通过顺序毛细管辅助组装对微生物和微粒进行图案化

Summary

我们提出了一种技术，该技术在微流体平台中使用毛细管辅助组装，将悬浮在液体中的微尺寸物体（例如细菌和胶体）图案化为聚二甲基硅氧烷衬底上的规定阵列。

Abstract

将微生物控制模式化为定义的空间排列，为广泛的生物学应用提供了独特的可能性，包括微生物生理学和相互作用的研究。在最简单的层面上，微生物的精确空间图案化将实现对大量单个细胞的可靠，长期成像，并改变定量研究距离依赖性微生物 - 微生物相互作用的能力。更独特的是，结合微流体技术提供的精确空间图案和对环境条件的完全控制，将为微生物生态学中的单细胞研究提供一个强大而通用的平台。

本文提出了一个微流体平台，用于在微流体通道内产生多功能和用户定义的微生物模式，从而允许完整的光学访问以进行长期，高通量的监测。这种新的微流体技术基于毛细管辅助颗粒组装，并利用微流体通道内蒸发悬浮液的受控运动产生的毛细管力，将单个微尺寸物体沉积在微细加工到聚二甲基硅氧烷（PDMS）底物上的一系列陷阱中。顺序沉积生成单个或多个类型的微型物体的所需空间布局，仅由陷阱的几何形状和填充顺序决定。

该平台已使用不同尺寸和材料的胶体颗粒进行校准:它已被证明是生成各种胶体图案并执行捕获颗粒表面功能化的强大工具。此外，该平台在微生物细胞上进行了测试，使用 大肠 杆菌细胞作为模型细菌。成千上万的单个细胞被图案化在表面上，并随着时间的推移监测它们的生长。在这个平台上，单细胞沉积和微流体技术的耦合允许微生物的几何图案化和环境条件的精确控制。因此，它为单个微生物的生理学和微生物 - 微生物相互作用的生态学打开了一扇窗，如初步实验所示。

Introduction

单个微生物的空间模式化，特别是在能够完全控制环境条件的实验领域，如微流体装置，在广泛的背景下是非常可取的。例如，将微生物排列成规则的阵列将允许对大量单个细胞进行精确成像，并研究它们的生长，生理学，响应环境刺激的基因表达和药物敏感性。它还允许研究对细胞通讯（例如，群体感应），交叉喂养（例如，藻类 - 细菌共生）或拮抗（例如，化感作用）特别感兴趣的细胞 - 细胞相互作用，并完全控制细胞相对于彼此的空间定位。细胞生理学和进化研究¹，细胞 - 细胞相互作用研究²，表型分化筛选³，环境监测⁴和药物筛选⁵ 是能够实现这种定量单细胞分析的技术可以极大地受益的领域。

近年来，从全息光学陷阱⁶和异质表面功能化方法^7，8，⁹，¹⁰到单细胞化学抑制剂¹¹和液滴微流体^12，已经提出了几种分离和处理单细胞的策略。这些方法要么在技术上要求很高，要么会影响细胞生理学，并且无法提供高通量平台来对可以长期研究的微生物进行模式分析，从而确保单细胞分辨率，完全光学访问和对环境条件的控制。本文的目的是描述一个平台，通过毛细管辅助组装，以微米精度将细菌图案化到PDMS表面上规定的空间排列中。该平台允许对微生物进行精确而灵活的空间图案化，并由于其微流体特性而能够完全光学访问和控制环境条件。

该平台背后的技术是近年来开发的组装技术，名为sCAPA13^，14，15（顺序毛细管辅助颗粒组装），被集成到微流体平台¹⁶中。蒸发液滴的半月板在微流体通道内的图案化聚二甲基硅氧烷（PDMS）底物上后退时，施加毛细管力，将悬浮在液体中的单个胶体颗粒捕获到基板上微细加工的微孔中（图1A）。悬浮颗粒首先通过对流输送到气液界面，然后通过毛细管进入陷阱。与粒子相互作用中涉及的力相比，移动半月板施加的毛细管力的作用范围更大。

