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方法文章

制备用于研究T细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层

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DOI：

10.3791/63130

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2022年4月1日

 , 
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

本文内容

摘要

本文介绍了使用脂质双层支撑微球逐步重建合成抗原呈递细胞的方案，以及利用该系统检测活化T细胞突触输出的方法。

摘要

抗原提呈细胞（APC）通过与T细胞的直接接触传递三种活化信号：1）抗原，2）共刺激/共抑制信号，3）可溶性细胞因子。T细胞在活化后会释放两种效应颗粒：跨突触囊泡（tSVs）和超分子攻击颗粒，分别用于传递细胞间信使并介导细胞毒性作用。这些颗粒会被与T细胞直接接触的抗原提呈细胞迅速内化，导致其表征极为困难。本文介绍了构建和使用珠支持的脂双层（BSLB）作为抗原提呈细胞（APC）模拟物以捕获和分析这些跨突触颗粒的实验方案。同时描述了细胞表面蛋白密度的绝对定量方法、以生理相关水平重建BSLB的技术，以及通过流式细胞术追踪T细胞突触颗粒释放的流程。该方案可进一步拓展用于研究单个蛋白、复杂配体混合物、病原体毒力因子以及药物对各类T细胞效应输出的影响，包括辅助性T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞以及表达嵌合抗原受体的T细胞（CART）。

引言

免疫突触（IS）是一种在发生物理接触的细胞界面处形成的、关键的分子结构，可促进邻近细胞间信息的调控性交换。文献中已描述了多种不同的免疫突触，越来越多的证据表明，这些分子枢纽是细胞网络的一种保守特征。多种免疫细胞，包括B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，均通过形成短暂的接触来交换信息1。多组学研究正在推动人们对驱动致病性细胞网络、并表达功能未知的表面蛋白的新型白细胞和基质细胞亚群的理解。作为合成性抗原呈递细胞，BSLB可直接用于研究单个蛋白质在T细胞整合激活信号（即抗原和共刺激/共抑制信号）过程中的功能作用，以及由此引发的效应分子颗粒（被称为第四信号）的释放。

本文描述了使用BSLBs模拟模型APC表面组成时所需的实验方案及关键的技术要点。文中提供了对APC表面免疫受体及其他表面蛋白进行定量测量的方案，以及根据这些测定结果重建含生理相关数量蛋白的合成APC的方案。随后介绍了T细胞与BSLB共培养的操作步骤，以及利用流式细胞术对跨突触颗粒转移进行定量检测的方案。尤为突出的是，BSLBs有助于研究一类源自质膜的tSV亚群，即突触外泌体（SEs）。该体系可富集T细胞受体（TCR）+) SEs 在 TCR 被激活后释放2 并被BSLBs高效捕获3，是评估抗原激动特性和模拟膜组分的优良读出指标。CD63+ 活化T细胞还会释放外泌体和超分子攻击颗粒（SMAPs），这些颗粒可被BSLBs捕获。它们可作为T细胞活化以及随之发生的胞吐和溶解性颗粒分泌的额外检测指标。胞吐囊泡向T细胞相互作用极的动员也有助于细胞因子（如IL-2、IFN-）的方向性释放γ，以及在激活后产生的IL-104,5,6,7,8尽管T细胞释放的细胞因子也可在BSLBs上被检测到，但目前正开发一项更为专门的研究，以验证免疫突触处细胞因子释放的定量分析。

要探究特定膜组分如何影响T细胞的突触输出，首先需要明确目标膜组分的生理密度。基于流式细胞术的细胞表面蛋白定量是本方案中的关键步骤，其实现需要满足两个条件：1）使用已知每抗体所标记荧光染料分子数（F/P）的抗体；2）采用标准微球作为参照，以便根据测得的平均荧光强度（MFIs）插值推算荧光染料分子的数量。

这些基准标准包含五种微球群体，每种微球含有逐渐增加的等效可溶性荧光染料分子数（MESF），覆盖了任意荧光检测的动态范围。这些标准微球群体可产生离散的荧光峰，通过简单的线性回归即可将任意荧光单位转换为MESF。所得MESF值随后与抗体的F/P值结合使用，用于计算每个细胞（或后续步骤中的BSLB）上结合分子的平均数量。将检测到的分子平均数与估计的细胞表面积相结合，即可计算出以分子/µm2表示的生理密度。该定量方案也可适用于T细胞表面蛋白密度的测量，以及介导同型T细胞突触（即T-T突触9）形成的膜组分的生化重建。如有需要，还可通过使用每分子标记已知数量荧光染料的重组靶标来进一步估算抗体结合的价态。随后，通过同时比较结合的荧光蛋白数量与定量抗体的数量（使用两种不同的定量荧光染料和MESF标准），即可计算同一BSLB群体中抗体结合的价态。

重建抗原呈递细胞（APC）膜需要在二氧化硅微珠上组装支撑脂双层（SLB）1。可通过含有不同磷脂种类的脂质体储备液构建多功能的脂双层基质，从而实现利用不同结合化学性质的重组蛋白进行锚定（脂质体的制备详见10）。一旦确定了相关配体在细胞表面的生理密度（或多种密度），即可采用相同的流式细胞术方案来估算为支撑脂双层（BSLB）包被目标生理密度所需重组蛋白的浓度。可单独或联合使用两种不同的锚定系统。

首先，含有终浓度为 12.5 mol% 的 Ni2+-结合磷脂的 SLB 足以为每平方微米提供约 10,000 个 His 标签结合位点10，该体系可有效将市售蛋白修饰至 BSLB 上，前提是这些蛋白的生理密度不超过此最大负载容量。第二种负载系统利用含生物素的磷脂（以 mol% 计）通过链霉亲和素桥接，负载生物素化的抗 CD3e Fab（或 HLA/MHC 单体）。结合这两种 BSLB 修饰方法，可灵活定制作为合成 APC 的 BSLB。对于高度复杂的 APC 表面组成，可通过提高磷脂的 mol% 及蛋白浓度，以负载满足特定研究问题所需的多种蛋白。一旦确定了蛋白的工作浓度和生物素化磷脂的 mol% 比例，即可构建 BSLB，用于通过多参数流式细胞术检测 T 细胞的突触输出。

