通过顺序毛细管辅助组装对微生物和微粒进行图案化

Summary

我们提出了一种技术，该技术在微流体平台中使用毛细管辅助组装，将悬浮在液体中的微尺寸物体（例如细菌和胶体）图案化为聚二甲基硅氧烷衬底上的规定阵列。

Abstract

将微生物控制模式化为定义的空间排列，为广泛的生物学应用提供了独特的可能性，包括微生物生理学和相互作用的研究。在最简单的层面上，微生物的精确空间图案化将实现对大量单个细胞的可靠，长期成像，并改变定量研究距离依赖性微生物 - 微生物相互作用的能力。更独特的是，结合微流体技术提供的精确空间图案和对环境条件的完全控制，将为微生物生态学中的单细胞研究提供一个强大而通用的平台。

本文提出了一个微流体平台，用于在微流体通道内产生多功能和用户定义的微生物模式，从而允许完整的光学访问以进行长期，高通量的监测。这种新的微流体技术基于毛细管辅助颗粒组装，并利用微流体通道内蒸发悬浮液的受控运动产生的毛细管力，将单个微尺寸物体沉积在微细加工到聚二甲基硅氧烷（PDMS）底物上的一系列陷阱中。顺序沉积生成单个或多个类型的微型物体的所需空间布局，仅由陷阱的几何形状和填充顺序决定。

该平台已使用不同尺寸和材料的胶体颗粒进行校准:它已被证明是生成各种胶体图案并执行捕获颗粒表面功能化的强大工具。此外，该平台在微生物细胞上进行了测试，使用 大肠 杆菌细胞作为模型细菌。成千上万的单个细胞被图案化在表面上，并随着时间的推移监测它们的生长。在这个平台上，单细胞沉积和微流体技术的耦合允许微生物的几何图案化和环境条件的精确控制。因此，它为单个微生物的生理学和微生物 - 微生物相互作用的生态学打开了一扇窗，如初步实验所示。

Introduction

单个微生物的空间模式化，特别是在能够完全控制环境条件的实验领域，如微流体装置，在广泛的背景下是非常可取的。例如，将微生物排列成规则的阵列将允许对大量单个细胞进行精确成像，并研究它们的生长，生理学，响应环境刺激的基因表达和药物敏感性。它还允许研究对细胞通讯（例如，群体感应），交叉喂养（例如，藻类 - 细菌共生）或拮抗（例如，化感作用）特别感兴趣的细胞 - 细胞相互作用，并完全控制细胞相对于彼此的空间定位。细胞生理学和进化研究¹，细胞 - 细胞相互作用研究²，表型分化筛选³，环境监测⁴和药物筛选⁵ 是能够实现这种定量单细胞分析的技术可以极大地受益的领域。

近年来，从全息光学陷阱⁶和异质表面功能化方法^7，8，⁹，¹⁰到单细胞化学抑制剂¹¹和液滴微流体^12，

Protocol

1. 硅母站制备

注:带有构成胶体和微生物图案模板的微细结构疏水阀的PDMS模板是根据Geissler等人引入的方法制造的。¹⁷. 硅母模是在洁净室中通过常规光刻法制备的。有关步骤和设备 的材料表 ，请参阅以下步骤。

1. 使用计算机辅助设计 （CAD） 软件设计功能。
2. 使用紫外直接激光刻录机曝光设计的特征，用一层正向光刻胶准备铬玻璃掩模。
   1. 使用旋转显影剂以 1:4 光刻胶与水的比例开发 15 s 的显影剂，开发铬玻璃掩模。
   2. 将面膜浸入铬蚀刻剂中50秒。
   3. 等离子体处理10 cm硅晶圆，在600 W下3分钟。
   4. 气相沉积一层六甲基二硅氮烷，并在110°C下烘烤，以提高对光刻胶的附着力。
   5. 在4，500× g 下沉积一层光刻胶2分钟。
   6. 使用掩模对准器通过镀铬玻璃掩模将该特征暴露在UV下2秒，并与开发人员一起开发掩模。
3. 为了完成硅母版的制造，通过深度反应离子交换蚀刻晶圆，调整蚀刻时间（<2分钟）以达到所需的深度（使用轮廓仪测量）。

2. ....

Results

开发了一种微流体平台，该平台利用毛细管辅助组装将胶体颗粒和细菌图案化为PDMS模板上微制造的陷阱。设计了两种不同的通道几何形状，以通过毛细管辅助组件优化胶体和细菌的图案化。第一个通道几何形状（图1B）由三个23毫米长的平行部分组成，它们之间没有物理屏障。侧面的两个部分宽5毫米，高1毫米，而中心部分宽7毫米，高500微米。这种设计有助于保持具有后退凸形半月板的明确定义的移动液滴。Pioli等人¹¹详细描述了该平台的工作原理。如果实验需要填充侧通道，例如在细菌培养的情况下，通常会形成气穴。出于这个原因，我们设计并测试了第二种几何形状，当通道被介质冲洗时，它简化了填充过程。在这种情况下，平台（图1C）由一个20 mm长，3 mm宽和500μm高的直通道组成。

微流体通道中的温度是确保高效沉积过程的重要参数。必须保持在水露点以上15°C，以避免模板上结露。通道下方的加热玻璃板（图2D.......

