本方案描述了一种简单的微流控芯片设计及微加工方法，可用于在持续供应食物的条件下培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）长达36小时。该生长与成像装置还能够在数天内实现对发育过程中细胞及亚细胞事件的间歇性长期高分辨率成像。
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本文内容
摘要
摘要
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans） 已被证明是研究发育和细胞生物学过程的有价值模型系统。理解这些生物学过程通常需要对同一只动物进行长期且反复的成像。传统的在琼脂垫上进行的固定方法会带来较长的恢复时间，对动物健康产生不利影响，因此不适合在长时间内对同一只动物进行重复成像。本文介绍了一种微流控芯片的设计、制备方法以及芯片上的 秀丽隐杆线虫 培养方案，以及对单个动物中发育过程进行长期成像的三个实例。该芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，并键合在盖玻片上，利用氮气驱动弹性膜偏转，从而在玻璃基底上固定动物。实现完全固定后 秀丽隐杆线虫 以无麻醉的方式实现对细胞及亚细胞事件的稳定延时成像。通道结构具有较大的横截面，允许线虫在两个部分密封的隔离膜内自由移动，同时可在持续供给食物的条件下于通道中生长。利用这一简易芯片，可在线虫于通道内生长的过程中，对其发育过程中的多种现象进行成像观察，例如神经元突起生长、阴门发育以及PVD感觉神经元的树突分支形成。该长期培养与成像芯片仅需一条压力管路，无需外部阀门，使用低成本的流体耗材，并兼容标准的线虫操作流程，易于被其他实验室采用 秀丽隐杆线虫.
引言
Caenorhabditis elegans 已被证明是研究细胞生物学、衰老、发育生物学和神经生物学的有力模式生物。其优势包括通体透明、生命周期短、易于培养、细胞数目恒定、与人类多个基因具有同源性以及遗传背景研究充分，这些特点使得 C. elegans 成为开展基础生物学发现和应用研究的常用模型1,2。通过对单个个体进行反复的长期观察，有助于深入理解细胞的生物学和发育过程。传统方法通常将 C. elegans 麻醉于琼脂垫上并在显微镜下成像。然而，麻醉剂对动物健康产生的不利影响限制了其在长期及重复间歇性成像中的应用3,4。近年来，微流控技术的进步及其在无需麻醉且对 C. elegans 几乎无健康危害的固定方法中的应用，使得对同一个个体育行短时间或长时间的高分辨率成像成为可能。
微流控芯片已被设计用于 秀丽隐杆线虫'5 高通量筛选6,7,
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方案
1. 生长与成像装置的制备
- SU8模具制备
- 使用文字处理软件（或计算机辅助设计CAD软件）中的矩形形状设计图案1（流体层）和图案2（控制层），并通过激光绘图仪将光掩模打印在聚酯基薄膜上，最小特征尺寸为8 µm（图1）。
- 将硅片切割成2.5 cm × 2.5 cm的片状，并用20% KOH清洗1分钟。随后用去离子水（DI水）冲洗硅片。分别取一片硅片用于流体层和控制层。
警告：KOH具有腐蚀性，操作时应小心谨慎。 - 用14 psi的压缩氮气吹干硅片，然后在热板上于120 °C下脱水4小时。在进行下一步之前，将两片硅片冷却至室温。
- 取其中一片硅片，放置于匀胶旋涂仪的卡盘上，并开启真空以固定硅片。在硅片表面滴加约20 µL六甲基二硅氮烷（HMDS），使用旋涂仪以500转/分钟（rpm）旋转5秒，随后以3,000 rpm旋转30秒进行涂覆。
警告：此步骤应在黄光下进行。室内禁止使用白光。 - 为获得约40 µm的均匀光刻胶厚度（专用于流体层，适用于早期幼虫L1至L3阶段的成像），在硅片上使用旋涂仪涂覆约1.5 mL负性光刻胶-1，先以500 rpm旋转5秒，再以2,000 rpm旋转30秒。
- 对第二片硅片重复步骤1.1.4和1.1.5，以获得约40 µm的均匀光刻胶厚....