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方案

1. 采用定量流式细胞术测量细胞表面蛋白密度

  1. 准备 0.22 µm- 通过向无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中加入EDTA（终浓度2 mM）和人AB血清（终浓度10%），过滤制备人源流式细胞术缓冲液（hFCB）（见 表1）。使用滤器过滤该溶液 0.22 µm 孔滤器单元以去除血清杂质，并于 4 °C.
  2. 回收细胞并通过离心在300 × g下沉淀细胞 × g 室温（RT）下孵育5分钟。
  3. 用 PBS 洗涤细胞两次。每次洗涤步骤中，将细胞重悬于 PBS 中至离心前的原始体积，并在 300 × g 下离心沉淀。 × g 室温下孵育5分钟。
  4. 用血细胞计数板对台盼蓝染色的细胞悬液进行计数11. 或者，使用电流排斥法进行细胞计数。后者请遵循CASY-TT制造商的说明（参见 材料清单).
    注：CASY-TT 细胞计数仪可用于测定活细胞百分比、细胞大小和细胞体积。
  5. 计算含有 1:1,000 稀释度的可固定活力染料 eFluor 780 或类似物（参见 材料表) 用于将细胞重悬至染色浓度 107 细胞/mL
  6. 使用活率染料-PBS溶液重悬细胞，并在冰上孵育30分钟。
  7. 加入一倍体积的冰冻 hFCB 以去除活率染料。在 300 × g 条件下离心沉淀细胞 × g 5 分钟 4 °C.
    注意：从此刻起，须始终保持冷链不断。
  8. 用含1:50稀释的Fc受体阻断溶液的hFCB洗涤细胞（参见 材料清单). 将体积调整至终浓度为 107 细胞/mL，继续孵育15分钟，以实现高效的FcγR阻断。
  9. 分配 100 µL 细胞悬液的（即106 每孔加入细胞至96孔U型或V型底板中。将细胞置于冰上，并避光保存（用铝箔覆盖）。
  10. 在 hFCB 中配制抗体主混合液，确定每种荧光染料标记抗体的最佳浓度，尤其是用于测定表面蛋白密度的抗体浓度。例如，如图所示，对扁桃体细胞群体上 ICAM-1 表达量进行定量时， 图1，配制混合液，其中包含1:200稀释的抗-CD4、抗-CD19和抗-CXCR5抗体，以及含已知数量AF647荧光染料的抗-ICAM-1抗体的饱和浓度（即 10 µg/mL（由独立的抗体滴定实验确定）。
  11. 作为额外的对照，准备含有相关抗体的混合液 抗体同型对照（与其对应的、偶联相同荧光染料的抗体具有相同的有效浓度） 用于背景扣除），即使用 10 µg/mL 相关AF647同型对照
    注意：在上述示例中，此类同型对照用于从细胞上真实的 ICAM-1 信号中扣除背景荧光。
  12. 在对组织内低频细胞亚群的蛋白密度进行定量时，应制备荧光减一对照（fluorescence minus one, FMO），该对照包含除目标标记物外的所有染色抗体（详见下文 12).
  13. 离心含有细胞的96孔板，300 × g × g 5 分钟 4 °C，弃去上清液，并将细胞重悬于 50 µL 定量抗体主混合液或同型对照抗体主混合液
  14. 将细胞孵育至少 30 分钟 4 °C 并以 400 rpm 使用板式摇床振荡。避免光照（用铝箔覆盖）。
  15. 用 hFCB 洗涤细胞三次，300 × g 离心 × g 5分钟 4 °C.
  16. 用重悬细胞沉淀 200 µL PBS（即终浓度为5 × 106 细胞/毫升
  17. 用于采集：
    1. 如果使用标准的 BD FACS 上样仪，将样品转移至 5 mL 聚苯乙烯圆底管中（参见 材料表).
    2. 若使用高通量筛选仪（HTS，也称为酶标仪），请立即进入步骤 1.19。
  18. 在进行MESF标准品的数据采集之前，需检查定量通道的荧光强度线性范围的最大值和最小值。
  19. 补偿前，获取MESF标准品的数据，确保最暗和最亮的群体均落在测量的线性范围内。
  20. 获取补偿样本。保持用于定量通道的光电倍增管（PMT）电压值不变，以维持检测的动态范围。在计算补偿矩阵前，对其他通道的PMT电压进行轻微调整。
  21. 计算并应用补偿。
  22. 至少获取并保存 2 个 × 104 每个定量通道的总MESF微球。
  23. 根据侧向和前向光散射面积（SSC-A 和 FSC-A，如图所示）选择单细胞群体 图1A （i）），随后选择时间连续区间内的事件（图 1A （ii）与高度相比，FSC 和 SSC 的飞行时间（W）均较低（即 FSC-W/FSC-H，随后进行 SSC-W/SSC-H 设门，如图所示） 图1A （iii）和（iv），分别）。定义一个最终的单事件门，包含前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）呈比例分布的事件图1A (v)。
  24. 获取对照样本（同型对照标记样本和FMO对照）。
  25. 获取样本并持续记录，直至获得至少 10,000 个目标细胞。
    注意：准确测定平均分子密度需要在独立实验中分析多个供体样本。当分析频率较低的细胞亚群或来源于有限生物材料（例如人体组织活检样本）的细胞时，这一点尤为关键。
  26. 关闭仪器前，先用流式细胞仪清洗液冲洗流式细胞仪运行 5 分钟，再用超纯水冲洗 5 分钟。若使用高通量筛选系统（HTS），请按照选项卡下的相应选项操作 高通量筛选与洁净板程序.
    注意：为减少样品间的残留，需激活 坐（采样器）齐平 或 高通量采样器清洗 选项，可在管或孔之间自动清洗流式细胞仪。在开始采集之前，以高流速运行超纯水 10 分钟，以清除流式细胞仪样品管路中残留的未洗净生物污染物。
  27. 导出流式细胞术标准（FCS）文件。

2. MESF 校正过度的平均值（或中位数）荧光强度（MFI）回归分析

  1. 打开流式细胞分析软件并加载实验的 FCS 文件。根据侧向散射和前向散射面积（SSC-A 与 FSC-A）选择微珠群体，如 图 1A (i) 所示。
  2. 通过检查事件在时间上的单峰分布情况来控制数据质量，如步骤 1.24 所示。
    注意：气泡会导致事件在时间分布上出现间隙；这通常在使用高通量筛选（HTS）进行采集的初期出现。应避免选择采集时间中间隙附近的事件，因为这些事件会因光学畸变而引入测量误差。
  3. 聚焦于单个事件。
    1. 细胞
      1. 首先根据 SSC-A 和 FSC-A 分布识别单个细胞（图 1A (i)），然后通过 FSC-W/FSC-H 上的低信号事件（单峰-1，图 1A 图 (iii)）和 SSC-W/SSC-H 上的低信号事件（单峰-2；图 1A 图 (iv)）进一步筛选。通过选择 FSC-A 与 FSC-H 成比例的事件定义额外的单峰-3 门控（图 1A，图 (v)）。最后，将未被可固定的活率染料标记的细胞识别为活细胞。
    2. MESF 微珠
      1. 按照步骤 2.3.1.1 中相同的单峰-1 至单峰-3 鉴别方法进行（图 1B，图 (i) 至 (v)）。根据各微珠群体的荧光强度水平识别每个 MESF 群体（空白、1、2、3 和 4）（见 图 1B，图 (vi)）。
  4. 提取 MESF 各组分（空白及 1 至 4）的平均荧光强度（MFI）。
  5. 通过从每组分的 MFI 中减去空白微珠群体的 MFI，计算得到校正后的 MFI（cMFI）值。
  6. 根据 cMFI 与供应商提供的 MESF 值之间的关系（自变量，其中空白组分为零）拟合最佳直线。
  7. 提取 MESF 对 cMFI 线性回归的斜率（下文方程中的 b）（图 1B 图 (viii) 显示回归曲线 y = a + bx，其中 a = 0）。
  8. 从目标细胞群体中提取荧光强度的中位数（适用于双峰分布）或均值（适用于正态或对数正态分布）（如 图 1A 图 (vii) 中的 TFH 细胞和 B 细胞）。
  9. 如同步骤 2.5–2.7，提取同型对照标记细胞的 MFI 值。
  10. 若同型对照抗体的荧光标记比（F/P）与定量抗体相同，则通过减去同型标记细胞的 MFI 来校正染色细胞的 MFI。
  11. 若同型对照抗体的 F/P 与定量抗体不同，则通过将同型标记细胞的 MFI 除以步骤 2.7 中计算得到的斜率，获得同型对照的 MESF 值。在估算结合的定量抗体数量前，需从定量抗体的 MESF 中减去同型对照的 MESF。
  12. 将 MESF 除以定量抗体的 F/P，以估算每个细胞结合的分子数（Molec.cell ，如 图 1C 的流程图所示）。
  13. 将结合分子数除以估计的细胞表面积（CSA (µm2)），以获得蛋白密度（单位：molec./µm2）（图 1C）。更多细节请参见代表性结果部分。

