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通过连续毛细辅助组装实现微生物与微粒的图案化

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DOI：

10.3791/63131

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2021年11月4日

 ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zurich, 2Department of Materials, ETH Zurich

本文内容

摘要

我们介绍一种利用微流控平台中毛细作用力辅助组装的技术，可将悬浮在液体中的微米级物体（如细菌和胶体）在聚二甲基硅氧烷基底上排列成预设的阵列。

摘要

将微生物精确地排列成特定的空间结构，为广泛的生物学应用提供了独特的机会，包括对微生物生理学和相互作用的研究。在最基本层面，微生物的精确空间排列将能够对大量单个细胞进行可靠且长期的成像，并显著提升定量研究微生物间距离依赖性相互作用的能力。更进一步，将精确的空间排列与微流控技术所提供的对环境条件的全面控制相结合，将为微生物生态学中的单细胞研究提供一个强大且多功能的平台。

本文介绍了一种微流控平台，可在微流控通道内生成多种且用户自定义的微生物排列图案，实现长期、高通量监测的完全光学可及性。该新型微流控技术基于毛细作用辅助的颗粒组装，利用在微流控通道内受控移动的蒸发悬浮液所产生的毛细力，将单个微米级物体沉积到聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上微加工制成的阵列化捕获结构中。通过连续沉积，可根据捕获结构的几何形状和填充顺序，生成由单一或多种微米级物体构成的特定空间排布。

该平台已使用不同尺寸和材料的胶体颗粒进行校准，被证明是生成多种胶体图案并对捕获颗粒进行表面功能化的有力工具。此外，该平台已在微生物细胞上进行了测试，以大肠杆菌（Escherichia coli）作为模式细菌。数千个单个细胞在表面被有序排列，并对其生长过程进行了实时监测。在此平台上，单细胞沉积与微流控技术的结合，既可实现微生物的几何图案化，又能精确控制其环境条件。因此，该技术为研究单个微生物的生理特性以及微生物间相互作用的生态学提供了新的窗口，初步实验已证实了其应用潜力。

引言

在多种研究背景下，对单个微生物进行空间排布，尤其是在能够完全控制环境条件的实验装置（如微流控设备）中实现这一目标，具有重要意义。 例如，将微生物排列成规则阵列，有助于对大量单个细胞进行精确成像，进而研究其生长、生理状态、基因表达对环境刺激的响应以及药物敏感性。此外，这种方法还能在完全控制细胞间相对空间位置的前提下，研究细胞间的相互作用，这在细胞通讯（如群体感应）、交叉喂养（如藻菌共生）或拮抗作用（如化感作用）等研究中尤为重要。细胞生理学与进化研究1、细胞间相互作用研究2、表型分化筛选3、环境监测4以及药物筛选5等领域均可从能够实现此类定量单细胞分析的技术中显著受益。

近年来，已提出多种用于分离和操作单个细胞的策略，包括全息光镊6、异质表面功能化方法7,8,9,10、单细胞恒化器11以及液滴微流控技术12。这些方法要么在技术上要求极高，要么会影响细胞生理状态，且无法提供一种高通量的平台，以实现对微生物进行长期研究时的空间排布，同时保证单细胞分辨率、完全的光学通路以及对环境条件的精确控制。本文旨在介绍一种基于毛细作用辅助组装的平台，可在聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面以微米级精度将细菌排列成预设的空间结构。该平台具有微流控特性，能够实现对微生物精确且灵活的空间排布，并提供完全的光学通路以及对环境条件的精确调控能力。

该平台背后的技术是一种近年来开发的组装技术，名为sCAPA13,14,15（顺序毛细辅助粒子组装），已集成到微流控平台中16。在微流控通道内，蒸发液滴的弯月面在退缩过程中经过图案化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底时，会产生毛细作用力，将悬浮在液体中的单个胶体粒子捕获到基底上微加工制成的微米级孔穴中（图1A）。悬浮粒子首先通过对流将粒子输运至气-液界面，随后由毛细作用将其置入捕获位点。与粒子间相互作用所涉及的力相比，移动弯月面施加的毛细力作用范围更大。

因此，组装机制不受颗粒的材料、尺寸和表面特性的影响。只有颗粒浓度、弯月面移动速度、温度以及悬浮液的表面张力等参数会影响图案化过程的产率。读者可在文献13,14,15中找到上述参数对图案化过程影响的详细描述。在原始的sCAPA技术13,14,15中，胶体图案化过程是在开放系统中进行的，并需要高精度的压电平台来驱动悬浮液通过模板。本平台采用了一种不同的策略，可在受控环境中利用微流控领域常用的常规设备完成图案化，从而最大限度地降低样品污染的风险。

