方法文章

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

DOI：

10.3791/63130

⸱

2022年4月1日

 , 
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The immunological synapse (IS) is a pivotal molecular structure formed at the interface of cells engaged in physical contact that facilitates the regulated exchange of juxtracrine information. Different ISs have been described in the literature, and a growing body of evidence suggests these molecular hubs are a conserved feature of cellular networks. Various immune cells, including B cells, natural killer cells, dendritic cells, macrophages, and T cells, exchange information via the assembly of short-lived contacts1. Multiomic studies are advancing the understanding of novel subsets of leukocytes and stromal cells driving pathogenic cellular ne....

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Measurement of cell surface protein densities with quantitative flow cytometry

  1. Prepare 0.22 µm-filtered human flow cytometry buffer (hFCB) by adding EDTA (to a final 2 mM concentration) and human AB serum (to a final 10%) to sterile phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 (see Table 1). Filter the solution using a 0.22 µm pore filter unit to remove serum impurities and store at 4 °C.
  2. Recover the cells and sediment them by centrifugation at 300 × g for 5 min at room temperature (RT).
  3. Wash the cells twice with PBS. In each washing step, resuspend the cells in PBS to the ori....

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FCM for absolute protein quantification on the cell surface
The reconstitution of BSLBs presenting physiological densities of ligands requires the estimation of total protein densities on the modeled cell subset. To reconstitute BSLBs, include any relevant ligand expected to play a role in the signaling axis of interest alongside proteins supporting the adhesion and functional interaction between BSLB and cells, such as ICAM-1 and costimulatory molecules, e.g., CD40, CD58, and B7 receptors (CD80 and .......

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BSLBs are versatile tools for studying the particulate output of T cells stimulated with model APC membranes. The flexibility of the method allows the reconstitution of complex and reductionist membrane compositions to study the effects of ligands and their signals on the secretion of tSVs and supramolecular attack particles and their components. We have tested this technology on various T cells, including preactivated TH, CTL, Tregs, and CART15. This protocol also works for the measurement of syn.......

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have no conflict of interest to declare.

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We are grateful to our laboratory members and the Kennedy Institute of Rheumatology community for constructive scientific discussions, especially our flow cytometry facility manager Jonathan Webber. This work was funded by Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, the ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930), and the Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (all three to MLD). PFCD was supported by EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, in conjunction with the European Commission (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) and Marie Sklodowska-Curie Actions) and an Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰-sn-甘油-3-[（N-（5-氨基-1-羧基戊基）亚氨基二乙酸）琥珀酰]（镍盐）Avanti 极性脂质790404C-25mg18：1 DGS-NTA（Ni） 在氯仿