Discussion

这里描述的微流体平台允许将微尺寸的物体（如胶体和细菌）图案化为PDMS底物上规定的空间排列。微流体对环境条件的完全控制以及sCAPA技术赋予的以微米精度对细胞进行图案化的能力使其成为未来生理学和生态学研究的非常有前途的平台。

在这项工作中提出的实验中，使用 材料表中报告的光刻胶实现了硅母版。但是，可以使用任何适合在所描述的尺寸范围内产生特征的光刻胶，并且可以在PDMS成型中使用。这同样适用于用于制备微通道模具的3D打印树脂。可以使用任何能够产生所述尺寸的特征并与PDMS成型兼容的树脂。

在该协议中，将微流控芯片在70°C下储存5天可优化表面亲水性（接触角落在30至60°之间），当吐温20加入细菌或胶体悬浮液中时。该程序确保了在这些实验条件下后退接触角的最佳再现性;但是，其他储存时间和温度也可能有效。

已经提出了这种微流体技术的两种应用:1）细菌图案化涉及细菌细胞的单个沉积到PDMS底物上的陷阱中，以及2）胶体图案化涉及胶体的顺序沉积，获得.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
阿尔卡特 AMS 200SE I-Speeder	阿尔卡特微加工系统		深度反应离子交换系统
Alconox			洗涤剂
AZ400K 显影	MicroChemicals	AZ400K
BD 10 mL 注射器（鲁尔锁）	BD	300912	用于将新鲜溶原肉汤冲洗到微流体通道中
箱式培养箱	寿命成像服务		用于确保通道中温度均匀恒定
	离心机 Eppendorf	5424R	用于用新鲜的最小培养基替换过夜培养基
离心瓶	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI	GmbH		注射泵
直径为 0.98 &微米的荧光 PS 颗粒;m （red）	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi267
直径为 1.08 µ 的荧光 PS 颗粒;m （green）	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi182
直径为 2.07 µ 的荧光 PS 颗粒;m （green）	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi183
直径为 2.08 µ 的荧光 PS 颗粒;m （红色）	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M	PVA TePla		用于等离子处理 10 cm 硅片
H401-T-CONTROLLER	Okolab		加热玻璃板控制器
H601-NIKON-TS2R-GLASS	Okolab		加热玻璃板
Heidelberg DWL 2000	Heidelberg Instruments		紫外直接激光器写入
器 胰岛素注射器，U 100，带有鲁尔	Codan Medical ApS	CODA621640	1 mL 注射器，用于在图案化过程中提取液体悬浮
Klayout	Opensource		用于设计硅母
LB 肉汤的功能，Miller （Luria-Bertani）	Fisher Scientific	244610	溶原肉汤冲洗到微流体通道
Masterflex 中传输管	Masterflex	HV-06419-05	0.020 英寸内径，0.06 英寸外径
拖把 （10x）	Teknova	M2101	用 milliQ 水稀释 10 倍，用于替代过夜培养基
尼康 Eclipse Ti2	尼康仪器		显微镜
openSCAD	开源		，用于设计模具
OPTIspin SB20	ATM 组	51-0002-01-00	旋转显影
剂 等离子室 Zepto	Diener 电子	ZEPTO-1	用于等离子体处理模板和微通道以粘合它们
正性光刻胶 AZ1505	MicroChemicals	AZ1505
磷酸氢二钾	Sigma Aldrich	P3786	添加到 MOPS 1x
Prusa 固化和清洗机 CW1S	Prusa		用于确保所有聚合物均已固化，并将未固化的聚合物从模具中去除
Prusa 树脂 - Tough	Prusa Research a.s.		用于 3D 打印的 UV 光敏 405nm 液态树脂
Prusa SL1 3d 打印机	Prusa		用于打印模具
秤	VWR-CH	611-2605	用于称量 PDMS 混合物
硅晶片 （10 cm）Silicon	Materials Inc.		N/磷酸盐 <100> 1-10 和 Omega;cm
Süss MA6 掩模对准器	SUSS MicroTec Group		用于对准铬玻璃掩模和基材，并暴露基材
Sylgard 184	道康宁		有机硅弹性体套件;固化剂
Techni Etch Cr01	Technic		铬蚀刻剂
三氯（1H、1H、2H、2H-全氟辛基）硅烷	Sigma Aldrich	448931	用于硅烷化 3D 打印模具
吐温 20	Sigma Aldrich	P1379	用于确保图案化过程中的最佳后退接触角
Veeco Dektak 6 M	Veeco		轮廓仪
VTC-100 真空旋涂机	MTI 公司		真空旋涂机