因此，装配机制不受颗粒的材料、尺寸和表面特性的影响。颗粒浓度、弯月板速度、温度和悬浮液表面张力等参数是影响图案化过程产量的唯一参数。读者可以在^13，14，¹⁵中找到上述参数对图案化过程影响的详细说明。在最初的sCAPA技术^13，14，15中，胶体图案化过程在开放系统中进行，并且需要高精度压电级来驱动悬架穿过模板。该平台利用不同的策略，并允许在受控环境中使用通常用于微流体的标准设备进行图案化，从而最大限度地降低污染样品的风险。

这种微流体平台首先在胶体颗粒上进行优化，以创建常规的惰性颗粒阵列，然后成功应用于细菌。本文描述了这两种微流体平台（图1B，C）。方案中描述的大多数准备步骤和实验设备对于这两种应用都是通用的（图2）。我们报告了胶体图案化，以证明该技术可用于在同一表面上执行多个顺序沉积，以创建复杂的多材料图案。特别是，每个陷阱每个步骤沉积一个颗粒，以形成具有特定几何形状和组成的胶体阵列，完全由陷阱的几何形状和填充顺序决定。至于细菌模式，描述了单个沉积，导致每个陷阱沉积一个细菌。一旦细胞在表面上被图案化，微流体通道就会被培养基冲洗以促进细菌生长，这是任何单细胞研究的初步步骤。

Protocol

1. 硅母站制备

注:带有构成胶体和微生物图案模板的微细结构疏水阀的PDMS模板是根据Geissler等人引入的方法制造的。¹⁷. 硅母模是在洁净室中通过常规光刻法制备的。有关步骤和设备 的材料表 ，请参阅以下步骤。

1. 使用计算机辅助设计 （CAD） 软件设计功能。
2. 使用紫外直接激光刻录机曝光设计的特征，用一层正向光刻胶准备铬玻璃掩模。
   1. 使用旋转显影剂以 1:4 光刻胶与水的比例开发 15 s 的显影剂，开发铬玻璃掩模。
   2. 将面膜浸入铬蚀刻剂中50秒。
   3. 等离子体处理10 cm硅晶圆，在600 W下3分钟。
   4. 气相沉积一层六甲基二硅氮烷，并在110°C下烘烤，以提高对光刻胶的附着力。
   5. 在4，500× g 下沉积一层光刻胶2分钟。
   6. 使用掩模对准器通过镀铬玻璃掩模将该特征暴露在UV下2秒，并与开发人员一起开发掩模。
3. 为了完成硅母版的制造，通过深度反应离子交换蚀刻晶圆，调整蚀刻时间（<2分钟）以达到所需的深度（使用轮廓仪测量）。

2. 微通道模具制备

1. 使用CAD软件设计通道，并使用切片器软件对其进行切片，以将设计的模型转换为3D打印机的说明，将切片距离设置为0.05 mm。
2. 使用3D打印机打印通道约1小时。
3. 在专用的固化和洗衣机中清洗和后固化霉菌。
   1. 将模具放入装有纯异丙醇（IPA）的容器中，涡旋液体（洗涤20分钟）。将装满IPA的容器从机器中取出。
   2. 一旦洗涤的模具从IPA容器中取出，将其放回洗涤和固化机中，并在35°C下后固化15分钟。
      注: 材料表 报告了模具制备方案中使用的3D打印机以及固化和洗衣机。3D模型是用3D打印机的专有切片机软件切片的。
4. 将打印件放入UV烤箱中12小时，然后将其置于80°C的烤箱中12小时。
   注意:此步骤可确保所有聚合物都固化，并且所有未固化的聚合物都从打印件中移除，因为它会阻止PDMS固化。
5. 通过三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷的气相沉积使模具硅烷化。
   1. 将3D模具与20μL100%浓缩三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷一起放入真空干燥器中，移液在靠近模具的铝箔上。
   2. 在干燥器中产生真空以产生蒸汽并离开40分钟。
   3. 从干燥器中取出模具，用纯乙醇冲洗，然后倒入PDMS。