PIPETMAN L 多通道 P8x200L，20-200 µL		GilsonFA10011
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱Avanti 极性脂质850375C-25mg 18：1 （Δ9-顺式） PC （DOPC） 在氯仿
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 （DOPE） 中 ATTO 390ATTO-TECAD 390-165DOPE ATTO 390
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 （DOPE） ATTO 488ATTO-TECAD 488-165DOPE ATTO 488
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 （DOPE） ATTO 565ATTO-TECAD 565-165DOPE ATTO 565
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（帽生物素）（钠盐）Avanti 极性脂质870273C-25mg18：1 生物素帽 PE 在氯仿
200 和微量中;L 黄色吸头 10 x 96 吸头，堆叠StarlabS1111-0206
5 mL 聚苯乙烯圆底管Falcon®
5.00 & plusmn; 0.05 µm 非功能化二氧化硅珠Bangs Laboratories Inc.
96 孔细胞培养板 U 型底，带盖，经组织培养处理，无热原。Costar®3799用于 BSLB 和细胞的 FCM 染色和共培养。
96 孔细胞培养板 V 形底带盖，经组织培养处理，无热原。Costar®3894用于悬浮细胞或微珠的 FCM 染色。
Alexa Fluor 488 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）Thermo Fisher Scientific， Invitrogen™A20000
Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）Thermo Fisher Scientific， Invitrogen™A37573 和 A20006
Allegra X-12R 离心机Beckman Coulter用于 FCM 铝箔生物样品的正常管内染色
任何品牌用于保护细胞和 BSLB 免受光
抗人 CD154 （CD40L） 的伤害，分别克隆 24-31BioLegend310815 和 310818Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。
抗人 CD185 （CXCR5） Brilliant Violet 711，克隆 J252D4BioLegend356934用于扁桃体细胞的定量 FCM 分析，如图 1E
所示 抗人 CD19 Brilliant Violet 421，克隆 HIB19BioLegend302234用于扁桃体细胞的定量 FCM 分析，如图 1E
所示 抗人 CD2，克隆 RPA-2.10BioLegend300202使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
抗人 CD2 标记，克隆 TS1/8BioLegend309218Brilliant Violet 421 偶联物。
抗人 CD252 （OX40L），克隆 11C3.1BioLegendAlexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD28，克隆 CD28.2eBioscience16-0289-85在内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）标记
人 CD317（BST2，PDCA-1），克隆 26F8ThermoFisher Scientific，invitrogen53-3179-42Alexa Fluor 488 偶联物，我们发现该克隆比克隆 RS38E 更干净。
抗人 CD38、克隆 HB-7BioLegend356624Alexa Fluor 700 偶联物
抗人 CD38、克隆 HIT2BioLegend303514Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD39、克隆 A1BioLegend内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）标记
抗人 CD4 Brilliant Violet 650，克隆 OKT4BioLegend317436对于扁桃体细胞的定量 FCM 分析，如图 1E
所示，抗人 CD4，克隆 A161A1BioLegend357414 和 357421PerCP/Cyanine5.5 和 Alexa Fluor 647 偶联物，分别
抗人 CD4、克隆 OKT4BioLegend317414 和 317422PE/Cy7 和 Alexa Fluor 647 偶联物，分别
抗人 CD40，克隆 5C3BioLegend334304内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
抗人 CD40 标记，克隆 G28.5BioLegend内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
抗人 CD45、克隆 HI30BioLegend304056 和 368516Alexa Fluor 647 和 APC/Cy7 偶联物
抗人 CD47，克隆 CC2C6BioLegend323118Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD54 （ICAM-1），克隆 HCD54BioLegend322702内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）标记
人 CD63 （LAMP-3），克隆 H5C6BioLegend353020 和 353015PerCP/Cyanine5.5 和 Alexa Fluor 647 偶联物，分别为
抗人 CD73、克隆 AD2BioLegend344002用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯
）标记抗人 CD80、克隆 2D10BioLegend305216Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD81、克隆 5A6BioLegend349512 和 349502PE/Cy7 偶联物，并在内部分别用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）标记。