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结果
装置表征： 生长与成像装置由两层通过不可逆等离子体键合技术键合在一起的聚二甲基硅氧烷（PDMS）层构成（图1）。流体层（图案1）长度为10 mm，高度为40 µm或80 µm，可用于在液体培养条件下培养线虫（图1A）。捕获层（图案2）具有一个宽2 mm的膜结构（图1B），用于在高分辨率成像过程中固定线虫。捕获层的掩膜设计还包含一对隔离膜，用于在连续成像时间点之间限制线虫在流道某一段区域内的移动。该装置的捕获膜结构源自我们先前的成像装置3。当前装置（图1C,L）新增了隔离膜，并将捕获膜的宽度增加至2 mm，从而可在多个时间点高效固定同一只线虫。
为测试该装置，使用微移液器将洁净的蒸馏水注入连接捕获膜的微流控通道中（
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讨论
本文介绍了一种用于培养的简易微流控装置的制备与使用方案 秀丽隐杆线虫 在持续供应食物的条件下对单个动物在发育过程中进行高分辨率成像的方法已有描述。该 fabrication 过程简单，可在非无菌环境中进行，但 fabrication 步骤中必须保持无尘环境。灰尘颗粒的存在会导致两个结合面接触不良，从而引起键合效果差，并在高压应用时导致装置泄漏 秀丽隐杆线虫 被固定。在所有制备的装置中，95%的装置适用于实验。少数装置（5%）因制备或使用过程中键合不当而失效。通过在无尘环境中进行制备过程，可减少键合失败的情况。> 1,000级洁净室），全球多所学术机构均可提供。为清除流道中的细菌培养物并实现装置重复使用，每次实验后需将酒精通入装置进行冲洗。
本方案展示了一种采用简单设计的光刻 fabrication 工艺，该设计可轻松修改以适应不同发育阶段和体型的 C. elegans。此外，通过增加流动层和捕获层的尺寸3，该装置设计还可适用于其他模式生物，如斑马鱼和 Drosoph.......
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披露
S.M. 和 S.P.K. 是一项关于微流控培养与成像装置的待审批专利的发明人（专利申请号 640/CHE/2011）。
致谢
感谢NCBS的CIFF成像中心提供共聚焦显微镜的使用权限，该设施由印度科技部纳米技术中心（DST - Centre for Nanotechnology，项目编号：SR/55/NM-36-2005）资助。感谢DBT（SPK）、CSIR-UGC（JD）、DST（SM）、DBT（SM）提供的研究经费，转盘共聚焦显微镜由DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202（SPK和Gautam Menon）资助，以及HHMI-IECS资助项目编号55007425（SPK）。HB101、PS3239 和 wdIs51 菌株由秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（NIH Office of Research Infrastructure Programs，P40 OD010440）资助。S.P.K. 在Mike Nonet实验室构建了jsIs609菌株。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 号针头 | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 18 号 | |
| 三通旋塞阀 | Cole-Parmer | WW-30600-02 | 带鲁尔锁的 Masterflex 接头 |
| CCD 相机 | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| 电路板薄膜 | Fine Line Imaging, Colorado, USA | 设计以每英寸 65,024 点（DPI）打印 | |
| 鼓风干燥箱 | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| 盖玻片 | Blue stat 显微镜盖玻片 | 22 mm × 10 克 | |
| 乙醇 | Hi media | ||
| Harris uni-core 打孔器 1 mm | Qiagen | Z708801 | |
| 六甲基二硅氮烷 | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| 加热板 | IKA | RCT B S 22 | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| 激光扫描显微镜 | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| 微量移液器吸头 | Tarsons | 使用 0.5–10 µL 微量移液器吸头供给食物 | |
| 负性光刻胶-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| 负性光刻胶-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| 氮气 | 本地供应商 | 商用氮气 | 气瓶容积为 7 立方米 |
| PDMS（固化液） | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 固化液 | 固化剂 |
| 培养皿 | Praveen Scientific Corporation | ||
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| 剃刀和刀片 | Lister 外科刀片 | ||
| 硅弹性体（基底） | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 基底 | 弹性体基底 |
| 硅胶管 | Fisher Scientific | 内径 1.59 mm、外径 3.18 mm 的塑料管 | |
| 硅晶圆 | University Wafer, MA, USA | [100] 晶向，直径 4 英寸 | 从直径 100 mm 的晶圆上切割出小片（2 mm × 2 mm） |
| 旋涂仪 | SPS-Europe B.V., 荷兰 | SPIN 150 | |
| 转盘共聚焦显微镜 | Perkin Elmer ultra-view VOX 系统 | CSU-X1-A3 N | 该系统配备四种激光（405/488/561/640 nm），并由 Volocity 软件包控制。 |
| SU8 显影液 | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气有毒 |
| 紫外灯 | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 瓦准直紫外光源 | |
| Volocity 软件 | Perkin-Elmer | 图像分析 |
参考文献
- Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
- Hobert, O. Neurogenesis in the nema....
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重印与许可
