用于秀丽隐杆线虫长期生长和成像的简单微流控芯片

摘要

该协议描述了一种简单的微流控芯片设计和微加工方法，用于在连续食物供应的情况下生长秀 丽隐杆线虫 长达36小时。生长和成像设备还可以在发育过程中对细胞和亚细胞过程进行数天的间歇性长期高分辨率成像。

摘要

秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫）已被证明是研究发育和细胞生物学过程的宝贵模型系统。了解这些生物过程通常需要对同一动物进行长期和重复的成像。在琼脂垫上进行的传统固定方法相关的长恢复时间对动物健康有不利影响，因此不适合长时间重复对同一只动物进行成像。本文描述了一种微流控芯片设计、制造方法、片上秀丽隐杆线虫培养方案，以及用于研究个体动物发育过程的三个长期成像示例。该芯片由聚二甲基硅氧烷制成并粘合在盖玻片上，使用使用氮气偏转的弹性膜将动物固定在玻璃基板上。秀丽隐杆线虫的完全固定能够以无麻醉的方式对细胞和亚细胞事件进行可靠的延时成像。具有大横截面的通道几何形状允许动物在两个部分密封的隔离膜内自由移动，从而允许在通道中连续食物供应生长。使用这种简单的芯片，可以对发育现象进行成像，例如当动物在通道内生长时，PVD感觉神经元中的神经元突生长，外阴发育和树突状树枝状化。长期生长和成像芯片使用单一压力管路运行，无需外部阀门，廉价的流体耗材，并利用标准蠕虫处理协议，其他实验室使用秀丽隐杆线虫可以轻松适应。

引言

秀丽隐杆线虫已被证明是研究细胞生物学、衰老、发育生物学和神经生物学的强大模式生物。诸如透明的身体，较短的生命周期，易于维护，确定数量的细胞，与多个人类基因的同源性以及经过充分研究的遗传学等优点使秀丽隐杆线虫成为基础生物学发现和^{应用研究的}流行模型1^，2。通过对个体动物的反复长期观察来了解细胞的生物学和发育过程可以证明是有益的。传统上，秀丽隐杆线虫在琼脂垫上麻醉并在显微镜下成像。麻醉剂对动物健康的不利影响限制了麻醉动物对^{同一动物进行}长期和重复间歇成像的使用3^，4。微流体技术的最新进展及其对秀丽隐杆线虫无麻醉诱捕的适应性，可以忽略不计的健康危害，从而能够在短时间内对同一只动物进行高分辨率成像。

微流控芯片已被设计用于秀丽隐杆线虫^5高通量筛选⁶，⁷，⁸，捕获和分配⁹，药物筛选¹⁰，11，具有高分辨率成像的神经元刺激¹²和动物的高分辨率成像^12，13，14。还开发了用于固定在载玻片上的超薄微流体片¹⁵。已经使用在液体培养物中生长的动物的低分辨率图像对秀丽隐杆线虫进行了长期研究，以观察生长，钙动力学，药物对其行为的影响¹⁶，^17，18，^19，寿命和衰老²⁰。已经使用高分辨率显微镜进行了长期研究，以评估突触发育²¹，神经元再生22和线粒体添加²³。在多通道设备中已经完成了细胞命运和分化的长期高分辨率成像和追踪^24，25。几个细胞和亚细胞事件发生在几个小时的时间尺度上，需要在其发育过程中的不同时间点捕获同一个个体，以表征过程中的所有中间步骤，以了解体内细胞动力学。为了成像器官发生、神经元发育和细胞迁移等生物过程，需要在多个时间点以相同的方向固定动物。我们之前已经发表了一个协议，用于对秀丽隐杆线虫进行超过 36 小时的高分辨率成像，以确定线粒体沿触摸受体神经元 （TRN） 添加的位置²³。

