DetectSyn:一种快速、无偏倚的荧光方法，用于检测突触密度的变化

突触是神经元¹之间通信的基本单位。同一区域内神经元之间的许多突触会产生介导行为的回路²。突触由来自一个神经元的突触前末端组成，该神经元释放神经递质或神经肽，将信息传递给另一个神经元的突触后受体。突触前信号的总和决定了突触后神经元是否会激发动作电位并将信息传播到其他神经元。

突触病理学，突触的分解，出现在以神经体积减少为特征的疾病和病症中，如阿尔茨海默病和重度抑郁症，导致回路不再最佳执行^3，4，5。恢复突触密度可能是这些疾病潜在治疗方法的有效性的基础。例如，最近证明，增加突触是快速抗抑郁药的行为功效的基础⁶。为了快速筛选可能的突触病理学治疗，研究人员需要快速识别突触数量变化的技术。

目前的方法既耗时又昂贵（电子显微镜检查、阵列断层扫描），或者它们仅检查突触后的变化，而不结合突触前的参与（脊柱分析、免疫荧光/共定位）。像DiI这样的染料或像GFP这样的荧光蛋白有助于可视化神经元和表征突触后棘。然而，脊柱分析使用研究人员定义的比例来确定形态，这可能会降低再现性⁷.此外，不同的脊柱类别如何与功能突触相关仍在被揭示⁸。脊柱的形成可能是短暂的，可能反映突触后可塑性，但这些棘可以在稳定成突触前神经元⁹的突触之前被消除。

与脊柱分析相比，共定位为突触提供了更好的代理，因为人们可以免疫染色突触前和突触后蛋白。然而，突触蛋白可能产生低共定位值，因为蛋白质是并置的，可能不会始终如一地重叠。因此，由于蛋白质不是完全叠加的，共定位技术可能无法准确测量由于这种缺失信息而导致的突触形成的变化。最后，尽管电子显微镜（EM）和阵列断层扫描都提供了突触的高分辨率图像，但它们非常耗时。EM进一步需要专门的设备，研究人员在任何给定的实验中都仅限于小体积的组织。虽然阵列断层扫描优雅地提供了在超薄切片上筛选许多蛋白质的能力，并且可以与EM¹⁰结合使用，但这种技术可能过于劳动密集型，并且超出了需要快速扫描突触形成变化的实验范围。

DetectSyn是Duolink接近连接测定的特定应用。PLA测定允许对蛋白质 - 蛋白质相互作用进行一般检测。DetectSyn通过在彼此相距40nm内的标记突触前和突触后蛋白发出的荧光信号来桥接突触后测量。如果突触蛋白在40nm以内，如在突触间隙内，则含有DNA探针的二抗将杂交成环状DNA。这种杂交的环状DNA表达荧光探针，然后用标准荧光显微镜技术将其扩增并检测（见 图1）。至关重要的是，与EM和阵列断层扫描不同，该技术不需要专门的设备，并且需要与标准免疫组织化学相同的时间。因此，该技术的可访问性使研究密集型机构以外的研究人员能够参与突触病理学研究。此外，该技术可以在单个实验中检查多个大脑区域中突触密度的变化，从而更全面地表示由于疾病或治疗引起的突触变化。

从动物中分离细胞和组织符合美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南，并得到维克森林机构动物护理和使用委员会的批准

注意:该协议用于已处理并根据特定实验范例和要求固定的样品。为了演示目的，由于快速抗抑郁药治疗引起的突触形成用于突出这种突触检测技术⁶。先前在盖玻片上培养，处理，固定在4%多聚甲醛（PFA）中并储存在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的神经元将用于突出 体外 程序。先前从小鼠中切片的海马组织（25μm厚）从处理，用冰冷的PBS和4%PFA经心灌注，然后储存在冷冻保护剂中将用于突出切片程序。有关如何培养神经元或经心灌注啮齿动物的更多信息，请参阅^11，12 。有关此过程的图形表示形式，请参见 图 1 。

图 1:DetectSyn 测定的图形表示。 在通透细胞膜后，Synapsin1和PSD95的一抗与这些突触蛋白结合。然后，具有寡核苷酸标签的次级药物与一抗结合。如果Synapsin1和PSD95在40nm以内，如在突触处，则寡核苷酸相互作用，并且荧光标记被放大。然后可以通过标准显微镜对该荧光信号进行成像和分析。 请点击此处查看此图的大图。

1. 冲洗样品

1. 用500μL1x PBS + 0.75%甘氨酸冲洗样品5分钟3次，在轨道振荡器上轻轻搅拌以除去残留的PFA或冷冻保护剂。

2. 阻断和渗透样品

1. 在1x PBS中制备封闭和透化溶液（10%正常驴血清，0.25%吐温20）。准备足够的准备，用于封闭，原发和二次孵育。
2. 对于24孔板中的样品（例如，盖玻片或自由浮动切片），加入500μL封闭和透化溶液。确保每个孔包含不同的样品，并适当标记以防止样品被切换。
3. 对于培养的细胞，将样品在室温（RT）下孵育60分钟，对于切片组织，在室温（RT）下孵育2小时。使用眼眶摇床进行温和搅拌。

