HI30	BioLegend	304056 和 368516	Alexa Fluor 647 和 APC/Cy7 偶联物
抗人 CD47，克隆号 CC2C6	BioLegend	323118	Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD54（ICAM-1），克隆 HCD54	BioLegend	322702	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD63（LAMP-3），克隆 H5C6	BioLegend	353020 和 353015	PerCP/Cyanine5.5 和 Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD73，克隆 AD2	BioLegend	344002	使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记
抗人 CD80，克隆 2D10	BioLegend	305216	Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD81，克隆 5A6	BioLegend	349512 和 349502	PE/Cy7偶联物分别使用Alexa Fluor 647 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）进行体外标记。
抗人 CD82，克隆 ASL-24	BioLegend	342108	Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD86，克隆 IT2.2	BioLegend	305416	Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD8a，克隆 HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 偶联物
抗人 CD8a，克隆 SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 偶联物
抗人 HLA-A/B/C/E，克隆 w6/32	BioLegend	311414 和 311402	Alexa Fluor 647 偶联物，使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在实验室标记
抗人 HLA-DR，克隆 L243	BioLegend	307656 和 307622	Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。
抗人 ICAM-1，克隆 HCD54	BioLegend	322702	使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记
抗人 ICOS，克隆 C398.4A	BioLegend	313516	Armenian Hamster IgG
抗人 ICOSL，克隆 MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 ICOSL，克隆 MIH12	eBioscience	16-5889-82	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在实验室内部进行标记
抗人 LFA-1，克隆 TS1/22	BioLegend	自行制备	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 OX40，克隆 Ber-ACT35（ACT35）	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 PD-1，克隆 EH12.2H7	BioLegend	135230 和 329902	Alexa Fluor 647 偶联物，使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在实验室标记
抗人 PD-L1，克隆 29E.2A3	BioLegend	329702	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 PD-L2，克隆 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 PD-L2，克隆 MIH18	BioLegend	345502	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 TCRab，克隆 IP26	BioLegend	306712 和 306714	Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。
抗人 CD156c (ADAM10)，克隆 SHM14	BioLegend	352702
抗人 CD317（BST2，Tetherin），克隆 RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 偶联物
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 同型对照，克隆 HTK888	BioLegend	400902	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
BD 细胞仪设置与追踪微球	Becton Dickinson & 公司（BD）	641319	定量流式细胞术前对仪器性能的检测轨迹
BD FACSDiva	Becton Dickinson & 公司（BD）	23-14523-00	采集软件
牛血清白蛋白	默克，Sigma-Aldrich	A3294
CaCl2氯化钙	默克，Sigma-Aldrich	C5670	无水，BioReagent，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 ≥96.0%
牛乳酪蛋白，适用于蛋白激酶底物（脱磷酸化后），纯化粉末	默克，Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	赛默飞世尔科技，Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific，Invitrogen™	12321D	用于去除体积小于 2 mL 的 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28
DynaMag™-15	赛默飞世尔科技，英坦奇™	12301D	用于去除 Dynabeads™ 人源 T 细胞激活剂 CD3/CD28，体积小于 15 mL
胎牛血清，经认证，一次性装	ThermoFisher Scientific，Gibco	A3160801	需在56℃加热灭活30分钟 oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	用于淋巴细胞分离的多糖与二碘异酞酸钠无菌溶液
可固定的活力染料 eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	用于分析过程中排除死细胞
FlowJo	Becton Dickinson & 公司（BD）	版本 10.7.1	分析软件
Grant Bio MPS-1 多板摇床	Keison Products	MPS-1	在染色过程中混合细胞，或在染色或蛋白负载过程中混合 BSLB（作为轨道振荡的替代方法）