抗人 CD82、克隆 ASL-24BioLegend342108Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD86、克隆 IT2.2BioLegend305416Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 CD8a、克隆 HIT8aBioLegend300920Alexa Fluor 700 偶联物
抗人 CD8a、克隆 SK1BioLegend344724Alexa Fluor 700 偶联物
抗人 HLA-A/B/C/E，克隆 w6/32BioLegend311414 和 311402Alexa Fluor 647 偶联物，并在内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
抗人 HLA-DR 标记，克隆 L243BioLegend307656 和 307622Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物。
抗人 ICAM-1，克隆 HCD54BioLegend322702内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）标记
人 ICOS，克隆 C398.4ABioLegend313516亚美尼亚仓鼠 IgG
抗人 ICOSL，克隆 MIH12BioLegend329611Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 ICOSL，克隆 MIH12eBioscience16-5889-82内部标记使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
抗人 LFA-1，克隆 TS1/22BioLegend生产内部标记使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
抗人 OX40、克隆 Ber-ACT35 （ACT35）BioLegend350018Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 PD-1、克隆 EH12.2H7BioLegend135230 和 329902Alexa Fluor 647 偶联物，内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
抗人 PD-L1 克隆 29E.2A3BioLegend329702内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
抗人 PD-L2 克隆 24F.10C12BioLegend329611Alexa Fluor 647 偶联物
抗人 PD-L2，克隆 MIH18BioLegend345502内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
抗人 TCRab、克隆 IP26BioLegend306712 和 306714Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物标记。
蚁人 CD156c （ADAM10），克隆 SHM14BioLegend352702
蚁人 CD317（BST2，Tetherin），克隆 RS38EBioLegend348404Alexa Fluor 647 偶联物
亚美尼亚仓鼠 IgG Alexa Fluor 647 同种型对照，克隆 HTK888BioLegend400902内部用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
BD 细胞仪设置和示踪珠标记贝克顿·狄金森 &公司 （BD）641319定量 FCM BD
FACSDivaBecton Dickinson & 之前工具的性能跟踪公司 （BD）23-14523-00采集软件
牛苏姆 白蛋白默克，Sigma-AldrichA3294
CaCl2，氯化钙默克，Sigma-AldrichC5670无水物，生物试剂，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养，≥96.0%
来自牛乳的酪蛋白，适用于蛋白激酶的底物（去磷酸化后），纯化粉末Merck，Sigma-AldrichC5890
Dynabeads，人 T 活化剂 CD3/CD28，ThermoFisherScientific，Gibco11132D
DynaMag-2，ThermoFisherScientific，Invitrogen™12321D用于去除体积小于 2 mL 的 Dynabeads 人 T 活化剂 CD3/CD28
DynaMag™-15ThermoFisher Scientific， Invitrogen™12301D用于去除 Dynabeads™体积小于 15 mL 胎牛血清的人 T 激活剂 CD3/CD28
合格，一次性ThermoFisher Scientific，GibcoA3160801需要在 56 oC 下热灭活 30 分钟
Ficoll-Paque PLUSCytiva，GE HealthcareGE17-1440-02用于淋巴细胞分离的多糖和泛影酸钠无菌溶液
可固定活性染料 eFluor 780eBiosciences65-0865-14用于在分析过程中排除死细胞
FlowJoBecton Dickinson &公司 （BD）版本 10.7.1分析软件
Grant Bio MPS-1 多板摇床Keison 产品MPS-1用于染色期间的细胞混合，或在固定或蛋白质加载期间混合 BSLB（作为轨道搅拌的替代方案）
HEPES 缓冲溶液 （1 M）ThermoFisher Scientific， Gibco15630-056
HEPES，N-（2-羟乙基）哌嗪-N′-（2-乙磺酸），4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸。Merck， Sigma-AldrichH4034用于制备 HBS/HAS 或 HBS/BSA 缓冲液。生物性能认证，≥99.5%（滴定），适用于细胞培养
HERACell 150i CO2培养箱，150 L，电解抛光不锈钢ThermoFisher Scientific51026282用于培养和扩增纯化的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞。
草裙舞搅拌机®样品混合器ThermoFisher Scientific， Life Technologies15920D立式可变角度实验室混合器，用于混合 BSLB 和脂质预混液、封闭溶液、蛋白质预混液和小规模抗体染色。
人血清白蛋白，30% 水溶液Merck，Sigma-Aldrich12667-M
人 TruStain FcX Fc 受体封闭液BioLegend422302Fc 受体封闭液，用于封闭生物相关样品中的 Fc 受体
