通过水射流技术注射猪脂肪组织来源的基质细胞

摘要

我们介绍一种通过无针水射流技术进行细胞注射的方法，并结合一系列递送后的检测，评估细胞的活力、增殖能力及弹性测量。

摘要

尿失禁（UI）是一种高度常见的疾病，其特征是尿道括约肌功能缺陷。再生医学的分支，特别是细胞治疗，是改善和恢复尿道括约肌功能的新型方法。尽管在临床实践中常规使用针头和注射器注射具有活性的功能细胞，但这些方法存在显著的缺点和局限性。在此背景下，无针水射流（WJ）技术是一种可行且创新的方法，可通过视觉引导的膀胱镜将活细胞注射至尿道括约肌中。在本研究中，我们使用WJ技术将猪脂肪组织来源的基质细胞（pADSCs）递送至尸体尿道组织，并进一步研究了WJ递送对细胞得率和存活率的影响。我们还通过原子力显微镜（AFM）测量评估了其生物力学特性（即弹性）。结果显示，经WJ递送的pADSCs细胞弹性显著降低。与对照组相比，细胞存活率显著下降，但仍高于80%。

引言

尿失禁（UI）是一种广泛存在的疾病，在欧洲人群中的患病率为1.8 - 30.5%¹，主要特征是尿道括约肌功能障碍。从临床角度来看，当保守治疗或物理治疗无法缓解患者出现的症状时，通常会考虑手术治疗。

针对括约肌复合体功能障碍潜在再生修复的细胞治疗，正作为一种前沿方法用于尿失禁（UI）病理的治疗^2,3。其主要目标是替换、修复并恢复受损组织的生物学功能。在UI的动物模型中，干细胞移植已在尿动力学结局方面显示出良好的应用前景^2,4,5。干细胞因其具备自我更新和多向分化潜能，成为理想的细胞候选者，有助于受损组织的再生⁶。尽管具有广阔的再生潜力，细胞治疗的实际应用仍受到限制，主要在于细胞的微创递送在注射精度和靶区覆盖范围方面仍面临诸多挑战。尽管目前常用的细胞递送方式是通过针头-注射器系统进行注射⁷，但通常会导致移植后存活细胞数量显著不足，报道的细胞存活率低至1%–31%⁸。此外，通过针头注射递送细胞....

方案

猪的脂肪组织样本由图宾根大学实验外科研究所提供。所有实验程序均获得当地动物福利主管部门批准，实验动物许可编号为CU1/16。

1. 猪脂肪组织来源基质细胞的分离

1. 将来自实验外科研究所的猪脂肪组织置于50 mL离心管中运送至实验室。
2. 在无菌操作台内将组织转移至无菌培养皿中，使用两把手术刀（10号）将其切碎成小片段并捣成糊状。
   注意：也可使用剪刀来获得小片段。片段越小，越有利于后续消化。
   1. 将切碎的组织片段/糊状物转移至50 mL离心管中，加入5 mL消化液，在37 °C摇床中孵育30分钟。消化液成分为含1%牛血清白蛋白（BSA）（储存液：1 % (w/v) BSA溶于PBS）和0.1% I型胶原酶的PBS溶液。
      注意：消化液需现配现用。摇床采用圆周振荡模式，转速为25–500 rpm。
3. 为终止孵育，加入10 mL生长培养基[DMEM低糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium - low glucose, DMEM-LG）、2.5% HEPES钠盐溶液（1 M）、10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺（200 mM）、1%青霉素-链霉素（10000 U/mL青霉素；10,000 µg/mL链霉素）和1%两性霉素B（250 µg/mL）]。
   注意：生....

结果

通过两种方法递送细胞后，采用WN方法递送的细胞存活率（97.2 ± 2%，n=10，p<0.002）显著高于使用E60-10参数通过WJ注射的细胞存活率（85.9 ± 0.16%，n=12）（图2）。生物力学评估结果显示：使用捕获液进行WN注射的细胞，其弹性模量（EM；0.992 kPa）与对照组（1.176 kPa）相比无显著差异（图3A）；而WJ注射则导致细胞弹性模量显著降低（0.440 kPa，p<0.001，图3B），降幅达40–50%。尽管在尸体尿道组织中进行的WN注射未引起细胞弹性模量的显著变化（图4A），但在组织样本中进行WJ注射后，弹性模量显著下降（从0.890 kPa降至0.429 kPa；p<0.00，图4B），绝对EM值降低了51%。综上所述，结果表明，虽然WJ细胞递送能够满足临床应用中细胞递送后存活率.......

