用于秀丽隐杆线虫长期生长和成像的简单微流控芯片

Summary

该协议描述了一种简单的微流控芯片设计和微加工方法，用于在连续食物供应的情况下生长秀 丽隐杆线虫 长达36小时。生长和成像设备还可以在发育过程中对细胞和亚细胞过程进行数天的间歇性长期高分辨率成像。

Abstract

秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫）已被证明是研究发育和细胞生物学过程的宝贵模型系统。了解这些生物过程通常需要对同一动物进行长期和重复的成像。在琼脂垫上进行的传统固定方法相关的长恢复时间对动物健康有不利影响，因此不适合长时间重复对同一只动物进行成像。本文描述了一种微流控芯片设计、制造方法、片上秀丽隐杆线虫培养方案，以及用于研究个体动物发育过程的三个长期成像示例。该芯片由聚二甲基硅氧烷制成并粘合在盖玻片上，使用使用氮气偏转的弹性膜将动物固定在玻璃基板上。秀丽隐杆线虫的完全固定能够以无麻醉的方式对细胞和亚细胞事件进行可靠的延时成像。具有大横截面的通道几何形状允许动物在两个部分密封的隔离膜内自由移动，从而允许在通道中连续食物供应生长。使用这种简单的芯片，可以对发育现象进行成像，例如当动物在通道内生长时，PVD感觉神经元中的神经元突生长，外阴发育和树突状树枝状化。长期生长和成像芯片使用单一压力管路运行，无需外部阀门，廉价的流体耗材，并利用标准蠕虫处理协议，其他实验室使用秀丽隐杆线虫可以轻松适应。

Introduction

秀丽隐杆线虫已被证明是研究细胞生物学、衰老、发育生物学和神经生物学的强大模式生物。诸如透明的身体，较短的生命周期，易于维护，确定数量的细胞，与多个人类基因的同源性以及经过充分研究的遗传学等优点使秀丽隐杆线虫成为基础生物学发现和^{应用研究的}流行模型1^，2。通过对个体动物的反复长期观察来了解细胞的生物学和发育过程可以证明是有益的。传统上，秀丽隐杆线虫在琼脂垫上麻醉并在显微镜下成像。麻醉剂对动物健康的不利影响限制了麻醉动物对^{同一动物进行}长期和重复间歇成像的使用3^，4。微流体技术的最新进展及其对秀丽隐杆线虫无麻醉诱捕的适应性，可以忽略不计的健康危害，从而能够在短时间内对同一只动物进行高分辨率成像。

微流控芯片已被设计用于秀丽隐杆线虫^5高通量筛选⁶，⁷，⁸，捕获和分配⁹，药物筛选¹⁰，....

Protocol

1. 生长成像装置的制造

1. SU8模具制造
   1. 在文字处理软件（或计算机辅助设计CAD软件）中使用矩形设计图案1（流层）和2（控制层），并在激光绘图仪的帮助下在聚酯基薄膜上打印光掩模，最小特征尺寸为8μm（图1）。
   2. 将硅晶片切成 2.5 厘米× 2.5 厘米片，并用 20% KOH 清洁 1 分钟。用去离子 （DI） 水冲洗晶圆。流量和控制层各使用一个晶圆。
      注意:KOH具有腐蚀性，应小心处理。
   3. 用14psi压缩氮气干燥碎片，然后在120°C的热板上脱水4小时。在继续下一步之前，将两块冷却至室温。
   4. 取一块硅片，将其放在旋涂机的卡盘上，然后打开真空以将晶圆固定到位。在硅片上，放入 ~20 μL 六甲基二硅烷 （HMDS），并使用旋涂机以每分钟 500 转 （rpm） 的速度涂覆 5 秒，然后以 3，000 rpm 的速度涂覆 30 秒。
      注意:此步骤应在黄灯下执行。请勿在室内使用白光。
   5. 为了获得~40μm的均匀光刻胶厚度（特定于流动层;适用于成像早期幼虫阶段1至阶段3（L1 - L3）动物），使用旋涂机在硅晶片上涂覆~1.5mL负光刻胶-1，转速为500 rpm，持续5秒，然后2，000 rpm，持续30秒。
   6. 对第二个晶片重复步骤1.1.4和1.1.5，以获得特定于控制层的~40μm的均匀光刻....