Innovatis CASY 细胞计数仪和分析仪 TTBiovendis Products GmbH用于细胞计数以及基于排除电流测定细胞大小和体积。
KCl，氯化钾Merck，Sigma-AldrichP5405粉末，生物试剂，适用于细胞培养
L-谷氨酰胺 200 mM （100x）ThermoFisher Scientific，Gibco25030-024
MgCl2，Magessiumchloride Merck，Sigma-AldrichM2393生物试剂，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养
24 x 1.5/2.0 mL 微管插件管 Keison ProductsP-2-24微管插入物，适用于 Grant Bio MPS-1 多板摇床
迷你培养箱Labnet International I5110A-230V用于在没有 CO2 必需培养基的情况下 BSLB 和细胞的孵育（共培养）
非必需氨基酸ThermoFisher Scientific， Gibco11140-035
小鼠 IgG 多克隆抗体对照品Merck， Sigma-AldrichPP54用作阳性对照，用于测量与小鼠 IgG 捕获珠标准
品结合的抗体小鼠 IgG1、k 同种型、克隆 MOPC-21BioLegend400129、400112、400130、400144、400128 和 400170Alexa Fluor 488、PE、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、APC/Cyanine7 和 Brilliant Violet 785  偶联物。
小鼠 IgG1，k 同种型，克隆 X40Becton Dickinson &公司 （BD），Horizon562438Brilliant Violet 421 偶联物。
小鼠 IgG1 和 kappa;同型对照，克隆 P3.6.2.8.1eBioscience14-4714-82用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）小鼠
IgG2a，k 同种型，克隆 MOPC-173BioLegend400240Alexa Fluor 647 偶联物
小鼠 IgG2b，k 同种型，克隆 MPC-11BioLegend400330 和 400355Alexa Fluor 647 和 Brilliant Violet 785 偶联物
多孔 6 孔 用真空气体等离子体Falcon353046用于培养和扩增纯化的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞。
Na2HPO4， 磷酸二钠Merck， Sigma-AldrichS7907
NaCl， 氯化钠Merck， Sigma-AldrichS5886生物试剂， 适用于细胞培养， 适用于昆虫细胞培养， 适用于植物细胞培养， ≥99%
NiSO4， 硫酸镍 （II）默克， Sigma-Aldrich656895用于饱和 NTA 位点;在封闭过程中添加
青霉素 链霉素 [+]10,000 单位青霉素;[+] 10,000 和微量;g/mL 链霉素ThermoFisher Scientific，Gibco15140-122
磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4，无菌ThermoFisher Scientific，Gibco10010No Ca2+ 或 Mg2+添加
聚醚砜 （PES） 过滤装置Thermo Scientific Nalgene UY-06730-43低蛋白结合的亲水性 PES 膜有助于过滤高蛋白含量的溶液
PURESHIELD 氩气 ISO 14175-I1-ArBOC Ltd.11-Y用于保护储存在 +4 ºC 的脂质储备。
纯化的链霉亲和素BioLegend280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF 珠子Bangs Laboratories Inc.488个基准微珠，用于插值与细胞结合的 Alexa Fluor 488 分子和/或 BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF 微珠Bangs Laboratories， Inc.用于插值与细胞结合的 Alexa Fluor 647 分子和/或 BSLB
大鼠抗小鼠 IgG Kappa 轻链的 647 个基准微珠，克隆 OX-20ThermoFisher Scientific，invitrogenSA1-25258使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）
重组人 IL-2Peprotech200-02-1MG
RMPI 培养基 1640 （1x） 进行内部标记;[-]L-谷氨酰胺ThermoFisher Scientific，Gibco31870-025
玫瑰花花型人 B 细胞富集混合物STEMCELL Technologies15064分离 B 细胞，用于测量纯化细胞群中蛋白质的密度
玫瑰花花型人 CD4+ T 细胞富集混合物STEMCELL Technologies15022C.1
玫瑰花型人 CD4+CD127 低 T 细胞富集混合物STEMCELL技术15361CD4 + CD127Low T 细胞的预富集，用于 FACS 对 Tregs 的下游分离。
Rosette 人 CD8+ T 细胞富集混合物STEMCELL Technologies15063
RPMI 培养基 1640 （1x）;[-]酚红ThermoFisher Scientific，Gibco11835-063用于在无 CO2 的情况下孵育（共培养）BSLB 和细胞。不含酚红的培养基可减少流式细胞术和显微镜检查中细胞的自发荧光。
丙酮酸钠 （100 mM）ThermoFisher Scientific， Gibco11360-070
Sprout 微型离心机FisherScientific， Heathrow Scientific LLC120301台式微量离心机，用于在 1.5 mL Eppendorf 管中洗涤硅胶珠和 BSLB。
无菌加盖 5 mL 聚苯乙烯圆底管Falcon352058
UltraComp eBeads 补偿珠ThermoFisher Scientific，invitrogen01-2222-42
Zeba 离心脱盐柱 7K MWCOThermo Fisher Scientific，Invitrogen™89882
352052SS05003抗是是标记抗 内部抗 内部、 标记 内部 处理的组织培养物

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological syna....

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