本文提供了一种协议，用于建立基于微流体的重复高分辨率成像方法。该设备具有单个流道，最适合每个设备对单个动物进行重复成像。为了提高通量并同时对许多动物进行成像，可以将多个设备连接到同一压力管线，但使用单独的三路连接器控制每个设备中的单个动物。该设计适用于需要高分辨率延时图像的研究，例如胚胎后发育过程、细胞迁移、细胞器运输、基因表达研究等。该技术可能会限制某些应用，例如需要对许多晚期动物进行平行生长和成像的寿命和衰老研究。聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体由于其生物稳定性26，生物相容性27，²⁸，透气性^29，30和可调弹性模量³¹而用于制造该装置。这种两层装置允许在微流体通道中连续供应食物的动物生长，并通过使用氮气的PDMS膜压缩捕获单个秀丽隐杆线虫。该设备是先前发布的设备的扩展，具有在连续^{食物供应下}在微通道中生长和成像同一动物的优点3。额外的隔离膜网络和 2 mm 宽的捕获膜能够有效地固定发育中的动物。该装置已被用于观察感觉PVD神经元中的神经元发育，外阴发育和树突状树枝化。动物在装置中生长时不会对健康产生不利影响，并且可以反复固定以促进在其发育过程中对同一动物的亚细胞事件进行成像。

整个协议分为五个部分。第 1 部分描述了生长和成像芯片的器件制造。第 2 部分介绍如何为 PDMS 膜偏转设置压力系统，以固定和隔离单个 秀丽隐杆线虫。第 3 部分介绍如何在线虫生长培养基 （NGM） 板上同步秀 丽隐杆线 虫以进行设备成像。第4部分介绍如何在设备中加载单个动物并在微流体装置内将动物生长数天。第 5 部分介绍如何在多个时间点固定单个动物，使用不同的物镜捕获高分辨率图像，并使用斐济分析图像。