HEPES缓冲液（1 M）	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)，4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸	默克，Sigma-Aldrich	H4034	用于配制 HBS/HAS 或 HBS/BSA 缓冲液。BioPerformance Certified， ≥99.5%（滴定），适用于细胞培养
HERACell 150i CO2 孵育箱，150 L，电抛光不锈钢	ThermoFisher Scientific	51026282	用于培养和扩增纯化的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞。
Hula Mixer® 样品混合器	赛默飞世尔科技，生命技术公司	15920D	用于混合BSLB、脂质母液、封闭溶液、蛋白母液以及小规模抗体染色的垂直式可调角度实验室混匀仪。
人血清白蛋白，30% 水溶液	默克，Sigma-Aldrich	12667-M
人源 TruStain FcX Fc 受体阻断液	BioLegend	422302	用于阻断生物相关样本中 Fc 受体的 Fc 受体阻断液
Innovatis CASY 细胞计数器与分析仪 TT	Biovendis Products GmbH		基于电流排斥法对细胞进行计数，并测定细胞大小与体积。
氯化钾，KCl	默克，Sigma-Aldrich	P5405	粉末，BioReagent，适用于细胞培养
L-谷氨酰胺 200 mM (100倍浓缩液)	ThermoFisher Scientific，Gibco	25030-024
MgCl2氯化镁	默克，Sigma-Aldrich	M2393	生物试剂，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养
适用于 24 个 1.5/2.0 mL 离心管的微型管插件	Keison Products	P-2-24	Grant Bio MPS-1 多孔板摇床用微量管插件
微型孵育器	Labnet International	I5110A-230V	在无 CO 的条件下孵育（共培养）BSLB 与细胞2
最低必需培养基非必需氨基酸	赛默飞世尔科技，吉布科	11140-035
小鼠IgG多克隆抗体对照	默克，Sigma-Aldrich	PP54	用作小鼠 IgG 捕获珠标准品上结合抗体检测的阳性对照
小鼠 IgG1，κ 同种型，克隆 MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 和 400170	Alexa Fluor 488、PE、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、APC/Cyanine7 和 Brilliant Violet 785  分别形成共轭物。
小鼠 IgG1, k 同种型，克隆 X40	Becton Dickinson & 公司（BD），Horizon	562438	BV421偶联物
小鼠 IgG1 κ 同型对照，克隆号 P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记
小鼠 IgG2a, k 同种型，克隆 MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 偶联物
小鼠 IgG2b, k 同种型，克隆 MPC-11	BioLegend	400330 和 400355	Alexa Fluor 647 和 Brilliant Violet 785 偶联物
多孔 6 孔组织培养板，经真空气体等离子体处理	Falcon	353046	用于培养和扩增纯化的 CD4+ 和 CD8+ T细胞
Na2HPO4磷酸氢二钠	默克，Sigma-Aldrich	S7907
NaCl，氯化钠	默克，Sigma-Aldrich	S5886	生物试剂，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 ≥99%
NiSO4硫酸镍(II)	默克，Sigma-Aldrich	656895	用于饱和 NTA 位点；在封闭过程中加入
青霉素链霉素 [+]10,000 单位青霉素；[+] 10,000 µg/mL 链霉素	ThermoFisher Scientific，Gibco	15140-122
磷酸盐缓冲液，pH 7.4，无菌	ThermoFisher Scientific，Gibco	10010	无 Ca2+ 或 Mg2+ 添加
聚醚砜（PES）滤器单元	赛默飞世尔科技 Nalgene	UY-06730-43	低蛋白吸附的亲水性聚醚砜（PES）膜有助于过滤高蛋白含量的溶液
PURESHIELD 氩气 ISO 14175-I1-Ar	BOC有限公司	11-Y	为保护储存于 +4 ℃ 的脂质储备液 ºC.
纯化的链霉亲和素	BioLegend	280302
量子 Alexa Fluor 488 MESF 微球	Bangs Laboratories Inc.	488	用于插值测定细胞和/或BSLB结合的Alexa Fluor 488分子数的基准微球
量子 Alexa Fluor 647 MESF 微球	Bangs Laboratories Inc.	647	用于插值细胞和/或BSLB结合的Alexa Fluor 647分子的基准微球
大鼠抗小鼠 IgG κ轻链，克隆株 OX-20	赛默飞世尔科技，英维特罗根	SA1-25258	使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
重组人 IL-2	Peprotech	200-02-1MG
RPMI 1640 培养基（1×）；不含 L-谷氨酰胺	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
人类B细胞富集鸡尾酒混合液	STEMCELL Technologies	15064	分离B细胞以测定纯化细胞群体中蛋白质的密度
Rosette 人 CD4+ T 细胞富集试剂盒	STEMCELL Technologies	15022C.1
罗塞特人 CD4+CD127low T 细胞富集混合液	STEMCELL Technologies	15361	CD4+ CD127 预富集低 用于通过FACS下游分离Treg的T细胞。
Rosette 人 CD8+ T 细胞富集混合液	STEMCELL Technologies	15063
RPMI 1640 培养基（1×）；不含酚红	ThermoFisher Scientific，Gibco	11835-063	在无 CO 的条件下孵育（共培养）BSLB 与细胞2酚红-free 培养基可降低细胞在流式细胞术和显微镜检测中的自发荧光。
丙酮酸钠（100 mM）	ThermoFisher Scientific，Gibco	11360-070
Sprout迷你离心机	FisherScientific，Heathrow Scientific LLC	120301	用于在1.5 mL Eppendorf管中洗涤二氧化硅微珠和BSLB的台式微量离心机。
无菌带盖 5 mL 聚苯乙烯圆底试管	Falcon	352058
UltraComp eBeads 补偿微球	ThermoFisher Scientific，invitrogen	01-2222-42
Zeba 脱盐柱，7K MWCO	赛默飞世尔科技，英坦科技™	89882