3. 微流控芯片的制造

1. 通过将弹性体与其交联剂混合来制备PDMS混合物（材料表）。用力搅拌混合物以均匀地混合两种组分，直到形成气泡，并且PDMS混合物看起来不透明。
   注:交联剂的用量应为弹性体用量的10重量%。
2. 在真空干燥器中对弹性体和交联剂的混合物进行脱气，以除去被困的气泡。将干燥器中的混合物转移到用于混合的容器中（步骤3.1）。继续脱气过程，直到所有气泡都被除去，混合物看起来再次透明。
   注意:干燥通常需要30分钟。
3. 将3g混合物倒在硅母头上以产生模板，该模板将用作微流控芯片的"地板"。
   注意:PDMS层的厚度可以通过改变倒在硅母板上的混合物量来调整。
   1. 要获得400μm厚的模板，将3gPDMS倒在硅母板上，将硅母模放在旋转涂层机上，并以21× g 旋转涂层5 s和54 × g 旋转10 s，然后按照步骤3.2中所述再次脱气以除去捕获的气泡。
4. 将20gPDMS混合物倒在3D打印模具上以制作微通道，该微通道将用作微流控芯片的"屋顶"，并按照步骤3.2中所述将其脱气30分钟。
5. 将硅晶圆和3D打印模具在70°C下烘烤至少2小时。
6. 将PDMS层从3D打印模具上剥离，用刀片在微通道周围切割PDMS，然后打孔，作为微流体通道的入口和出口。
7. 将PDMS从硅母板上剥离出来，并将PDMS层切割成更小的碎片，这些碎片具有相同尺寸的微流体通道，这些微流体通道将粘合在模板的顶部。
8. 使用1%洗涤剂溶液（见 材料表）轻轻擦拭模板和微孔5分钟，然后用去离子水冲洗。接下来，用异丙醇冲洗模板和微通道，并用去离子水冲洗。将模板和微通道在室温下用1 bar的压缩空气干燥1分钟。
9. 将模板和微通道放入等离子清洗机中，使要粘合的表面朝上。打开等离子清洗机，等离子体处理模板和微通道40秒。将它们从等离子清洗机中取出，并通过使它们彼此接触，立即将微通道粘合在模板顶部。
10. 将微流控芯片在70°C的烘箱中储存五天，以确保PDMS疏水回收，并在30至60°^10，11之间的最佳范围内具有后退的接触^角。

4. 细菌图案化

1. 在实验前一天，生长一种群 大肠杆菌 （菌株MG1655 prpsM-GFP）。直接从冷冻的培养物中接种培养物，并在37°C的振荡器培养箱中的溶菌汤（LB）培养基中生长20小时。 为细胞加入50μg/ mL卡那霉素以保留prpsM-GFP质粒。
2. 在实验当天，在实验开始前几个小时将箱式培养箱（图2A）设置为37°C，以具有均匀稳定的温度。在显微镜载物台上设置注射器泵和加热的玻璃板（图2B，C），将温度设置为与箱式培养箱相同的温度。
   注:封闭整个系统（包括显微镜）的箱式培养箱（图2E）确保在通道与培养基冲洗时，在整个实验过程中保持均匀恒定的温度。
3. 在实验前90分钟，将微流控芯片放入充满100%乙醇（EtOH）的容器中，并用100%EtOH冲洗通道至少10分钟。将微流控芯片置于真空干燥器中并脱气至少30分钟。将EtOH与蒸馏水交换，并对芯片进行至少30分钟的真空处理。将微流控芯片置于70°C的烘箱中10分钟，以除去通道中残留的任何液体痕迹。
   注意:此步骤对于防止用培养基冲洗时通道中形成气泡是必要的。该气泡预防方案改编自Wang等人¹⁸。
4. 将1mL 3-（N-吗啉基）丙烷磺酸（MOPS）培养基（1x）移液到离心机小瓶中，加入10μL0.132M磷酸钾（_K2HPO4）。将过夜培养物从37°C培养箱中取出，等分100μL放入离心机小瓶中，并以2，300×g离心培养物2分钟。轻轻地将上清液从离心机小瓶中移出，并将沉淀重悬于1mL新鲜MOPS培养基中，其中吐温20的0.015%v / v和0.01%v / v的磷酸钾。
   注意:细菌悬浮液的典型浓度在0.015-0.15体积%的范围内，这确保了形成一个扩展和移动的积累区，并防止颗粒在基质上积聚。用新鲜培养基代替过夜培养基可最大限度地降低在模板上释放细菌膜的风险。新鲜培养基中缺乏碳源会阻止细胞在模板图案化过程中在悬浮液中生长。悬浮液中吐温 20 的浓度为 0.015% v/v，对于 PDMS 模板上后退液体的接触角在 30 和 60° 之间的最佳范围内是必要的。
5. 将细菌悬浮液装入1 mL注射器中，并通过微流体管将注射器连接到芯片上。
   1. 要固定注射器和管子之间的连接，请直接将外径为0.6 mm的针头插入管中。为避免将留在入口附近的任何悬浮液散布到通道上，请将新鲜介质冲洗穿过图案化过程中用作出口的孔（图3A-III），而不是用作入口的孔。
   2. 将注射器安装在注射器泵上，并通过位于通道上游部分的入口将悬浮液注入微流控芯片中，直到悬浮液用陷阱覆盖模板区域。
      注:在液体注入过程中，空气可以通过位于通道下游端的出口逸出。
   3. 将注射泵设置为以0.07-0.2μL / min的流速抽出细菌悬浮液（图3A-I），在所述几何形状中对应于80-100μm / min的半月板后退速度。
   4. 通过显微镜软件监控图案化过程。
      注意:此处，使用10倍放大倍率来监测模板上后退的半月板，并使用20倍放大倍率监测单个细菌沉积到微细制陷阱中。
6. 一旦模板用细胞图案化（图3A-II），增加退出流速以快速清空微流体通道，并用先前脱气至少30分钟并在30°C下预热的新鲜LB冲洗它。
7. 将注射泵设置为2μL/min的流速，以轻轻冲洗通道。一旦通道被填满，根据特定的实验需要增加流速（15μL/min）。
8. 以所需的放大倍率和时间间隔获取细菌生长的图像。