方案

1. 生长成像装置的制造

1. SU8模具制造
   1. 在文字处理软件（或计算机辅助设计CAD软件）中使用矩形设计图案1（流层）和2（控制层），并在激光绘图仪的帮助下在聚酯基薄膜上打印光掩模，最小特征尺寸为8μm（图1）。
   2. 将硅晶片切成 2.5 厘米× 2.5 厘米片，并用 20% KOH 清洁 1 分钟。用去离子 （DI） 水冲洗晶圆。流量和控制层各使用一个晶圆。
      注意:KOH具有腐蚀性，应小心处理。
   3. 用14psi压缩氮气干燥碎片，然后在120°C的热板上脱水4小时。在继续下一步之前，将两块冷却至室温。
   4. 取一块硅片，将其放在旋涂机的卡盘上，然后打开真空以将晶圆固定到位。在硅片上，放入 ~20 μL 六甲基二硅烷 （HMDS），并使用旋涂机以每分钟 500 转 （rpm） 的速度涂覆 5 秒，然后以 3，000 rpm 的速度涂覆 30 秒。
      注意:此步骤应在黄灯下执行。请勿在室内使用白光。
   5. 为了获得~40μm的均匀光刻胶厚度（特定于流动层;适用于成像早期幼虫阶段1至阶段3（L1 - L3）动物），使用旋涂机在硅晶片上涂覆~1.5mL负光刻胶-1，转速为500 rpm，持续5秒，然后2，000 rpm，持续30秒。
   6. 对第二个晶片重复步骤1.1.4和1.1.5，以获得特定于控制层的~40μm的均匀光刻胶厚度。
   7. 或者，为了将老年动物的流动层厚度增加到~80μm，使用旋涂机以500rpm的速度涂覆硅晶片5秒，然后以2，000rpm的速度涂覆硅晶片30秒。该厚度适用于L3期至成年动物。
      注意:将硅晶圆放在两侧，以免损坏旋涂层。在此步骤中保持白灯关闭。
   8. 将光刻胶涂层的硅片（用于流动和控制层）在65°C的热板上烘烤1分钟，然后在95°C下烘烤10分钟。将烤好的块冷却至室温。
      注意:烘烤的硅片可以存放一天，然后再进行下一步。存放在黑暗中，不要暴露在白光下。
   9. 将软烤硅片放在紫外照明器的曝光台上，光刻胶涂层表面朝向紫外灯。使用200 W灯将两块分别暴露在紫外线下15秒，通过图案1和2的光掩模分别获得流动和控制层。
      注意:佩戴护目镜，避免直接暴露在紫外线下。在此阶段，请勿打开房间内的白灯。
   10. 烘烤两个暴露的硅片，涂层朝上，在65°C下，然后分别在95°C下烘烤1分钟和10分钟。将碎片冷却至室温，然后再继续下一步。
   11. 通过将硅片浸泡在光刻胶显影剂溶液中（显影剂在异丙醇中的1:3稀释）中20分钟来显影图案。一旦图案可见，用纯异丙醇 （IPA） 冲洗碎片，然后用氮气 （14 psi） 轻轻吹干。
       注意:使用通风良好的环境进行这种化学处理，以避免人类接触。仅在显影并用 IPA 冲洗特征后使用白光。
   12. 将硅片放在干燥器中，涂层表面朝上。将 50 μL 纯三氯（1H、1H、2H、2H-全氟辛基）硅烷倒在小塑料杯或载玻片上，将碎片暴露于硅烷蒸气中。将杯子/载玻片放入干燥器内并孵育2小时。
       注意:避免直接接触硅烷蒸气。始终使用密封室进行硅烷蒸汽处理。
       注意:如有必要，开发的硅片可以存储1-2天，然后再进行下一步。
2. PDMS芯片制造
   1. 通过将弹性体基材与固化剂以 10:1 的比例混合，在塑料杯中制备 PDMS。通过不断搅拌3分钟将内容物充分混合。混合会在PDMS混合物中产生大量气泡。
   2. 将PDMS混合物在干燥器中脱气30分钟以除去所有气泡。
      注意:确保在将气泡倒入功能之前从PDMS混合物中去除气泡，因为气泡会导致设备有缺陷且无法正常工作。
   3. 将带有控制层（图案2）的硅晶片放入培养皿中。将 5 mm 厚的 PDMS 混合层轻轻倒在硅片上，避免形成任何气泡。
   4. 在干燥器中对PDMS混合物进行脱气，以去除PDMS浇注过程中形成的其他气泡。
   5. 将带有流动层（图案 1）的硅晶片放在旋转卡盘上，施加 200-500 mTorr 真空压力以保持晶圆。将 ~1 mL PDMS 倒在硅晶片上，并使用旋涂机以 500 rpm 的速度涂覆 5 秒，然后以 1，000 rpm 的速度涂覆 30 秒，以获得 ~80 μm 厚的层。
   6. 用旋涂的PDMS烘烤两个硅片，并在热空气对流烘箱中于50°C下倒入PDMS层6小时。烘烤后，等待碎片在室温下冷却。
   7. 使用锋利的刀片从控制层周围的硅片（图案 2）上切下 5 mm 厚的 PDMS 层，然后将其从硅衬底上剥离。
   8. 在PDMS块的储液罐上使用Harris打孔机打出两个直径~1 mm的孔，将固定通道和隔离通道入口连接到用于PDMS膜偏转的气体管线。
   9. 将带有旋涂PDMS层的硅片放在图案1（流动层）上，PDMS涂层表面朝上，放在塑料托盘上。将带有图案 2（控制层）的冲孔 PDMS 块放在托盘上，模制面朝上。
   10. 将塑料托盘放在等离子清洁剂内，并将两个PDMS表面暴露在18 W空气等离子体下在低真空（200-600 mTorr）下2分钟。施加真空，直到腔室变成亮紫色。在弱光下执行此步骤以查看等离子颜色变化。
   11. 取出两个等离子体处理的块，通过将图案 1 和 2 的等离子处理表面压在一起来轻轻地结合块。在热空气对流烤箱中在50°C下烘烤粘合图案2小时。
   12. 将粘合的设备从烤箱中取出。用图案 1 和图案 2 从硅晶圆上切割出粘合器件，并使用 Harris 打孔机在流动层的入口和出口储液器上打孔。
   13. 将粘合的PDMS块，使流动层朝上放在塑料托盘上。将干净的盖玻片 （#1.5） 放在同一个托盘上。将块和盖玻片暴露在18 W空气等离子体下2分钟。调整真空压力以查看紫色腔室。
       注意:此步骤应在弱光下完成，以查看等离子颜色变化。要清洁盖玻片，请用 IPA 清洗并使用 14 psi 的氮气吹干。
   14. 将等离子曝光的PDMS块放在盖玻片的顶部，并在50°C的烤箱中烘烤粘合结构2小时。将设备存放在洁净室中，以备将来进行任何实验。

