我们介绍一种利用微流控平台中毛细作用力辅助组装的技术，可将悬浮在液体中的微米级物体（如细菌和胶体）在聚二甲基硅氧烷基底上排列成预设的阵列。
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本文内容
摘要
摘要
将微生物精确地排列成特定的空间结构，为广泛的生物学应用提供了独特的机会，包括对微生物生理学和相互作用的研究。在最基本层面，微生物的精确空间排列将能够对大量单个细胞进行可靠且长期的成像，并显著提升定量研究微生物间距离依赖性相互作用的能力。更进一步，将精确的空间排列与微流控技术所提供的对环境条件的全面控制相结合，将为微生物生态学中的单细胞研究提供一个强大且多功能的平台。
本文介绍了一种微流控平台，可在微流控通道内生成多种且用户自定义的微生物排列图案，实现长期、高通量监测的完全光学可及性。该新型微流控技术基于毛细作用辅助的颗粒组装，利用在微流控通道内受控移动的蒸发悬浮液所产生的毛细力，将单个微米级物体沉积到聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上微加工制成的阵列化捕获结构中。通过连续沉积，可根据捕获结构的几何形状和填充顺序，生成由单一或多种微米级物体构成的特定空间排布。
该平台已使用不同尺寸和材料的胶体颗粒进行校准，被证明是生成多种胶体图案并对捕获颗粒进行表面功能化的有力工具。此外，该平台已在微生物细胞上进行了测试，以大肠杆菌（Escherichia coli）作为模式细菌。数千个单个细胞在表面被有序排列，并对其生长过程进行了实时监测。在此平台上，单细胞沉积与微流控技术的结合，既可实现微生物的几何图案化，又能精确控制其环境条件。因此，该技术为研究单个微生物的生理特性以及微生物间相互作用的生态学提供了新的窗口，初步实验已证实了其应用潜力。
引言
在多种研究背景下，对单个微生物进行空间排布，尤其是在能够完全控制环境条件的实验装置（如微流控设备）中实现这一目标，具有重要意义。 例如，将微生物排列成规则阵列，有助于对大量单个细胞进行精确成像，进而研究其生长、生理状态、基因表达对环境刺激的响应以及药物敏感性。此外，这种方法还能在完全控制细胞间相对空间位置的前提下，研究细胞间的相互作用，这在细胞通讯（如群体感应）、交叉喂养（如藻菌共生）或拮抗作用（如化感作用）等研究中尤为重要。细胞生理学与进化研究1、细胞间相互作用研究2、表型分化筛选3、环境监测4以及药物筛选5等领域均可从能够实现此类定量单细胞分析的技术中显著受益。
近年来，已提出多种用于分离和操作单个细胞的策略，包括全息光镊6、异质表面功能化方法7,8,9,10、单细胞恒化器11以....
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方案
1. 硅胶母版制备
注意：用于胶体和微生物图案化的含微加工捕获结构的PDMS模板，其制备方法参照Geissler等.17 所介绍的方法进行。硅模板在洁净室中通过常规光刻技术制备。具体步骤见下文，所需设备见材料表。
- 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计结构特征。
- 通过紫外直接激光写入设备对设计好的结构进行曝光，制备带有正性光刻胶层的铬玻璃掩模。
- 使用显影液以1:4的光刻胶与水比例，通过旋转显影仪对铬玻璃掩模显影15秒。
- 将掩模浸入铬刻蚀液中50秒。
- 对10 cm硅片进行等离子体处理，功率为600 W，持续3分钟。
- 气相沉积一层六甲基二硅氮烷，并在110 °C下烘烤，以增强光刻胶的附着力。
- 以4,500 × g转速旋涂一层光刻胶，持续2分钟。
- 使用掩模对准器，通过铬玻璃掩模将结构用紫外光曝光2秒，并使用与掩模相同的显影液进行显影。
- 为完成硅模板的制备，通过深反应离子刻蚀对硅片进行刻蚀，调节刻蚀时间（<2 min）以达到所需深度（用轮廓仪测量）。
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结果
开发了一种微流控平台，该平台利用毛细辅助组装技术，将胶体颗粒和细菌在PDMS模板上微加工的捕获结构中进行有序排列。设计了两种不同的通道几何结构，以优化通过毛细辅助组装实现的胶体和细菌排列。第一种通道几何结构（图1B）包含三个长度均为23 mm的平行段，段间无物理屏障。两侧的通道段宽5 mm、高1 mm，中央通道段宽7 mm、高500 µm。该设计有助于维持一个边界清晰的移动液滴，并形成向后收缩的凸形弯月面。该平台的工作原理已在Pioli等人的研究中进行了详细描述11。如果实验需要填充侧通道（例如在细菌培养的情况下），通常会形成气囊。因此，我们设计并测试了第二种几何结构，以简化当通道被培养基冲洗时的填充过程。在此情况下，平台（图1C）由一条单一的直通道构成，长20 mm、宽3 mm、高500 µm。
微流控通道内的温度是确保高效沉积过程的重要参数。为避免模板上发生冷凝，该温度必须比水的露点高15 °C。通道下方的加热玻.......