Results

器件表征: 生长和成像设备由使用不可逆等离子键合粘合在一起的两个PDMS层组成（图1）。长度为10毫米，高度为40μm或80μm的流动层（模式1）使我们能够在液体培养物中培养动物（图1A）。诱捕层（图案2）具有2毫米宽的膜（图1B），用于固定动物以进行高分辨率成像。捕获层的掩模还创建了一对隔离膜，用于限制动物在连续成像时间点之间的流道部分内的运动。该设备的捕获膜改编自我们以前的成像设备³。当前装置（图1C，L）包括增加隔离膜并将诱捕膜的宽度增加到2毫米，以便在多个时间点上有效地固定同一只动物。

为了测试该装置，在连接捕获膜的微流体通道中填充干净的蒸馏水（图1D，E和补充图3

Discussion

在本文中，描述了一种用于制造和使用简单微流体装置的协议，用于生长秀 丽隐杆线虫 ，在其发育过程中具有恒定的食物供应和单个动物的高分辨率成像。这种制造过程很简单，可以在非无菌环境中完成。在制造步骤中，无尘环境至关重要。灰尘颗粒的存在会导致两个粘合表面之间的接触不当，导致在高压应用中设备粘合不良和泄漏，而 秀丽隐杆线虫 则被固定。在所有制造的设备中，95%的设备适用于实验。少数器件由于制造或使用过程中的不适当粘合而失效（5%）。通过在全球各地多个学术机构提供的无尘（> 1，000 级洁净室）内进行制造过程，可以减少粘合失败。要从流道中清除细菌食物并启用设备重复使用，请在每次实验后通过流动酒精来冲洗设备。

该协议展示了一种光刻制造工艺，其设计简单，可以很容易地针对 秀丽隐杆线虫的不同发育阶段和大小进行修改。此外，该装置设计可以适用于其他模式生物，如斑马鱼和 果蝇，通过增加流动的尺寸和捕获层³ 来观察各种发育和亚细胞过程。在该协议中，流动层通道的两个不同高度 - 40μ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G 针	Sigma-Aldrich，班加罗尔，印度	规格 18
个 3 通旋塞阀	Cole-Parmer	WW-30600-02	带鲁尔锁的 Masterflex 配件
CCD 相机	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
电路板薄膜	Fine Line Imaging，美国		设计印刷每英寸 65,024 点 （DPI）
对流烘箱	Meta-Lab Scientific Industries，印度	MSI-5
盖玻片	蓝色 stat 显微盖玻片		22mm x 10Gms
乙醇	Hi media
Harris 单芯打孔机 1mm	Qiagen	Z708801
六甲基二硅氮烷	Sigma-Aldrich，班加罗尔，印度	440191
热板	IKA	RCT B S 22
异丙醇	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
激光扫描显微镜	蔡司	LSM 5 LIVE
微量移液器吸头	Tarsons		0.5-10 & 微量;L 微量移液器吸头用于食品供应
负性光刻胶-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
负性光刻胶-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
氮气	当地供应商	商业氮气	钢瓶容积为 7 立方米
PDMS（固化液）	道康宁公司，美国密歇根	Sylgard 固化液	固化剂
培养皿	Praveen Scientific Corporation
等离子清洗剂	Harrick Plasma， NY， USA	PDC-32G
剃须刀和刀片	李斯特手术刀片
硅弹性体（底座）	道康宁公司，密歇根州，美国	Sylgard 184 底座	弹性体底座
硅管	Fisher Scientific		内径 1.59 毫米和外径 3.18 毫米的塑料管
硅晶片	美国马萨诸塞州大学晶片	[100] 方向，4 英寸	直径 从 100 mm 直径的晶圆上切割出小块（2 mm 和 2 mm）
涂机	SPS-Europe B.V.，荷兰 SPIN	150
转盘显微镜	Perkin Elmer ultra-view VOX 系统	CSU-X1-A3 N	该系统配备了四个 （405/488/561/640 nm） 激光器，并使用 Volocity 软件包进行控制。
SU8 显影	Microchem，马萨诸塞州，美国	SU8 显影
三氯（1H、1H、2H、2H-全氟辛基）硅烷	Sigma-Aldrich，印度班加罗尔	448931	三氯（1H、1H、2H、2H-全氟辛基）硅烷蒸气有毒
紫外线灯	Oriel Instruments，印度		200 瓦和准直紫外光源
Volocity 软件	Perkin-Elmer		图像分析