3. 用于校准包被 BSLB 蛋白质的功能性磷脂种类

  1. 使用 0.4 mM 的DOPC （1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）作为形成支撑脂双层的脂质基质的主要组分。将所有其他种类的脂质稀释于该 DOPC 溶液中。
  2. 使用 0.2 至 1 mol% 的 0.4 mM DOPE （1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺），该脂质偶联有包括 ATTO 390、488 或 565 在内的荧光染料（参见材料表），以制备具有内在荧光的 BSLB。
    注意：BSLB 的内在荧光有助于在突触传递实验中识别单个 BSLB 和单个细胞。
  3. 使用 12.5 mol% 的 0.4 mM DGS-NTA(Ni)（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰]）来锚定带 His 标签的蛋白质。保持 DGS-NTA(Ni) 的摩尔百分比恒定，并从 100 nM 的最高浓度开始，对带 His 标签的蛋白质进行两倍梯度稀释。设置一个不含蛋白质的条件作为绝对定量的阴性对照。
    注意：共刺激信号和黏附分子（如 ICAM-1）设计为带有 12-His 标签，以增强蛋白质与 DGS-NTA(Ni) 的亲和力。
  4. 使用Biotinyl Cap PE（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(帽状生物素)）通过生物素-链霉亲和素-生物素桥接方式锚定生物素化蛋白质。使用 0.4 mM Biotinyl Cap PE 进行五倍系列梯度稀释，覆盖 10 mol% 至 0 mol%（后者作为阴性对照）。在标准校准实验以及用于突触传递实验的人工 APC 重建过程中，保持链霉亲和素和生物素化蛋白质的浓度恒定（均为 200 nM）。
    注意：对生物素化蛋白质的实测密度相对于脂质基质中 Biotinyl Cap PE 的最终摩尔百分比（该基质同时含有用于锚定 His 标签蛋白的 DGS-NTA(Ni)）进行回归分析，将确定用于重建目标抗原密度所需的摩尔百分比。

4. 制备含1%血清白蛋白的补充型HEPES缓冲盐溶液

注意：在 BSLB 的洗涤和蛋白质加载步骤中，需要补充了 1% 人血清白蛋白（HBS/HSA）或 1% 牛血清白蛋白（HBS/BSA）的 HEPES 缓冲盐水（表 1）。请尽可能新鲜地配制 10 倍浓度的 HBS 储存液和工作缓冲液；储存于冰箱中，并在一个月内使用完毕。尽管 BSA 比 HSA 成本更低，但它能有效封闭镍螯合脂质13，因此推荐用于高通量实验。

  1. 配制含添加剂的HBS 10倍浓缩缓冲液，其中包含200 mM HEPES、7 mM Na2HPO4、1400 mM NaCl、50 mM KCl、60 mM 葡萄糖、10 mM CaCl2 和 20 mM MgCl2。
    注意：MgCl2 溶解过程高度放热，存在烫伤风险。应缓慢加入，并置于大量溶剂中溶解。避免配制这些盐类的高浓度溶液（例如1 M），因为它们随时间推移容易析出沉淀，导致向工作缓冲液中精确添加变得困难。
  2. 使用0.22 µm滤器对10倍浓缩液进行过滤，并在4 °C下保持无菌保存。
  3. 配制500 mL HBS/has时，取50 mL含添加剂的10倍HBS溶液，必要时将pH调节至7.4，并用超纯水定容至483.4 mL。
  4. 向483.4 mL pH 7.4的HBS中加入16.6 mL 30% HSA溶液。
  5. 配制500 mL HBS/BSA时，将5 g BSA溶解于HBS中，在37 °C孵育30分钟，然后通过定期倒置瓶体在室温下轻柔混匀，直至无可见的蛋白质晶体或团块。
  6. 使用0.22 µm滤器单元（见材料表）过滤第4.5步所得溶液，并在4 °C下储存。