该微流控平台首先在胶体颗粒上进行优化，以形成规则的惰性颗粒阵列，随后成功应用于细菌。本文描述了这两种微流控平台（图1B，C）。该实验方案中所述的大部分准备步骤和实验设备在两种应用中是共用的（图2）。我们报告了胶体图案化过程，以证明该技术可用于在同一表面上进行多次顺序沉积，从而构建结构复杂、多材料的图案。具体而言，每一步骤中每个捕获陷阱仅沉积一个颗粒，所形成的胶体阵列的几何形状和组成完全由陷阱的几何结构及填充顺序决定。至于细菌图案化，本文描述的是单次沉积，每个陷阱中沉积一个细菌。细胞在表面完成图案化后，用培养基冲洗微流控通道，以促进细菌生长，这是任何单细胞研究的初步步骤。

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方案

1. 硅胶母版制备

注意：用于胶体和微生物图案化的含微加工捕获结构的PDMS模板，其制备方法参照Geissler等.17 所介绍的方法进行。硅模板在洁净室中通过常规光刻技术制备。具体步骤见下文，所需设备见材料表。

  1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计结构特征。
  2. 通过紫外直接激光写入设备对设计好的结构进行曝光，制备带有正性光刻胶层的铬玻璃掩模。
    1. 使用显影液以1:4的光刻胶与水比例，通过旋转显影仪对铬玻璃掩模显影15秒。
    2. 将掩模浸入铬刻蚀液中50秒。
    3. 对10 cm硅片进行等离子体处理，功率为600 W，持续3分钟。
    4. 气相沉积一层六甲基二硅氮烷，并在110 °C下烘烤，以增强光刻胶的附着力。
    5. 以4,500 × g转速旋涂一层光刻胶，持续2分钟。
    6. 使用掩模对准器，通过铬玻璃掩模将结构用紫外光曝光2秒，并使用与掩模相同的显影液进行显影。
  3. 为完成硅模板的制备，通过深反应离子刻蚀对硅片进行刻蚀，调节刻蚀时间（<2 min）以达到所需深度（用轮廓仪测量）。

2. 微通道模具制备

  1. 使用 CAD 软件设计通道，并使用切片软件对通道进行切片，将设计好的模型转换为 3D 打印机的打印指令，切片距离设置为 0.05 mm。
  2. 使用 3D 打印机打印通道，耗时约 1 小时。
  3. 在专用的固化和清洗设备中清洗并进行后固化处理。
    1. 将模具放入装有纯异丙醇（IPA）的容器中，涡旋液体（清洗 20 分钟）。将装有 IPA 的容器从机器中取出。
    2. 将清洗后的模具从 IPA 容器中取出后，重新放回清洗和固化设备中，在 35 °C 下后固化 15 分钟。
      注： 材料表 列出了模具制备方案中所使用的 3D 打印机及固化和清洗设备。3D 模型使用 3D 打印机专用的切片软件进行切片。
  4. 将打印件置于紫外烘箱中 12 小时，随后在 80 °C 的烘箱中放置 12 小时。
    注：此步骤可确保所有聚合物完全固化，并去除打印件中未固化的聚合物，否则会阻碍 PDMS 的固化。
  5. 通过三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷的蒸气沉积法对模具进行硅烷化处理。
    1. 将 3D 模具与 20 µL 100% 浓度的三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷一同放入真空干燥器中，硅烷需滴加在靠近模具的铝箔上。
    2. 在干燥器中抽真空以产生蒸气，静置 40 分钟。
    3. 将模具从干燥器中取出，并在浇注 PDMS 前用纯乙醇冲洗。