2. PDMS膜启动

1. 拿起设备并将其放在体视显微镜上并连接管子。将微柔性管（内径 ~5 mm，外径 ~8 mm）连接到一端的压缩氮气管。连接另一端的三路连接器。三通连接器的管 1 和 2 将分别连接到捕集膜和隔离膜。
2. 将两个微柔性管（内径 ~1.6 mm，外径 ~5 mm）连接到三通旋塞阀的两个出口。将两个管的另一端连接到 8 mm 长的 18 G 针头上。
3. 使用微量移液器通过入口口用M9缓冲液填充流动层。通过连接到针头的一端用去离子水填充两个管子。将两根针插入打孔中，分别连接隔离膜和捕获膜。
4. 在 14 psi 下打开氮气调节器，然后从管 1 转动三通阀，通过控制层（即捕集膜和隔离膜）中的微流体通道将水推入设备。
5. 等到水充满通道，两个通道中都不存在任何空气滴。一旦通道完全充满水，通道就被认为是已启动的。
6. 一旦通道充满水并注好底漆，就使用三通旋塞阀释放压力。灌注会导致流动层中出现气泡，通过流经流道的额外介质来去除气泡。

3. 秀丽隐杆线虫 的维护和同步

注意:秀丽隐杆线虫菌株:该研究使用以下转基因PS3239（dpy-20（e1282）syIs49 IV [MH86p（dpy-20（+） + pJB100（ZMP-1::GFP）]）用于外阴发育32，jsIs609（mec7p::MLS（线粒体基质定位信号）::GFP）33用于触摸受体神经元（TRN）发育和线粒体转运成像，以及wdIs51（F49H12.4::GFP + unc-119（+））跟踪PVD发育³⁴。遵循标准秀丽隐杆线虫培养和维持方案³⁵。

1. 在线虫生长培养基（NGM）培养皿上生长秀 丽隐杆线虫 ，大 肠杆菌 OP50作为食物来源，温度为22°C。 通过反复转移一些雌雄同体或将少量琼脂与少数动物一起切块到带有OP50草坪的新NGM平板上来维持 秀丽隐杆线虫 菌株。
2. 3-5天后，检查NGM板的动物生长和 秀丽隐杆线虫 卵。收集大约 30 个鸡蛋并将其从盘子转移到带有 OP50 草坪的新鲜 NGM 盘中。
3. 为了同步动物进行成像，每2小时将所有未孵化的卵从平板转移到新鲜板上，并将其保持在22°C。 每个盘子上大约会孵化 15-20 个卵。
4. 分别在孵化后14-16小时和28-30小时之间挑选动物幼虫2（L2）和幼虫3（L3）阶段。将动物转移到微流体装置进行成像。按照下一节所述添加食物供应，以将动物保持在设备内以进行长期生长和成像实验。