5. BSLB 上的蛋白质密度校准

  1. 取用 5.00 ±0.05 µm 直径的非功能化二氧化硅微球前，需充分混匀储存液，并重新悬浮烧瓶底部沉积的大团微球。
    注意：二氧化硅微球易快速沉降，可能导致计数误差。应使用 P1000 移液器吸取最大体积的一半，反复吹打以充分混匀。
  2. 将 1 µL 微球溶液稀释至 1,000 µL PBS 中，使用血细胞计数板计数微球数量，并计算每毫升的微球浓度。
    注意：无需使用台盼蓝染色来观察二氧化硅微球。
  3. 计算滴定实验每个浓度点所需用于制备最终 5 × 105 个 BSLB 的二氧化硅微球体积 。
  4. 将所需体积的二氧化硅微球转移至无菌 1.5 mL 微离心管中。
  5. 用 1 mL 无菌 PBS 洗涤二氧化硅微球三次，于室温下在台式微量离心机中以固定转速离心 15 秒。
    注意：移除洗涤液时避免扰动微球沉淀。残留少量缓冲液不会影响脂质体母液的铺展，因为脂质体母液也处于 PBS 中。
  6. 准备三倍体积的脂质体母液，用于在洗涤后的二氧化硅微球上组装 BSLB（例如，若二氧化硅微球初始总体积为 20 µL，则至少准备 60 µL 脂质体母液）。
  7. 用于 Biotinyl Cap PE mol% 滴定
    1. 配制含有 Biotinyl Cap PE 五倍稀释系列的脂质母液。
      1. 将 0.4 mM Biotinyl Cap PE mol% 稀释于 100% DOPC 基质中。
      2. 将各 Biotinyl Cap PE mol% 滴定浓度点与 0.4 mM 25% DGS-NTA(Ni) 溶液按 1:1（体积比）混合，使所有滴定体系中 Ni 含量脂质的终浓度为 12.5 mol%。
        注意：12.5 mol%（体积比）的含 Ni 脂质代表 BSLB 的混合脂质组成，可用于并行校准 His 标签蛋白。例如，由于所有脂质体储备液均以相同摩尔浓度配制，为在 200 µL 终体积脂质体混合液中达到目标 mol% 混合比例，只需将 100 µL 25 mol% 含 Ni DGS-NTA 与 100 µL 100 mol% DOPC 混合即可。
    2. 将 5 × 105 个洗涤后的二氧化硅微球分别转移至 1.5 mL 微离心管中，每管组装一个 Biotinyl Cap PE mol% 滴定浓度点。
    3. 将 Biotinyl Cap PE mol% 滴定脂质母液加入洗涤后的二氧化硅微球中，通过反复吹打总体积的一半轻轻混匀。避免产生气泡，过量气泡会破坏脂双层。
    4. 向含有正在形成的 BSLB 的管中通入氩气（或氮气），以置换空气，防止混合过程中脂质氧化。
    5. 储存前向 0.4 mM 脂质储备液中通入氩气，并采用无菌操作技术处理。
      注意：将一根细管连接至氩气/氮气钢瓶。通气前调节钢瓶减压阀，使压力不超过 2 psi。将无菌移液器吸头连接至输出管末端，将气流导入脂质体储备液中持续 5 秒，然后迅速盖紧管盖。对于脂质储备液，储存前还需用石蜡膜密封管盖，并于 4 °C 保存。
    6. 将 BSLB 置于垂直可调角度实验室混合器（见材料表）中，在室温下以 10 rpm 轨道混合 30 分钟。
      注意：此步骤可防止支持脂双层形成过程中微球沉降。
    7. 在台式微量离心机中于室温离心 15 秒使微球沉淀，然后用 1 mL HBS/HSA（BSA）洗涤三次，以去除过量脂质体。
    8. 通过加入 1 mL 含 100 µM NiSO4 的 5% 酪蛋白或 5% BSA 溶液封闭已形成的 BSLB，以饱和 NTA 位点，并加入 200 nM 链霉亲和素以均匀包被 BSLB 上所有生物素锚定位点。通过反复吹打总体积的一半轻轻混匀，并在垂直混合器中于室温、10 rpm 条件下孵育不超过 20 分钟。
    9. 在台式微量离心机中于室温离心 15 秒使 BSLB 沉淀，然后用 1 mL HBS/HSA（BSA）缓冲液洗涤三次。
      注意：洗涤后将微球垂直放置，保留少量洗涤缓冲液覆盖 BSLB。避免 BSLB 脱水，因暴露于空气中会破坏脂双层。
  8. 用于在含 12.5 mol% DGS-(Ni) NTA 的 BSLB 上滴定 His 标签蛋白
    1. 配制三倍体积的脂质体母液，其中含终浓度为 12.5 mol% 的 DGS-NTA(Ni)。
    2. 用该脂质体母液重悬洗涤后的二氧化硅微球，并通过反复吹打总体积的一半轻轻混匀。避免产生气泡，过量气泡会破坏脂双层。
    3. 向含有正在形成的 BSLB 的管中通入氩气（或氮气），以置换空气，防止混合过程中脂质氧化。
    4. 储存前向 0.4 mM 脂质储备液中通入氩气，并采用无菌操作技术处理。
    5. 将 BSLB 转移至垂直混合器中，在室温下以 10 rpm 轨道混合 30 分钟。
    6. 在台式微量离心机中于室温离心 15 秒使微球沉淀，然后用 1 mL HBS/HSA（BSA）缓冲液洗涤三次，以去除过量脂质体。
    7. 通过加入 1 mL 含 100 µM NiSO4 的 5% 酪蛋白（或 5% BSA）溶液封闭已形成的 BSLB，以饱和 BSLB 上的 NTA 位点。轻轻混匀，并在垂直混合器中于室温、10 rpm 条件下孵育不超过 20 分钟。
    8. 用 HBS/HSA（BSA）缓冲液洗涤三次，以去除过量封闭液。
    9. 在新的 U 型底 96 孔板中配制蛋白的 2 倍系列稀释液。
      1. 将目标蛋白以 100 nM 起始浓度溶于 200 µL HBS/HSA（BSA）缓冲液中，取 100 µL 加入第一列孔中，剩余 100 µL 加入含 100 µL HBS/HSA（BSA）缓冲液的第 2 列孔上方。
      2. 从第 2 列向第 3 列依次转移 100 µL，依此类推，覆盖所有滴定浓度点。最后一列不加蛋白，作为空白对照用于定量。
    10. 将制备好的 BSLB 重悬于一定体积的 HBS/HSA（BSA）缓冲液中，使每 100 µL 含 5 × 105 个 BSLB。
    11. 将 100 µL BSLB 悬液转移至第二个 U 型底 96 孔板的各孔中，使每孔含 5 × 105 个 BSLB。
    12. 将含 BSLB 的第二块板在室温下以 300 × g 离心 2 分钟，弃去上清液。
    13. 将蛋白滴定板中的 100 µL 溶液转移至含沉淀 BSLB 的孔板中。轻轻混匀，移液时避免产生过多气泡，并在避光条件下于室温、1,000 rpm 条件下使用板式振荡器孵育 30 分钟。
    14. 用 HBS/HSA（BSA）缓冲液洗涤板三次，每次在室温下以 300 × g 离心 2 分钟。
    15. 若校准中使用的重组蛋白直接偶联荧光染料且具有已知的 F/P 值，则继续进行步骤 5.8.20。
    16. 若校准中使用的重组蛋白未标记或偶联荧光染料，或无 MESF 微球标准品，则使用具有已知 F/P 值的 Alexa Fluor 488 或 647 偶联抗体染色蛋白包被的 BSLB。
    17. 使用饱和浓度的定量抗体进行染色。
      注意：根据目标表达水平，抗体浓度通常在 5 至 10 µg/mL 之间。
    18. 在室温、1,000 rpm 条件下使用板式振荡器染色 30 分钟。使用铝箔避光。
    19. 用 HBS/HSA（BSA）缓冲液洗涤两次，再用 PBS 洗涤一次，每次在室温下以 300 × g 离心 2 分钟。
      注意：采集前用 pH 7.4 的 PBS 重悬洗涤后的 BSLB。不要使用含蛋白的缓冲液，因其会导致高通量进样器自动混样时产生气泡。
    20. 采集 MESF 标准品，确保最亮峰仍处于定量检测器（通道）的线性检测范围内，如图 1B（vii）所示。
    21. 手动或使用高通量筛选（HTS）系统采集样本。若使用后者，将 BSLB 重悬于 100 µL PBS 中，以 2.5–3.0 µL/s 的流速采集 80 µL，混合体积为 100 µL（或若重悬体积较小则为总体积的 50%），混合速度为 150 µL/s，混合 5 次，以确保 BSLB 单分散。
    22. 导出 FCS 文件。
    23. 分析时聚焦于单个事件（图 2A），因双联体或三联体会引入定量误差。按步骤 1.2.3 中所述采用嵌套法识别单个事件。
    24. 测定各 MESF 组分（1–4）的 MFI，并减去空白微球的 MFI，得到校正 MFI（cMFI）。
    25. 进行线性回归分析，提取 MESF 标准品 cMFI 与 MESF 之间的斜率（b），该值将在步骤 5.33 中使用。
    26. 提取各滴定浓度点的 MFI，并减去无蛋白微球的 MFI，得到 cMFI。
    27. 将 cMFI 除以步骤 5.31 计算的斜率，得到各滴定浓度点结合于 BSLB 的 MESF 值。
    28. 将结合于 BSLB 的 MESF 值除以定量抗体的 F/P 值，得到每个 BSLB 上平均结合的分子数。
    29. 根据 BSLB 的直径（5.00 ± 0.05 µm），计算微球表面积（SA = 4πr2），进而计算各滴定浓度点（蛋白浓度）的蛋白最终密度（分子数/µm2）。
    30. 对蛋白浓度与蛋白密度进行新的回归分析，计算最佳拟合直线的斜率（b）。
      注意：12.5 mol% DGS-NTA(Ni) 的浓度赋予 BSLB 约 10,000 分子数/µm2 的最大锚定容量10，且不会诱导 T 细胞非特异性活化或影响 SLB 的侧向流动性。