3. 微流控芯片的制备

  1. 通过将弹性体与其交联剂混合来制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物（材料表）。充分搅拌混合物，使两种组分均匀混合，直至产生气泡，且PDMS混合物呈现不透明状。
    注意：交联剂的用量应为弹性体质量的10%。
  2. 将弹性体与交联剂的混合物置于真空干燥器中脱气，以去除其中夹带的气泡。将干燥器中的混合物转移至用于混合的容器中（步骤3.1）。持续脱气过程，直至所有气泡被完全去除，混合物再次呈现透明状态。
    注意：通常脱气所需时间为30分钟。
  3. 将3 g该混合物倒入硅模板上，以制备将作为微流控芯片"底板"的模板。
    注意：可通过改变倒在硅模板上的混合物的量来调节PDMS层的厚度。
    1. 为获得厚度为400 µm的模板，将3 g PDMS倒在硅模板上，将硅模板置于旋涂仪上，以21 × g 转速旋涂5秒，再以54 × g 转速旋涂10秒，然后按照步骤3.2所述再次进行脱气，以去除夹带的气泡。
  4. 将20 g PDMS混合物倒入3D打印模具中，以制作将作为微流控芯片"顶板"的微通道，并按照步骤3.2所述进行30分钟的脱气处理。
  5. 将硅片和3D打印模具在70 °C下烘烤至少2小时。
  6. 从3D打印模具上剥离PDMS层，用刀片沿微通道周围切割PDMS，并打孔以作为微流控通道的入口和出口。
  7. 从硅模板上剥离PDMS，并将PDMS层切割成与待键合在模板上方的微流控通道尺寸相同的小片。
  8. 使用1%的洗涤剂溶液（见材料表）轻轻擦拭模板和微通道5分钟，然后用去离子水冲洗。接着用异丙醇冲洗模板和微通道，再用去离子水冲洗。在室温下用1 bar的压缩空气吹干1分钟。
  9. 将模板和微通道放入等离子清洗机中，待键合的表面朝上。打开等离子清洗机，对模板和微通道进行40秒的等离子处理。从等离子清洗机中取出后，立即将微通道与模板对准并接触，完成键合。
  10. 将微流控芯片置于70 °C的烘箱中保存五天，以确保PDMS恢复疏水性，并使后退接触角处于30°至60°之间的最佳范围内10,11。

4. 细菌图案化

  1. 实验前一天，培养一批细胞群体 大肠杆菌 （菌株 MG1655 prpsM-GFP）。直接从冻存菌种接种培养物，在含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB（Lysogeny broth）培养基中，于 37 °C 摇床培养箱中培养 20 小时。添加卡那霉素以确保细胞保留 prpsM-GFP 质粒。
  2. 实验当天，将箱式培养箱（图2A) 在实验前数小时于37 °C下预热，以确保实验开始前温度均匀且稳定。在显微镜载物台上安装注射泵和加热玻璃板（图2B，C），将温度设定为与箱式培养箱相同的温度。
    注意：整个系统（包括显微镜）所在的培养箱图2E），可确保在通道用培养基冲洗时，整个实验过程中保持均匀且恒定的温度。
  3. 实验开始前90分钟，将微流控芯片置于盛有100%乙醇（EtOH）的容器中，用100% EtOH冲洗通道至少10分钟。将微流控芯片放入真空干燥器中，脱气至少30分钟。用蒸馏水替换乙醇，并在真空条件下处理芯片至少30分钟。将微流控芯片放入70 °C烘箱中加热10分钟，以去除通道中残留的任何液体痕迹。
    注意： 此步骤对于防止用培养基冲洗通道时产生气泡是必要的。该防气泡方案改编自 Wang 等人的研究。18.
  4. 移液1 mL的3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）培养基（1×）加入离心管中，再加入10 µL 0.132 M 磷酸钾（K2HPO4）。将过夜培养物从37 °C培养箱中取出，分装100 µL至离心管中，在2,300 × g 孵育2分钟。用移液器小心吸出离心管中的上清液，将沉淀重悬于1 mL新鲜MOPS培养基中，培养基中含0.015% v/v Tween 20和0.01% v/v磷酸钾。
    注意：细菌悬液的典型浓度范围为0.015–0.15 vol%，该浓度可确保形成延展且可移动的聚集区，并防止颗粒在基底上沉积。用新鲜培养基替换过夜培养基可最大限度降低细菌膜在模板上释放的风险。新鲜培养基中不含碳源，可防止细胞在模板图案化过程中于悬液中生长。悬液中需含有0.015% v/v的Tween 20，以使退去液体在PDMS模板上的接触角处于30°至60°之间的最佳范围。
  5. 将细菌悬液加入1 mL注射器中，并通过微流控管路将注射器连接至芯片。
    1. 为确保注射器与管路连接牢固，将外径为0.6 mm的针头直接插入管路中。为避免残留在入口附近的悬浮液在图案化过程中沿通道扩散，需通过用作出口的孔冲洗新鲜培养基图3A-III），而不是用作入口的孔。
    2. 将注射器安装到注射泵上，通过通道上游入口处的进样口向微流控芯片中注入悬浮液，直至悬浮液覆盖含有捕获结构的模板区域。
      注意：在液体注入过程中，空气可通过位于通道下游末端的出口逸出。
    3. 将注射泵设置为抽取细菌悬液（图3A- I) 以0.07–0.2 µL/min的流速，该流速在所述几何条件下对应弯月面后退速度为80–100 µm/min。
    4. 通过显微镜软件监测图案化过程。
      注意：此处使用10倍放大倍率监测模板上弯月面的后退情况，使用20倍放大倍率监测单个细菌在微加工捕获结构中的沉积过程。
  6. 一旦模板上已用细胞形成图案（图3A-II)，增加回吸流速，快速排空微流控通道，并用已预先脱气至少30分钟并预热至30 °C的新鲜LB培养基冲洗。
  7. 将注射泵的流速设为2 µL/min，以缓慢冲洗通道。待通道充满后，根据具体实验需求增加流速至15 µL/min。
  8. 以所需的放大倍数和时间间隔获取正在生长的细菌的图像。