4. 秀丽隐杆线虫 生长内部生长及成像微流控装置

1. 在连接隔离膜和固定膜后，在低放大倍率（4x或10x）下将生长和成像微流体装置安装在倒置显微镜上并观察图案2。确保通道充满干净的蒸馏水。
2. 使用 10 mL 1 M 柠檬酸钾 pH 6.0、10 mL 痕量金属溶液、3 mL 1 M CaCl₂、3 mL 1 M MgSO₄ 制备新鲜的 1 L S 培养基溶液。在无菌条件下制备溶液。不要高压灭菌S介质。
3. 在实验前10分钟用生长培养基（S培养基）填充流道。避免流道中出现任何气泡。如果需要，流动额外的介质以去除气泡。
4. 使用微量移液器从 10 μL S 培养基中的 NGM 板中从所需的发育阶段挑选一只动物，并通过入口孔将动物推入流道。
5. 使用低倍率物镜监测动物在流道中的位置。将额外的介质流过入口或出口以推动动物并将其放置在两个隔离膜之间限制的流道内。
6. 打开三通旋塞阀，在隔离通道中施加 14 psi 的压力，并将膜向下推入流道。
   注意:膜部分密封流道，并将动物运动限制在两个隔离膜之间的区域。
7. 使用来自条纹板的大肠杆菌OP50的单个菌落接种250mL L肉汤（2.5 g 杆菌 胰蛋白胨，1.25 g杆菌酵母，1.25 g NaCl in H₂O）。将接种的培养物在37°C下培养过夜。
8. 将 500 μL OP50 培养物分装到 1.5 mL 无菌离心管中，并将原液和等分试样在 4 °C 下储存 2 周。
9. 通过以1.3× g 离心5分钟来沉淀OP50培养物。用 1 mL 新鲜 S 培养基（0.5 倍稀释）溶解沉淀，并在室温下储存 3-4 天。使用这种稀释的OP50在微流体装置内喂养秀 丽隐杆线虫 。
10. 在入口和出口储液罐顶部留下一滴 S 介质，以减少 S 介质在流道中的蒸发。
11. 在10μL微量移液器中取稀释的OP50溶液。从移液器中取出装有OP50溶液的微量吸头，然后将吸头压入入口储液槽中。然后将另一个微量移液器吸头放入 10 μL 食品溶液中，并将其插入出口储液槽中。
12. 用手指施加压力密封吸头，以确保食品溶液的连续性，没有任何气隙。每天用OP50溶液更换微量移液器吸头，不超过3-4天。
13. 在两个吸头中额外填充 20-30 μL 的食物溶液。在微量移液器吸头中加入或取出食物溶液，以调整梯度以推动动物进入流道，并调整动物在捕获膜下的位置以进行成像。
14. 使用明场图像监测细菌的流动，以确保其连续通过流道中的部分封闭隔离膜。
    注意:在没有细菌流动的情况下，动物可能会吃掉两个隔离膜之间的流动通道中的可用细菌。如果通道中没有细菌或没有流量，请将入口和出口处的两个微量移液器吸头更换为装满新鲜制备食品的新移液器吸头。