6. T细胞与BSLB之间突触转移实验的操作

  1. 在进行突触传递实验之前
    1. 获取非荧光 BSLB、含荧光脂质的 BSLB 以及未染色细胞（或补偿微球；参见 材料清单），以及单色染色细胞（或补偿微珠），以识别仪器的荧光光谱相互干扰。应重点关注那些存在显著溢出（spillover）的检测器，重新设计多色检测面板，提高检测灵敏度，并降低关键检测器上的测量误差（参见 14).
    2. 滴定检测抗体以确定最佳浓度，确保能够检测到阳性信号，同时不影响阴性信号的检测。
      注意：每当抗体批次更换时，需重复此步骤，因为不同批次的 F/P 值和荧光亮度存在差异。
    3. 可选：通过在不同电压范围（即电压梯度扫描）下采集样本，优化光电倍增管（PMT）电压，以找到信噪比最佳（即阴性与阳性信号分离良好，同时确保最亮细胞群的信号处于线性范围）的PMT设置。
  2. T细胞输出物质向BSLBs转移的测量
    1. 制备添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI 1640完全培养基（以下简称R10培养基）， 100 µM 非必需氨基酸，10 mM HEPES，2 mM L-谷氨酰胺，1 mM 丙酮酸钠，100 U/ml 青霉素，以及 100 µg/mL 链霉素。使用 R10 培养基培养和扩增 T 细胞。
    2. 在 第1天，从外周血或白细胞减少系统（LRS）滤器中分离T细胞。使用免疫密度细胞分离与纯化试剂盒（参见 材料表用于人CD4的富集+ 和 CD8+ T细胞
    3. 以终浓度 1.5 至 2.0 接种细胞 × 106 细胞/mL，使用6孔板，每孔总体积不超过5 mL。
    4. 使用人 T 细胞激活（抗 CD3/抗 CD28）磁珠以 1:1 的比例激活 T 细胞（参见 材料清单加入100 IU重组人IL-2以支持细胞增殖与存活。
    5. 在 第3天，使用磁性柱去除活化用磁珠（参见 材料表确保在回收细胞进行后续洗涤步骤前，磁珠仍附着在管壁上。
    6. 用 5 mL 新鲜 R10 培养基再次洗涤磁珠，充分混匀，并将其放回磁力架中。回收此体积的液体，与步骤 6.2.5 中回收的细胞混合。
    7. 将细胞重悬至 1.5–2 × 106 细胞/mL，加入含100 U/mL IL-2的新鲜R10培养基中。48小时后更换培养基，确保在实验当天前48小时为最后一次添加IL-2（培养第7至14天）。
    8. 在突触传递实验当天，准备 突触传递实验培养基 （参见 表 1通过在不含酚红的 RPMI 1640 培养基中添加 10% FBS 配制 100 µM 非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、100 U/ml 青霉素，以及 100 µg/mL 链霉素。不要加入重组人 IL-2。
    9. 使用台盼蓝染色法或电流排斥法计数细胞，并将细胞重悬至终浓度为 2.5 × 106 细胞/mL 培养基中。若观察到细胞死亡过多（>10%），使用多糖和泛影酸钠混合物去除死亡/濒死细胞（参见 材料清单如下所示：
      1. 在13 mL多糖-泛影酸钠溶液上方铺加15 mL细胞培养液。
      2. 离心 1,250 × g 在室温下以最小加速度和减速度离心20分钟。收集培养基与多糖-碘克沙酸钠溶液界面处的细胞层（云状）。
      3. 用预热的突触传递实验培养基（按步骤 6.2.7 制备）至少洗涤细胞两次。
      4. 计数并重悬细胞，使其终浓度为 2.5 × 106/mL，使用突触传递实验培养基。共培养 100 µL 将该细胞悬液与BSLBs混合（参见步骤6.2.15）。
    10. 计算实验所需的 BSLB 数量；需考虑所有不同的蛋白质主混合物以及待测试的抗原梯度（包括生物素化 HLA/MHC-肽单体或单生物素化抗-CD3）ε Fab
    11. 按照第5节方案的相同步骤组装BSLBs，但此次合并所有用于重建复杂APC膜所需的蛋白质和脂质滴定组分图3A)。在校准过程中，初始二氧化硅微珠体积与所用蛋白混合物体积之间的体积比关系，以及BSLBs负载过程中的时间和温度，均需保持一致。例如，如果 0.5 µL 每孔二氧化硅微珠的数量 100 µL/well 用于初始校准的蛋白质混合物体积比保持为5:1,000（体积:体积），以制备用于与T细胞共培养的BSLB。
    12. 将 BSLB 加载目标蛋白混合物后，用 HBS/HSA（BSA）洗涤 BSLB 两次，以去除未结合的过量蛋白。采用 300 的沉降速度 × g 每次洗涤步骤在室温下离心2 min，并弃去上清液。
    13. 重悬 5 × 105 每孔 BSLB 200 µL.
    14. 转移 100 µL 每孔加入新的U型底96孔板中，制备复孔，使每孔BSLB的最终量为2.5 × 105.
    15. 将 BSLBs 在 300 × g 离心沉淀 × g 2分钟，室温，弃去上清液。
    16. 使用移液器重悬BSLBs 100 µL T细胞悬液；轻轻混匀，避免产生气泡。
    17. 将共培养物在37°C下孵育90分钟 37 °C.
      注意：也可将细胞和微珠重悬于 HBS/HSA（BSA）缓冲液中，替代酚红游离 RPMI 进行共培养。在此情况下，孵育必须在非 CO₂2 培养箱，因为该气体在缺乏碳酸氢盐的情况下会迅速使缓冲液酸化。
    18. 将BSLB-T细胞共培养物置于室温下孵育至少15分钟以冷却，期间避光。
    19. 离心细胞5分钟，500 × g × g 并置于室温；弃去上清液。
    20. 将细胞重悬于室温的 2% BSA-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+用于封闭。将细胞置于冰上 45 分钟，避光。
    21. 孵育细胞的同时，使用预冷的 0.22 µm在 PBS 中加入经滤过的 2% BSA 作为染色缓冲液，以提供额外的封闭作用。
      注意：某些批次的与 Brilliant Violet 染料偶联的抗体倾向于非特异性结合 BSLB。使用 5% BSA-PBS 封闭有助于降低此类背景信号。 从现在起，务必确保冷链不断链.
    22. 将共培养物在500 × g离心 × g 5分钟，并 4 °C弃去上清液前，使用背光检查96孔板底部，确认沉淀物存在。
    23. 使用多通道移液器，将细胞重悬于含有优化抗体浓度的染色主混合液中。
      注意：使用无滤芯的移液器吸头，以避免产生气泡及染色液体分配误差。
    24. 包括同型标记的细胞和 BSLB、荧光及非荧光 BSLB，以及单独染色的细胞和 BSLB。所有对照组需遵守每孔设定的总事件数（即仅含 5 的 BSLB） × 105 每孔 BSLB，且仅含 5 个细胞的对照组 × 105 每孔细胞数以避免每个染色事件中抗体相对增加）。
    25. 用移液器轻轻吹打混合，吸取总体积的一半，然后在冰上孵育30分钟。避光保存。
    26. 用预冷的 2% BSA-PBS（pH 7.4）洗涤细胞和 BSLB 两次，每次洗涤后以 500 × g 离心沉淀 × g 5分钟 4 °C. 将洗涤后的共培养物重悬于 100 µL PBS洗涤后立即上样检测。
    27. 如果需要固定，用 PBS 中 0.5% w/v 的 PFA 固定 10 分钟，洗涤一次，随后置于 PBS 中保存直至上机检测。避光操作。
    28. 补偿前，获取MESF标准品，确保最暗和最亮的群体均落在测量的线性范围内。
    29. 获取补偿样本，计算补偿值，并将补偿矩阵（链接）应用于实验。
    30. 获取并保存至少 2 个 × 104 每个定量通道的总MESF标准品
    31. 使用高通量采样器进行采集，将仪器采集模式设为标准，样本采集模式设为 80 µL （或总体积的80%），样品流速介于2.0至 3.0 µL/s，样品混合体积为 50 µL （或总体积的50%以避免混合过程中产生气泡），样品混合 150 µL/s，以及每孔混合3到5次。
    32. 至少获取1 × 104 每个样本一个BSLB（参见 图3B 参考门控策略的图版 (i)-(vi)
    33. 关闭仪器前，先用清洗液冲洗流式细胞仪运行 5 分钟，再用超纯水冲洗 5 分钟。若使用 HTS，请遵循选项卡下的相应操作选项 高通量筛选与净化 选项
    34. 导出 FCS 文件。