5. 胶体图案化

  1. 用移液器将900 µL的0.015% v/v Tween 20水溶液加入离心管中，再向其中加入100 µL原始胶体悬浮液。在13,500 × g 条件下离心1分钟。轻轻移除上清液，并替换为0.015% v/v的Tween 20水溶液。重复此过程三次，以确保完全替换原始胶体悬浮液中的供应商溶剂。
  2. 将胶体悬浮液装入1 mL注射器中，并通过微流控管路将注射器连接至芯片。从通道上游中央区域的入口处将悬浮液注入微流控芯片中，并缓慢推动悬浮液，直至模板表面被完全覆盖。
  3. 以0.07–0.2 µL/min的流速回抽胶体悬浮液，对应弯月面后退速度为1–2 µm/min，并通过显微镜软件对图案化过程进行成像。使用10倍放大倍数监测模板上弯月面的后退情况，使用20倍放大倍数观察单个颗粒在微加工捕获结构中的沉积过程。当弯月面到达模板末端时，提高流速以快速排空通道。
    注意：通过依次执行步骤5.1至5.3，可制备由多个颗粒组成的胶体阵列。每次循环根据所需胶体阵列的组成，向通道中加载新的胶体悬浮液。每个图案化步骤向胶体阵列中添加一个颗粒，可连续进行，直至捕获结构中填入所需的颗粒序列。最终胶体阵列的组成完全由用于填充捕获结构的胶体悬浮液序列决定（图3B）。

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结果

开发了一种微流控平台，该平台利用毛细作用辅助组装技术，将胶体颗粒和细菌排列并捕获在聚二甲基硅氧烷（PDMS）模板上微加工制备的捕获结构中。设计了两种不同的通道几何结构，以优化通过毛细作用辅助组装实现的胶体和细菌图案化。第一种通道几何结构（图1B）包含三个长度均为23 mm的平行段，各段之间无物理屏障。两侧的两个通道段宽5 mm、高1 mm，而中央通道段宽7 mm、高500 µm。该设计有助于维持一个边界清晰的移动液滴，并形成后退的凸形弯月面。该平台的工作原理已在Pioli等人的研究中得到详细描述11。如果实验需要填充侧边通道（例如在细菌培养的情况下），通常会形成气泡。因此，我们设计并测试了第二种几何结构，以简化当通道被培养基冲洗时的填充过程。在这种情况下，平台（图1C）由一条单一的直通道构成，长度为20 mm，宽度为3 mm，高度为500 µm。

微流控通道内的温度是确保高效沉积过程的重要参数。温度必须比水的露点高1...

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讨论

本文所述的微流控平台能够在PDMS基底上将胶体和细菌等微米级物体排列成预设的空间结构。微流控技术可对环境条件实现全面控制，而sCAPA技术则能够以微米级精度对细胞进行图案化，这使得该平台在未来的生理学和生态学研究中具有广阔的应用前景。

在本研究展示的实验中，硅模板是使用材料表中列出的光刻胶制备的。然而，任何适用于制造所述尺寸范围内结构并可用于PDMS molding的光刻胶均可使用。制备微通道模具所用的3D打印树脂同样如此，任何能够制造所述尺寸结构且与PDMS molding兼容的树脂均可使用。