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讨论
本文所述的微流控平台能够在PDMS基底上将胶体和细菌等微米级物体排列成预设的空间结构。微流控技术可对环境条件实现全面控制，而sCAPA技术则能够以微米级精度对细胞进行图案化，这使得该平台在未来的生理学和生态学研究中具有广阔的应用前景。
在本研究展示的实验中，硅模板是使用材料表中列出的光刻胶制备的。然而，任何适用于制造所述尺寸范围内结构并可用于PDMS molding的光刻胶均可使用。制备微通道模具所用的3D打印树脂同样如此，任何能够制造所述尺寸结构且与PDMS molding兼容的树脂均可使用。
在本实验方案中，当在细菌或胶体悬浮液中添加 Tween 20 后，将微流控芯片在 70 °C 下储存 5 天，可优化表面亲水性（接触角介于 30 至 60° 之间）。此步骤可确保在这些实验条件下，后退接触角具有最佳的可重复性；然而，其他储存时间和温度也可能有效。
已展示了该微流控技术的两种应用：1）细菌图案化，涉及将细菌细胞单独沉积到PDMS基底.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢瑞士国家科学基金会（SNSF）PRIMA 项目 179834（授予 E.S.）、ETH 研究基金 ETH-15 17-1（R.S.）以及戈登与贝蒂·摩尔基金会关于水生微生物共生关系的研究员奖（项目编号 GBMF9197）（R.S.）提供的支持。作者感谢西班牙格拉纳达大学的 Miguel Angel Fernandez-Rodriguez 博士在细菌扫描电镜成像及深入讨论方面提供的帮助。作者感谢加拿大不列颠哥伦比亚大学的 Jen Nguyen 博士、瑞士苏黎世联邦理工学院的 Laura Alvarez 博士、瑞士苏黎世联邦理工学院的 Cameron Boggon 以及 Fabio Grillo 博士在深入讨论方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel 微加工系统 | 深反应离子刻蚀系统 | |
| Alconox | 洗涤剂 | ||
| AZ400K 显影液 | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL 注射器（鲁尔锁） | BD | 300912 | 用于将新鲜的LB培养基冲洗入微流控通道 |
| 恒温培养箱 | Life Imaging Services | 用于确保通道内温度均匀且恒定 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | 用于将过夜培养的培养基更换为新鲜的最低限度培养基 |
| 离心管 | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | 注射泵 | |
| 直径为 0.98 µm 的荧光聚苯乙烯微粒（红色） | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| 直径为 1.08 µm 的荧光聚苯乙烯微粒（绿色） | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| 直径为 2.07 µm 的荧光聚苯乙烯微粒（绿色） | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| 直径为 2.08 µm 的荧光聚苯乙烯微粒（红色） | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | 用于对 10 cm 硅片进行等离子体处理 | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | 加热玻璃板控制器 | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | 加热玻璃板 | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | 紫外直写激光系统 | |
| 胰岛素注射器，U 100，带鲁尔接头 | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL 注射器，用于在图案化过程中吸取液体悬浮液 |
| Klayout | 开源软件 | 用于设计硅模板上的结构特征 | |
| LB 培养基，Miller 型（Luria-Bertani） | Fisher Scientific | 244610 | 冲洗入微流控通道的LB培养基 |
| Masterflex 转移软管 | Masterflex | HV-06419-05 | 内径 0.020''，外径 0.06'' |
| MOPS（10x） | Teknova | M2101 | 用超纯水稀释十倍后用于替换过夜培养的培养基 |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | 显微镜 | |
| openSCAD | 开源软件 | 用于设计模具 | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | 旋转显影仪 |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | 用于对模板和微通道进行等离子体处理以实现键合 |
| 正性光刻胶 AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma Aldrich | P3786 | 添加至 1x MOPS 溶液中 |
| Prusa 固化与清洗机 CW1S | Prusa | 用于确保所有聚合物完全固化，并从模具中去除未固化的聚合物 | |
| Prusa 树脂 - 坚韧型 | Prusa Research a.s. | 用于 3D 打印的 405 nm 紫外光敏液体树脂 | |
| Prusa SL1 3D 打印机 | Prusa | 用于打印模具 | |
| 天平 | VWR-CH | 611-2605 | 用于称量 PDMS 混合物 |
| 硅片（10 cm） | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 掩模对准器 | SUSS MicroTec Group | 用于对准铬玻璃掩模与基底，并对基底进行曝光 | |
| Sylgard 184 | 道康宁（Dow Corning） | 硅橡胶弹性体套件；固化剂 | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | 铬蚀刻剂 | |
| 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 | Sigma Aldrich | 448931 | 用于对 3D 打印模具进行硅烷化处理 |
| 吐温 20（TWEEN 20） | Sigma Aldrich | P1379 | 用于在图案化过程中确保最佳的退缩接触角 |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | 表面轮廓仪 | |
| VTC-100 真空旋涂仪 | MTI corporation | 真空旋涂仪 |
参考文献
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R.
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重印与许可