7. 测量颗粒向 BSLB 的突触转移

  1. 打开实验的 FCS 文件。根据细胞和 BSLB 的侧向散射光面积与前向散射光面积（SSC-A 与 FSC-A）选择细胞群，如 图 3B (i) 所示。
  2. 选择连续采集窗口内的事件（图 3B (ii)）。
  3. 聚焦于细胞和 BSLB 的单个事件；首先根据 FSC-W/FSC-H 连续门控中较低的 W 值识别单细胞（单细胞-1，图 3B 面板 (iii)），以及 SSC-W/SSC-H（单细胞-2；图 3B 面板 (iv)）。通过选择 FSC-A 与 FSC-H 成比例的事件定义额外的单细胞-3 门控（图 3B，面板 (v)）。
  4. 提取每个实验样本中单个细胞及 MESF 的空白和 1 至 4 号 MESF 组分的平均荧光强度（MFI）。
  5. 通过从各组分中减去空白微球群体的 MFI，生成 1 至 4 号 MESF 组分的校正后 MFI（cMFI）值。
  6. 生成单个 BSLB 和细胞的 cMFI 值（参见 图 3C 面板 (i)）。
  7. 使用同型对照抗体染色的 BSLB 信号，校正针对相关 T 细胞标志物抗体染色的 BSLB 的 MFI。利用 cMFI 并根据 图 3C 面板 (ii) 所示公式计算归一化突触转移百分比（NST%）。
  8. 若关注的是由 TCR 激活特异性转移的颗粒，则从激动性 BSLB 的 MFI 中减去空白 BSLB 的信号。使用该 cMFI 并根据 图 3C 面板 (ii) 所示公式计算TCR 驱动的 NST%。
  9. 若需测定在 T 细胞-BSLB 界面作为颗粒载荷转移的分子总数，请使用与 T 细胞-BSLB 共培养相同的仪器设置和采集会话获取 MESF 标准微球数据。
  10. 分析 MESF 微球群体，并按照步骤 5.8.15 至 5.8.17 所述提取其 cMFI。计算 MESF 对 cMFI 回归分析中最佳拟合直线的斜率。
  11. 利用计算所得的斜率提取沉积在 BSLB 上的 MESF 数量。使用以同型对照或空白 BSLB 作为背景所计算的 cMFI，提取特异性转移至刺激性 BSLB 的 MESF 数量。
  12. 通过将每 BSLB 计算得到的（平均）MESF 数除以定量抗体的 F/P 值，计算转移至 BSLB 的标志物分子数。

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结果

通过流式细胞术进行细胞表面蛋白质的绝对定量
重建呈现生理配体密度的合成细胞样脂质双层结构（BSLB）需要估算模型细胞亚群上的总蛋白密度。为重建 BSLB，应包含在目标信号通路中可能发挥作用的任何相关配体，以及支持 BSLB 与细胞之间黏附和功能性相互作用的蛋白，例如 ICAM-1 和共刺激分子（如 CD40、CD58 以及 B7 受体 CD80 和 CD86）。根据具体研究问题，还可添加其他蛋白，包括共刺激分子如 ICOSL3、PD-L1 和 PD-L215。对于其他分子，可通过定量流式细胞术直接分析细胞来确定其分子密度，进而用于 BSLB 的重建。对于直接偶联抗体，BioLegend 为每一批号抗体提供荧光染料与蛋白（F/P）比值。抗体也可由实验室自行标记，并通过分光光度法测定 F/P 比值，这在缺乏商业化的特定荧光染料偶联抗体时提供了一种替代方案。由于我们使用相同的抗体来校准细胞和 BSLB 表面重组蛋白的数量，因此无需校正抗体结合价态，因其保持恒定。若需确定抗体结合价态，可使用已知 F/P 值的...