5. 秀丽隐杆线虫 固定和成像

1. 秀丽隐杆线虫 在诱捕膜下的固定
   1. 以低倍率在生长通道中定位单个动物。调整连接到入口和出口储液槽的两个微量移液器吸头中的食品溶液高度。利用流道中的静水压差将动物推向所需方向。
   2. 将动物定位在诱捕膜的中心，并使用低放大倍率物镜（4x）监测其游泳行为。
   3. 转动三向旋塞阀，缓慢增加疏水阀通道中的压力。沿生长通道边界壁以直线姿势将动物固定在诱捕膜下。
      注意:避免将动物困在流道上以 Z 或 U 形弯曲位置。这会导致动物身体受到更大的压力挤压，并对其健康造成永久性损害。
2. 秀丽隐杆线虫成像 和从膜释放
   1. 将设备携带并装载到显微镜载物台上。在所需的成像设置下设置倒置显微镜，使用所有必要的光学组件（物镜、光源、荧光滤光片和检测器）进行高分辨率明场、差分成像对比度（DIC）或荧光成像（补充图1）。
   2. 获取单个或多个延时荧光图像以捕获细胞和亚细胞事件。
   3. 使用60x，1.4数值孔径（NA）物镜，具有7%-10%激光功率的488 nm波长激光器，CCD相机，在旋转盘式显微镜上获取 秀丽隐杆线虫 神经元的荧光图像作为其发育的功能。使用显微镜随附的软件进行延时成像，并以每秒4帧的速度采集图像（补充图1）。
   4. 采集图像后，释放诱捕压力并以低倍率 - 4x和10x监测动物的运动。将动物限制在由隔离膜定义的区域内（在整个实验过程中保持在14 psi以下）。
   5. 调整两个微量移液器吸头中食物溶液的体积，以继续生长通道中缓慢的重力驱动食物流。这种食物流是通过调节入口和出口处微量移液器中食物溶液的水平（通常为1-5毫米的高度差）获得的。
   6. 从生长通道中细菌的流动模式可视化明场下的流动。
      注意:在没有流动的情况下，动物吃掉可用的OP50细菌，通道看起来很清晰，动物会在几个小时内挨饿。饥饿的动物通常会产生高自发荧光，在获取延时荧光图像时很容易观察到。这些事件对动物生理有不利影响，在实验中被避免。
   7. 在预定时间间隔后重复步骤5.2.1-5.2.3，以获取同一个体在多个时间点的荧光/ DIC/明场图像。
   8. 在多个所需时间点从同一只动物获取图像后，释放隔离和捕获压力。用 M9 缓冲液冲洗通道并将动物推入入口储液罐。从水库中回收动物并将动物放在新鲜的NGM板上以进行进一步的健康监测。
   9. 用M9缓冲液冲洗通道几次以去除细菌。用70%乙醇（用蒸馏水稀释）冲洗流道。通过使用注射器推动空气来干燥通道。将设备存放在干燥无尘的地方，以便将来重复使用。
3. 图像分析和统计
   1. 使用斐济ImageJ软件进行tiff图像分析。在斐济 ImageJ 中打开来自 wdIs51 动物的 PVD 延时图像的 tiff 图像。通过选择 Axes 选项卡> Z 项目中的堆栈>，从显示主要进程的 z 平面堆栈中提取最佳平面。
   2. 筛选整个图像系列，并使用动物图像帧的重叠部分找到成功覆盖整个神经元过程的特定图像帧。从 FIJI 工具栏中选择插件 >分析>单元格计数器 。这将打开一个窗口，用于对不同的分支进行编号并保留每个选定神经元的计数。
   3. 选择 "初始化>计数器"> Type1，然后标记辅助分支。然后选择 类型 2 并标记 第四纪，单击 显示 所有分支计数的结果窗口（补充图 2）。此方法将显示已计数的分支。
   4. 打开下一个重叠的图像并计算剩余的分支。此过程将防止重复计算并确保每个过程都被计算在内。识别并计算 秀丽隐杆线虫早期幼虫阶段存在的初级分支总数。对老年动物的二级和第四级过程的图像进行类似的分析。
      注意:成年人表现出许多支配体壁肌肉的过程，可能难以计数。确保每个进程只计算一次。
   5. 通过绘制从 PVD 细胞体 （CB） 到 PVC CB 的分段线，计算 wdIs51 动物中 PVD 细胞体之间的距离。对于幼虫4（L4）阶段的动物，当用60倍物镜成像时，细胞体相距很远，并且不在同一帧中。
   6. 从堆栈中选择重叠的图像，以覆盖从头到尾的整个动物长度，使用图像 选项卡> ImageJ 的堆栈> Z 项目 。沿着 PVD 和 PVC CB 之间的神经元过程绘制分段线。
   7. 使用 ImageJ 测量所有分割线的长度 >分析>测量。将所有段的长度相加，以计算每个时间点的 PVD 和 PVC CB 之间的总距离。
   8. 对于 jsIs609 动物中TRN的神经元长度，请在斐济加载图像。沿着后侧微管（PLM;可溶性GFP可见）从细胞体到第一线粒体的质心画一条分段线。计算第一个距离值的线长度。
   9. 从第一个线粒体的中心到第二个线粒体的中心画一条分段线。对每对线粒体重复此过程，直到神经元过程长度结束。将所有长度相加以计算总神经元过程长度。
   10. 对于细胞谱系分析，加载斐济的所有外阴图像，并从多个z平面的延时图像中提取细胞的最佳聚焦图像。
   11. 将数据表示为平均值±平均值的标准误差 （SEM）。对两个以上的样本使用单因子方差分析或对一对样本使用双样本 t 检验计算统计显著性。用 p 值 < 0.05 （*）、p 值 < 0.005 （**） 和 p 值 > 0.05 （ns，不显著）表示显著性。