讨论

在本研究中，我们演示并介绍了一种脐带华通胶（WJ）细胞递送操作的逐步实施方法，并采用一系列定量分析手段评估了WJ递送对细胞特性的影响，包括细胞活力和生物力学特性（即弹性模量，EM）。在进行WJ注射后，所收获细胞中85.9%保持存活。而在进行针头注射（WN注射）后，97.2%的细胞仍维持其活力。因此，WJ递送方法满足了临床应用的一项基本要求：递送后存活细胞比例超过80%¹⁸。尽管WJ方法已实现标准化和可重复性，但针头注射递送的效果则高度依赖于注射器和针头的尺寸与喷嘴规格、压力、流速以及实施注射操作的医师本身¹⁹。

在活体动物模型中采用 WJ 细胞递送的研究表明，通过调节喷射压力，可使穿透深度适应目标组织，从而适应特定的临床应用需求^13,16。在可视控制下对活体动物进行经尿道细胞注射时，约有50%的治疗动物出现细胞错位或丢失²⁰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 离心管	Greiner BioOne	227261
1 mL BD Luer-LokTM 注射器	BD Plastik Inc	n.a.
100 µm 细胞筛	Greiner BioOne	542000
15 mL 离心管	Greiner BioOne	188271
75 cm2 组织培养瓶	Corning Incorporated	353136
AFM 探头	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
AFM 数据处理软件	Bruker	JPK00518
AFM 软件	Bruker	JPK00518
AFM 系统 Cell Hesion 200	Bruker	JPK00518
All-In-One-Al 悬臂梁	Budget Sensors	AIO-10	尖端 A，接触模式，形状：梁 力常数：0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) 共振频率：15 kHz (10 - 20 kHz) 长度：500 µm (490 - 510 µm) 宽度：30 µm (35 - 45 µm) 厚度：2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
两性霉素 B 溶液	Sigma	A2942	250 µg/ml
原子力显微镜 (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
BD Microlance 3 18G	BD	304622
牛血清白蛋白	Gibco	A10008-01
悬臂梁	All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10	尖端 A，k ¼ 0.2 N/m
C-chip 一次性血细胞计数板	NanoEnTek	631-1098
离心机：Rotina 420R	Hettich Zentrifugen
胶原酶 I 型，粉末	Gibco	17100-017
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 - 低糖	Sigma	D5546
Feather 一次性手术刀（No. 10）	Feather	02.001.30.010
胎牛血清 (FBS)	Sigma	F7524
HEPES 钠盐溶液 (1 M)	Sigma	H3662
倒置相差显微镜（与 AFM 集成）	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
实验室袋	Brand	759705
Leibovitz's L-15 培养基（不含 L-谷氨酰胺）	Merck	F1315
Leibovitz's L-15 培养基（不含 L-谷氨酰胺）	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
L-谷氨酰胺	Lonza	BE 17-605C1	200 mM
LIVE/DEADTM 活/死细胞染色试剂盒	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	L3224	本试剂盒中使用 Calcein AM 和 EthD-1。
显微镜软件：Zen 2.6	Zeiss
显微镜：AxioVertA.1	Zeiss
Nelaton 导尿管（女性）	Bicakcilar	19512051
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	10000 U/ml 青霉素 10000 µg/ml 链霉素
与 AFM 配套使用的培养皿加热器	Bruker	T-05-0117
与 AFM 配套使用的培养皿加热器	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	10010-015
统计软件：SPSS Statistics 22	IBM
无菌培养皿 - CellStar	Greiner BioOne	664160
组织培养皿	TPP AG	TPP93040
组织培养皿	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
台盼蓝 0.4% 0.85% NaCl	Lonza	17-942E
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma	T3924
水射流设备：ERBEJET2	Erbe Elektromedizin GmbH
Williams 膀胱镜注射针	Cook Medical	G14220	23G, 5.0 Fr, 35 cm