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讨论

BSLB 是研究 T 细胞受模拟 APC 膜刺激后颗粒产物的多功能工具。该方法具有高度灵活性，可重构复杂或简化的膜组成，用于研究配体及其信号对 tSV 和大分子攻击颗粒及其组分分泌的影响。我们已在多种 T 细胞上验证了该技术，包括预激活的 TH、CTL、Treg 和 CART15。本方案同样适用于检测新分离的静息态 T 细胞的突触颗粒释放。使用新分离 T 细胞的一个局限性在于，这些静息态细胞群产生的跨突触颗粒谱型不同，这与其细胞表面组成相关（详见 15）。

作为一个简单的流式细胞术检测方案，我们推荐使用抗TCR克隆IP26、抗CD81克隆5A6、抗穿孔素（PRF1）克隆B-D48或抗CD40L克隆24-31，以及含ATTO 390或ATTO 565的脂质（使BSLB具有内在荧光）。为帮助区分单个细胞、单个BSLB以及共轭复合物，我们建议使用抗CD4克隆OKT4和/或抗CD45克隆HI30，尽管这些分子在细胞表面高度表达，但仅以有限程度转移至BSLB上（有关荧光染料及其他已验证抗体的更多细...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢实验室成员以及肯尼迪风湿病学研究所社区成员在科学讨论中给予的建设性意见，特别感谢我们的流式细胞术设施负责人 Jonathan Webber。本研究由惠康信托主要研究基金（100262Z/12/Z）、欧洲研究理事会高级资助（SYNECT AdG 670930）以及肯尼迪风湿病学研究信托基金（KTRR）资助（以上三项均授予 MLD）。PFCD 获得欧洲分子生物学组织长期奖学金（ALTF 1420-2015，与欧盟委员会联合资助 LTFCOFUND2013, GA-2013-609409）及玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动计划的支持，并获得牛津-百时美施贵宝奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰基]（镍盐）Avanti Polar Lipids790404C-25mg氯仿中的18:1 DGS-NTA(Ni)