在本实验方案中，当在细菌或胶体悬浮液中添加 Tween 20 后，将微流控芯片在 70 °C 下储存 5 天，可优化表面亲水性（接触角介于 30 至 60° 之间）。此步骤可确保在这些实验条件下，后退接触角具有最佳的可重复性；然而，其他储存时间和温度也可能有效。

已展示了该微流控技术的两种应用：1）细菌图案化，涉及将细菌细胞单独沉积到PDMS基底...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢瑞士国家科学基金会（SNSF）PRIMA 项目 179834（授予 E.S.）、ETH 研究基金 ETH-15 17-1（R.S.）以及戈登与贝蒂·摩尔基金会关于水生微生物共生关系的研究员奖（项目编号 GBMF9197）（R.S.）提供的支持。作者感谢西班牙格拉纳达大学的 Miguel Angel Fernandez-Rodriguez 博士在细菌扫描电镜成像及深入讨论方面提供的帮助。作者感谢加拿大不列颠哥伦比亚大学的 Jen Nguyen 博士、瑞士苏黎世联邦理工学院的 Laura Alvarez 博士、瑞士苏黎世联邦理工学院的 Cameron Boggon 以及 Fabio Grillo 博士在深入讨论方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alcatel AMS 200SE I-SpeederAlcatel 微加工系统深反应离子刻蚀系统
Alconox洗涤剂
AZ400K 显影液MicroChemicalsAZ400K
BD 10 mL 注射器（鲁尔锁）BD300912用于将新鲜的LB培养基冲洗入微流控通道
恒温培养箱Life Imaging Services用于确保通道内温度均匀且恒定
离心机Eppendorf5424R用于将过夜培养的培养基更换为新鲜的最低限度培养基
离心管Eppendorf301200861.5 mL
CETONI Base 120CETONI GmbH注射泵
直径为 0.98 µm 的荧光聚苯乙烯微粒（红色）microParticles GmbHPS-FluoRed-Fi267
直径为 1.08 µm 的荧光聚苯乙烯微粒（绿色）microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi182
直径为 2.07 µm 的荧光聚苯乙烯微粒（绿色）microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi183
直径为 2.08 µm 的荧光聚苯乙烯微粒（红色）microParticles GmbHPS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 MPVA TePla用于对 10 cm 硅片进行等离子体处理
H401-T-CONTROLLEROkolab加热玻璃板控制器
H601-NIKON-TS2R-GLASSOkolab加热玻璃板
Heidelberg DWL 2000Heidelberg Instruments紫外直写激光系统
胰岛素注射器，U 100，带鲁尔接头Codan Medical ApSCODA6216401 mL 注射器，用于在图案化过程中吸取液体悬浮液
Klayout开源软件用于设计硅模板上的结构特征
LB 培养基，Miller 型（Luria-Bertani）Fisher Scientific244610冲洗入微流控通道的LB培养基
Masterflex 转移软管MasterflexHV-06419-05内径 0.020''，外径 0.06''
MOPS（10x）TeknovaM2101用超纯水稀释十倍后用于替换过夜培养的培养基
Nikon Eclipse Ti2Nikon Instruments显微镜
openSCAD开源软件用于设计模具
OPTIspin SB20ATM group51-0002-01-00旋转显影仪
Plasma chamber ZeptoDiener ElectronicZEPTO-1用于对模板和微通道进行等离子体处理以实现键合
正性光刻胶 AZ1505MicroChemicalsAZ1505
磷酸氢二钾Sigma AldrichP3786添加至 1x MOPS 溶液中
Prusa 固化与清洗机 CW1SPrusa用于确保所有聚合物完全固化，并从模具中去除未固化的聚合物
Prusa 树脂 - 坚韧型Prusa Research a.s.用于 3D 打印的 405 nm 紫外光敏液体树脂
Prusa SL1 3D 打印机Prusa用于打印模具
天平VWR-CH611-2605用于称量 PDMS 混合物
硅片（10 cm）Silicon Materials Inc.N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 掩模对准器SUSS MicroTec Group用于对准铬玻璃掩模与基底，并对基底进行曝光
Sylgard 184道康宁（Dow Corning）硅橡胶弹性体套件；固化剂
Techni Etch Cr01Technic铬蚀刻剂
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷Sigma Aldrich448931用于对 3D 打印模具进行硅烷化处理
吐温 20（TWEEN 20）Sigma AldrichP1379用于在图案化过程中确保最佳的退缩接触角
Veeco Dektak 6 MVeeco表面轮廓仪
VTC-100 真空旋涂仪MTI corporation真空旋涂仪

参考文献

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