结果

器件表征: 生长和成像设备由使用不可逆等离子键合粘合在一起的两个PDMS层组成（图1）。长度为10毫米，高度为40μm或80μm的流动层（模式1）使我们能够在液体培养物中培养动物（图1A）。诱捕层（图案2）具有2毫米宽的膜（图1B），用于固定动物以进行高分辨率成像。捕获层的掩模还创建了一对隔离膜，用于限制动物在连续成像时间点之间的流道部分内的运动。该设备的捕获膜改编自我们以前的成像设备³。当前装置（图1C，L）包括增加隔离膜并将诱捕膜的宽度增加到2毫米，以便在多个时间点上有效地固定同一只动物。

为了测试该装置，在连接捕获膜的微流体通道中填充干净的蒸馏水（图1D，E和补充图3

讨论

在本文中，描述了一种用于制造和使用简单微流体装置的协议，用于生长秀 丽隐杆线虫 ，在其发育过程中具有恒定的食物供应和单个动物的高分辨率成像。这种制造过程很简单，可以在非无菌环境中完成。在制造步骤中，无尘环境至关重要。灰尘颗粒的存在会导致两个粘合表面之间的接触不当，导致在高压应用中设备粘合不良和泄漏，而 秀丽隐杆线虫 则被固定。在所有制造的设备中，95%的设备适用于实验。少数器件由于制造或使用过程中的不适当粘合而失效（5%）。通过在全球各地多个学术机构提供的无尘（> 1，000 级洁净室）内进行制造过程，可以减少粘合失败。要从流道中清除细菌食物并启用设备重复使用，请在每次实验后通过流动酒精来冲洗设备。

该协议展示了一种光刻制造工艺，其设计简单，可以很容易地针对 秀丽隐杆线虫的不同发育阶段和大小进行修改。此外，该装置设计可以适用于其他模式生物，如斑马鱼和 果蝇，通过增加流动的尺寸和捕获层³ 来观察各种发育和亚细胞过程。在该协议中，流动层通道的两个不同高度 - 40μ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18 G 针	Sigma-Aldrich，班加罗尔，印度	规格 18
个 3 通旋塞阀	Cole-Parmer	WW-30600-02	带鲁尔锁的 Masterflex 配件
CCD 相机	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
电路板薄膜	Fine Line Imaging，美国		设计印刷每英寸 65,024 点 （DPI）
对流烘箱	Meta-Lab Scientific Industries，印度	MSI-5
盖玻片	蓝色 stat 显微盖玻片		22mm x 10Gms
乙醇	Hi media
Harris 单芯打孔机 1mm	Qiagen	Z708801
六甲基二硅氮烷	Sigma-Aldrich，班加罗尔，印度	440191
热板	IKA	RCT B S 22
异丙醇	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
激光扫描显微镜	蔡司	LSM 5 LIVE
微量移液器吸头	Tarsons		0.5-10 & 微量;L 微量移液器吸头用于食品供应
负性光刻胶-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
负性光刻胶-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
氮气	当地供应商	商业氮气	钢瓶容积为 7 立方米
PDMS（固化液）	道康宁公司，美国密歇根	Sylgard 固化液	固化剂
培养皿	Praveen Scientific Corporation
等离子清洗剂	Harrick Plasma， NY， USA	PDC-32G
剃须刀和刀片	李斯特手术刀片
硅弹性体（底座）	道康宁公司，密歇根州，美国	Sylgard 184 底座	弹性体底座
硅管	Fisher Scientific		内径 1.59 毫米和外径 3.18 毫米的塑料管
硅晶片	美国马萨诸塞州大学晶片	[100] 方向，4 英寸	直径 从 100 mm 直径的晶圆上切割出小块（2 mm 和 2 mm）
涂机	SPS-Europe B.V.，荷兰 SPIN	150
转盘显微镜	Perkin Elmer ultra-view VOX 系统	CSU-X1-A3 N	该系统配备了四个 （405/488/561/640 nm） 激光器，并使用 Volocity 软件包进行控制。
SU8 显影	Microchem，马萨诸塞州，美国	SU8 显影
三氯（1H、1H、2H、2H-全氟辛基）硅烷	Sigma-Aldrich，印度班加罗尔	448931	三氯（1H、1H、2H、2H-全氟辛基）硅烷蒸气有毒
紫外线灯	Oriel Instruments，印度		200 瓦和准直紫外光源
Volocity 软件	Perkin-Elmer		图像分析