PIPETMAN L 多通道 P8x200L，20-200 µL		GilsonFA10011
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱Avanti Polar Lipids850375C-25mg 18:1 (Δ9-顺式)磷脂酰胆碱（DOPC）的氯仿溶液
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）ATTO 390ATTO-TECAD 390-165DOPE ATTO 390
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）ATTO 488ATTO-TECAD 488-165DOPE ATTO 488
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）ATTO 565ATTO-TECAD 565-165DOPE ATTO 565
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(帽酰生物素)（钠盐）Avanti Polar Lipids870273C-25mg氯仿中的18:1生物素酰化PE
200 µL 黄色吸头 10 x 96 个/盒，堆叠式包装StarlabS1111-0206
5 mL 聚苯乙烯圆底管Falcon®352052
5.00 ± 0.05 µm 非功能化二氧化硅微珠Bangs Laboratories Inc.SS05003
96孔细胞培养板，U型底，带盖，组织培养处理，无热原Costar®3799用于BSLB与细胞的流式细胞术染色及共培养。
96孔细胞培养板，V型底，带盖，组织培养处理，无热原Costar®3894用于悬浮细胞或微珠的流式细胞术染色。
Alexa Fluor 488 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）赛默飞世尔科技，英吉瑞™A20000
Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）Thermo Fisher Scientific，Invitrogen™A37573 和 A20006
Allegra X-12R 离心机Beckman Coulter用于流式细胞术生物样本的管内常规染色
铝箔任何品牌用于保护细胞和 BSLB 免受光照
抗人 CD154（CD40L），克隆 24-31BioLegend310815 和 310818Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。
抗人 CD185（CXCR5） Brilliant Violet 711，克隆号 J252D4BioLegend356934用于图1E所示扁桃体细胞的定量流式细胞术分析
抗人 CD19 Brilliant Violet 421，克隆 HIB19BioLegend302234用于图1E中扁桃体细胞的定量流式细胞术分析
抗人 CD2，克隆 RPA-2.10BioLegend300202使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD2，克隆 TS1/8BioLegend309218Brilliant Violet 421 偶联物
抗人 CD252（OX40L），克隆 11C3.1BioLegendAlexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD28，克隆 CD28.2eBioscience16-0289-85使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD317（BST2，PDCA-1），克隆 26F8赛默飞世尔科技，英潍捷基53-3179-42Alexa Fluor 488 偶联物，我们发现该克隆的背景比克隆 RS38E 更干净。
抗人 CD38，克隆 HB-7BioLegend356624Alexa Fluor 700 偶联物
抗人 CD38，克隆 HIT2BioLegend303514Alexa Fluor 647 标记物
抗人 CD39，克隆 A1BioLegend使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD4 Brilliant Violet 650，克隆号 OKT4BioLegend317436用于图1E中扁桃体细胞的定量流式细胞术分析
抗人 CD4，克隆 A161A1BioLegend357414 和 357421PerCP/Cyanine5.5 和 Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD4，克隆 OKT4BioLegend317414 和 317422PE/Cy7 和 Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD40，克隆 5C3BioLegend334304使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD40，克隆 G28.5BioLegend使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记
抗人 CD45，克隆 HI30BioLegend304056 和 368516Alexa Fluor 647 和 APC/Cy7 偶联物
抗人 CD47，克隆号 CC2C6BioLegend323118Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD54（ICAM-1），克隆 HCD54BioLegend322702使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 CD63（LAMP-3），克隆 H5C6BioLegend353020 和 353015PerCP/Cyanine5.5 和 Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD73，克隆 AD2BioLegend344002使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记
抗人 CD80，克隆 2D10BioLegend305216Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD81，克隆 5A6BioLegend349512 和 349502PE/Cy7偶联物分别使用Alexa Fluor 647 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）进行体外标记。
抗人 CD82，克隆 ASL-24BioLegend342108Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD86，克隆 IT2.2BioLegend305416Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD8a，克隆 HIT8aBioLegend300920Alexa Fluor 700 偶联物
抗人 CD8a，克隆 SK1BioLegend344724Alexa Fluor 700 偶联物
抗人 HLA-A/B/C/E，克隆 w6/32BioLegend311414 和 311402Alexa Fluor 647 偶联物，使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在实验室标记
抗人 HLA-DR，克隆 L243BioLegend307656 和 307622Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。
抗人 ICAM-1，克隆 HCD54BioLegend322702使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记
抗人 ICOS，克隆 C398.4ABioLegend313516Armenian Hamster IgG
抗人 ICOSL，克隆 MIH12BioLegend329611Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 ICOSL，克隆 MIH12eBioscience16-5889-82使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在实验室内部进行标记
抗人 LFA-1，克隆 TS1/22BioLegend自行制备使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 OX40，克隆 Ber-ACT35（ACT35）BioLegend350018Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 PD-1，克隆 EH12.2H7BioLegend135230 和 329902Alexa Fluor 647 偶联物，使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在实验室标记
抗人 PD-L1，克隆 29E.2A3BioLegend329702使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 PD-L2，克隆 24F.10C12BioLegend329611Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 PD-L2，克隆 MIH18BioLegend345502使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
抗人 TCRab，克隆 IP26BioLegend306712 和 306714Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。
抗人 CD156c (ADAM10)，克隆 SHM14BioLegend352702
抗人 CD317（BST2，Tetherin），克隆 RS38EBioLegend348404Alexa Fluor 647 偶联物
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 同型对照，克隆 HTK888BioLegend400902使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
BD 细胞仪设置与追踪微球Becton Dickinson & 公司（BD）641319定量流式细胞术前对仪器性能的检测轨迹
BD FACSDivaBecton Dickinson & 公司（BD）23-14523-00采集软件
牛血清白蛋白默克，Sigma-AldrichA3294
CaCl2氯化钙默克，Sigma-AldrichC5670无水，BioReagent，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 ≥96.0%
牛乳酪蛋白，适用于蛋白激酶底物（脱磷酸化后），纯化粉末默克，Sigma-AldrichC5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28赛默飞世尔科技，Gibco11132D
DynaMag-2ThermoFisher Scientific，Invitrogen™12321D用于去除体积小于 2 mL 的 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28
DynaMag™-15赛默飞世尔科技，英坦奇™12301D用于去除 Dynabeads™ 人源 T 细胞激活剂 CD3/CD28，体积小于 15 mL
胎牛血清，经认证，一次性装ThermoFisher Scientific，GibcoA3160801需在56℃加热灭活30分钟 oC
Ficoll-Paque PLUSCytiva, GE HealthcareGE17-1440-02用于淋巴细胞分离的多糖与二碘异酞酸钠无菌溶液
可固定的活力染料 eFluor 780eBiosciences65-0865-14用于分析过程中排除死细胞
FlowJoBecton Dickinson & 公司（BD）版本 10.7.1分析软件
Grant Bio MPS-1 多板摇床Keison ProductsMPS-1在染色过程中混合细胞，或在染色或蛋白负载过程中混合 BSLB（作为轨道振荡的替代方法）
HEPES缓冲液（1 M）ThermoFisher Scientific, Gibco15630-056
HEPES，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)，4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸默克，Sigma-AldrichH4034用于配制 HBS/HAS 或 HBS/BSA 缓冲液。BioPerformance Certified， ≥99.5%（滴定），适用于细胞培养
HERACell 150i CO2 孵育箱，150 L，电抛光不锈钢ThermoFisher Scientific51026282用于培养和扩增纯化的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞。
Hula Mixer® 样品混合器赛默飞世尔科技，生命技术公司15920D用于混合BSLB、脂质母液、封闭溶液、蛋白母液以及小规模抗体染色的垂直式可调角度实验室混匀仪。
人血清白蛋白，30% 水溶液默克，Sigma-Aldrich12667-M
人源 TruStain FcX Fc 受体阻断液BioLegend422302用于阻断生物相关样本中 Fc 受体的 Fc 受体阻断液
Innovatis CASY 细胞计数器与分析仪 TTBiovendis Products GmbH基于电流排斥法对细胞进行计数，并测定细胞大小与体积。
氯化钾，KCl默克，Sigma-AldrichP5405粉末，BioReagent，适用于细胞培养
L-谷氨酰胺 200 mM (100倍浓缩液)ThermoFisher Scientific，Gibco25030-024
MgCl2氯化镁默克，Sigma-AldrichM2393生物试剂，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养
适用于 24 个 1.5/2.0 mL 离心管的微型管插件Keison ProductsP-2-24Grant Bio MPS-1 多孔板摇床用微量管插件
微型孵育器Labnet International I5110A-230V在无 CO 的条件下孵育（共培养）BSLB 与细胞2
最低必需培养基非必需氨基酸赛默飞世尔科技，吉布科11140-035
小鼠IgG多克隆抗体对照默克，Sigma-AldrichPP54用作小鼠 IgG 捕获珠标准品上结合抗体检测的阳性对照
小鼠 IgG1，κ 同种型，克隆 MOPC-21BioLegend400129, 400112, 400130, 400144, 400128 和 400170Alexa Fluor 488、PE、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、APC/Cyanine7 和 Brilliant Violet 785  分别形成共轭物。
小鼠 IgG1, k 同种型，克隆 X40Becton Dickinson & 公司（BD），Horizon562438BV421偶联物
小鼠 IgG1 κ 同型对照，克隆号 P3.6.2.8.1eBioscience14-4714-82使用 Alexa Fluor 647 NHS 琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl Ester）在本实验室进行标记
小鼠 IgG2a, k 同种型，克隆 MOPC-173BioLegend400240Alexa Fluor 647 偶联物
小鼠 IgG2b, k 同种型，克隆 MPC-11BioLegend400330 和 400355Alexa Fluor 647 和 Brilliant Violet 785 偶联物
多孔 6 孔组织培养板，经真空气体等离子体处理Falcon353046用于培养和扩增纯化的 CD4+ 和 CD8+ T细胞
Na2HPO4磷酸氢二钠默克，Sigma-AldrichS7907
NaCl，氯化钠默克，Sigma-AldrichS5886生物试剂，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 ≥99%
NiSO4硫酸镍(II)默克，Sigma-Aldrich656895用于饱和 NTA 位点；在封闭过程中加入
青霉素链霉素 [+]10,000 单位青霉素；[+] 10,000 µg/mL 链霉素ThermoFisher Scientific，Gibco15140-122
磷酸盐缓冲液，pH 7.4，无菌ThermoFisher Scientific，Gibco10010无 Ca2+ 或 Mg2+ 添加
聚醚砜（PES）滤器单元赛默飞世尔科技 Nalgene UY-06730-43低蛋白吸附的亲水性聚醚砜（PES）膜有助于过滤高蛋白含量的溶液
PURESHIELD 氩气 ISO 14175-I1-ArBOC有限公司11-Y为保护储存于 +4 ℃ 的脂质储备液 ºC.
纯化的链霉亲和素BioLegend280302
量子 Alexa Fluor 488 MESF 微球Bangs Laboratories Inc.488用于插值测定细胞和/或BSLB结合的Alexa Fluor 488分子数的基准微球
量子 Alexa Fluor 647 MESF 微球Bangs Laboratories Inc.647用于插值细胞和/或BSLB结合的Alexa Fluor 647分子的基准微球
大鼠抗小鼠 IgG κ轻链，克隆株 OX-20赛默飞世尔科技，英维特罗根SA1-25258使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室进行标记
重组人 IL-2Peprotech200-02-1MG
RPMI 1640 培养基（1×）；不含 L-谷氨酰胺ThermoFisher Scientific, Gibco31870-025
人类B细胞富集鸡尾酒混合液STEMCELL Technologies15064分离B细胞以测定纯化细胞群体中蛋白质的密度
Rosette 人 CD4+ T 细胞富集试剂盒STEMCELL Technologies15022C.1
罗塞特人 CD4+CD127low T 细胞富集混合液STEMCELL Technologies15361CD4+ CD127 预富集低 用于通过FACS下游分离Treg的T细胞。
Rosette 人 CD8+ T 细胞富集混合液STEMCELL Technologies15063
RPMI 1640 培养基（1×）；不含酚红ThermoFisher Scientific，Gibco11835-063在无 CO 的条件下孵育（共培养）BSLB 与细胞2酚红-free 培养基可降低细胞在流式细胞术和显微镜检测中的自发荧光。
丙酮酸钠（100 mM）ThermoFisher Scientific，Gibco11360-070
Sprout迷你离心机FisherScientific，Heathrow Scientific LLC120301用于在1.5 mL Eppendorf管中洗涤二氧化硅微珠和BSLB的台式微量离心机。
无菌带盖 5 mL 聚苯乙烯圆底试管Falcon352058
UltraComp eBeads 补偿微球ThermoFisher Scientific，invitrogen01-2222-42
Zeba 脱盐柱，7K MWCO赛默飞世尔科技，英坦科技™89882

参考文献

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制备用于研究T细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层
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