5. 胶体图案

1. 将900μL的0.015%v / v吐温20水溶液移入离心机小瓶中，并将100μL的原始胶体悬浮液移入其中。将悬浮液以13，500× g 离心1分钟。轻轻除去上清液，并用吐温20（0.015%v / v）水溶液代替。重复此过程三次，以确保从库存悬浮液中完全更换供应商的溶剂。
2. 将胶体悬浮液装入1 mL注射器中，并通过微流体管将注射器连接到芯片。通过位于中央部分的入口，在通道的上游部分，将悬浮液注入微流控芯片中，并逐渐推动悬浮液直到模板被覆盖。
3. 以0.07-0.2μL/min的流速（对应于1-2μm/min的半月板后退速度）取出胶体悬浮液，并通过显微镜软件对图案化过程进行成像。使用 10 倍放大倍率监测模板上后退的半月板，使用 20 倍放大倍率观察单个颗粒在微加工陷阱中的沉积情况。一旦半月板到达模板的末端，增加流速以快速清空通道。
   注:由多个颗粒组成的胶体阵列可以通过串联运行步骤5.1至5.3的图案化过程来生产。通道在每次迭代时根据所需的胶体阵列组成加载新的胶体悬浮液。每个图案化步骤都会向胶体阵列添加一个粒子，并且可以按顺序运行，直到陷阱被所需的粒子序列填充。所得胶体阵列的组成仅由用于填充陷阱的胶体悬浮液序列给出（图3B）。

Results

开发了一种微流体平台，该平台利用毛细管辅助组装将胶体颗粒和细菌图案化为PDMS模板上微制造的陷阱。设计了两种不同的通道几何形状，以通过毛细管辅助组件优化胶体和细菌的图案化。第一个通道几何形状（图1B）由三个23毫米长的平行部分组成，它们之间没有物理屏障。侧面的两个部分宽5毫米，高1毫米，而中心部分宽7毫米，高500微米。这种设计有助于保持具有后退凸形半月板的明确定义的移动液滴。Pioli等人¹¹详细描述了该平台的工作原理。如果实验需要填充侧通道，例如在细菌培养的情况下，通常会形成气穴。出于这个原因，我们设计并测试了第二种几何形状，当通道被介质冲洗时，它简化了填充过程。在这种情况下，平台（图1C）由一个20 mm长，3 mm宽和500μm高的直通道组成。

微流体通道中的温度是确保高效沉积过程的重要参数。必须保持在水露点以上15°C，以避免模板上结露。通道下方的加热玻璃板（图2D...

Discussion

这里描述的微流体平台允许将微尺寸的物体（如胶体和细菌）图案化为PDMS底物上规定的空间排列。微流体对环境条件的完全控制以及sCAPA技术赋予的以微米精度对细胞进行图案化的能力使其成为未来生理学和生态学研究的非常有前途的平台。

在这项工作中提出的实验中，使用 材料表中报告的光刻胶实现了硅母版。但是，可以使用任何适合在所描述的尺寸范围内产生特征的光刻胶，并且可以在PDMS成型中使用。这同样适用于用于制备微通道模具的3D打印树脂。可以使用任何能够产生所述尺寸的特征并与PDMS成型兼容的树脂。

在该协议中，将微流控芯片在70°C下储存5天可优化表面亲水性（接触角落在30至60°之间），当吐温20加入细菌或胶体悬浮液中时。该程序确保了在这些实验条件下后退接触角的最佳再现性;但是，其他储存时间和温度也可能有效。

已经提出了这种微流体技术的两种应用:1）细菌图案化涉及细菌细胞的单个沉积到PDMS底物上的陷阱中，以及2）胶体图案化涉及胶体的顺序沉积，获得...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
阿尔卡特 AMS 200SE I-Speeder	阿尔卡特微加工系统		深度反应离子交换系统
Alconox			洗涤剂
AZ400K 显影	MicroChemicals	AZ400K
BD 10 mL 注射器（鲁尔锁）	BD	300912	用于将新鲜溶原肉汤冲洗到微流体通道中
箱式培养箱	寿命成像服务		用于确保通道中温度均匀恒定
	离心机 Eppendorf	5424R	用于用新鲜的最小培养基替换过夜培养基
离心瓶	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI	GmbH		注射泵
直径为 0.98 &微米的荧光 PS 颗粒;m （red）	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi267
直径为 1.08 µ 的荧光 PS 颗粒;m （green）	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi182
直径为 2.07 µ 的荧光 PS 颗粒;m （green）	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi183
直径为 2.08 µ 的荧光 PS 颗粒;m （红色）	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M	PVA TePla		用于等离子处理 10 cm 硅片
H401-T-CONTROLLER	Okolab		加热玻璃板控制器
H601-NIKON-TS2R-GLASS	Okolab		加热玻璃板
Heidelberg DWL 2000	Heidelberg Instruments		紫外直接激光器写入
器 胰岛素注射器，U 100，带有鲁尔	Codan Medical ApS	CODA621640	1 mL 注射器，用于在图案化过程中提取液体悬浮
Klayout	Opensource		用于设计硅母
LB 肉汤的功能，Miller （Luria-Bertani）	Fisher Scientific	244610	溶原肉汤冲洗到微流体通道
Masterflex 中传输管	Masterflex	HV-06419-05	0.020 英寸内径，0.06 英寸外径
拖把 （10x）	Teknova	M2101	用 milliQ 水稀释 10 倍，用于替代过夜培养基
尼康 Eclipse Ti2	尼康仪器		显微镜
openSCAD	开源		，用于设计模具
OPTIspin SB20	ATM 组	51-0002-01-00	旋转显影
剂 等离子室 Zepto	Diener 电子	ZEPTO-1	用于等离子体处理模板和微通道以粘合它们
正性光刻胶 AZ1505	MicroChemicals	AZ1505
磷酸氢二钾	Sigma Aldrich	P3786	添加到 MOPS 1x
Prusa 固化和清洗机 CW1S	Prusa		用于确保所有聚合物均已固化，并将未固化的聚合物从模具中去除
Prusa 树脂 - Tough	Prusa Research a.s.		用于 3D 打印的 UV 光敏 405nm 液态树脂
Prusa SL1 3d 打印机	Prusa		用于打印模具
秤	VWR-CH	611-2605	用于称量 PDMS 混合物
硅晶片 （10 cm）Silicon	Materials Inc.		N/磷酸盐 <100> 1-10 和 Omega;cm
Süss MA6 掩模对准器	SUSS MicroTec Group		用于对准铬玻璃掩模和基材，并暴露基材
Sylgard 184	道康宁		有机硅弹性体套件;固化剂
Techni Etch Cr01	Technic		铬蚀刻剂
三氯（1H、1H、2H、2H-全氟辛基）硅烷	Sigma Aldrich	448931	用于硅烷化 3D 打印模具
吐温 20	Sigma Aldrich	P1379	用于确保图案化过程中的最佳后退接触角
Veeco Dektak 6 M	Veeco		轮廓仪
VTC-100 真空旋涂机	MTI 公司		真空旋涂机