3. 在一抗中孵育样品

1. 在封闭缓冲液中制备一抗:
   1. 准备突触后密度95（PSD95;1:500，兔多克隆），突触素1（1:500，小鼠单克隆），MAP2（1:400，鸡多克隆）
   2. 准备一个阴性对照等分试样，省略其中一个突触对（例如，没有PSD95）
2. 用塑料巴斯德移液器小心地去除封闭溶液。尽量去除，不要干扰细胞或撕裂组织。
3. 对于培养的细胞:
   1. 在大型塑料培养皿中衬有薄膜。使用镊子小心地将盖玻片转移到护膜上。
   2. 小心地将60μL一抗溶液加入盖玻片的顶部。确保不要将一抗溶液洒在盖玻片的侧面。
   3. 为了在孵育期间提供湿度并防止样品变干，将超纯水添加到较小的培养皿中，并小心地将小培养皿布置在盖玻片周围。
   4. 覆盖大培养皿，并在室温下孵育培养的细胞1小时。
4. 对于切片纸巾:
   1. 小心地将250μL一抗溶液加入24孔板中的自由漂浮切片中。
   2. 盖上板并在4°C下孵育组织过夜，并在眼眶振荡器上轻轻搅拌。

4. 洗涤样品，然后在二抗中孵育

1. 在封闭缓冲液中制备二抗:
   1. 准备驴反老鼠（1:5），驴反兔子（1:5），驴反鸡（1:400）。
   2. 在此步骤中，可以通过制备省略抗小鼠或抗兔二级的二次等分试样来获得额外的技术控制。
2. 对于培养的细胞:
   1. 使用镊子，小心地将主要溶液从盖玻片上敲到纸巾上
   2. 使用镊子，小心地将盖玻片转移回其原始的24孔板，其中装有500μL的1x PBS。
3. 对于切片纸巾:
   1. 用塑料巴斯德移液管小心地取出一抗溶液。尽量去除，不要撕裂组织。
   2. 加入 500 μL 1x PBS
4. 在1x PBS中洗涤样品10分钟3次，并在轨道振荡器上轻轻搅拌。在此期间，将所有洗涤缓冲液置于室温状态。
   1. 在此期间，更换大培养皿中的parafilm
5. 对于培养的细胞:
   1. 使用镊子，小心地将盖玻片移回滑膜大培养皿
   2. 小心地将40μL二抗溶液加入盖玻片的顶部。确保不要将二抗溶液溢出盖玻片的侧面。
   3. 如果需要，将更多的超纯水添加到较小的培养皿中，并小心地将小培养皿布置在盖玻片周围。
   4. 覆盖大培养皿
6. 对于切片纸巾:
   1. 小心地将250μL二抗溶液加入24孔板中的自由漂浮切片中。
   2. 盖板
      注意:从这里开始，通过用箔包裹板的顶部来保护样品免受光照。
7. 将样品在37°C下孵育1小时

5. 结扎

1. 将连接液1:5混合在分子级水中。
2. 与第4节一样，小心地转移盖玻片并从切片组织中取出二次混合物。
3. 在500μL洗涤缓冲液A中洗涤样品
   1. 对于培养的细胞，洗涤2次5分钟。对于切片的组织，洗涤2次，持续10分钟。在眼眶摇床上对两者都使用温和的搅拌。
   2. 在此期间，更换大培养皿中的parafilm
4. 在将连接酶保持在冷块上的同时，从步骤5.1开始，在连接液中以1:40稀释连接酶。在将连接酶添加到样品中之前立即进行这种稀释。
5. 与第4节一样，在加入连接酶之前，从样品中取出尽可能多的洗涤缓冲液A。
6. 对于培养的细胞:将盖玻片转移回副膜培养皿。将40μL连接混合物加入盖玻片中，在盖玻片周围布置小的充满水的培养皿，并覆盖大培养皿。
7. 对于切片组织:将步骤5.4中的250μL连接混合物加入每个孔并盖上板。
8. 将样品在37°C下孵育30分钟。

6. 放大

1. 将扩增储备液1:5混合在分子级水中。
2. 与第4节一样，小心地转移盖玻片并从切片组织中取出连接混合物。
3. 在500μL洗涤缓冲液A中洗涤样品
   1. 对于培养的细胞，洗涤2次2分钟。对于切片的组织，洗涤2次，持续10分钟。在眼眶摇床上对两者都使用温和的搅拌。
   2. 在此期间，更换大培养皿中的parafilm
4. 在将聚合酶添加到样品中之前立即进行这种稀释。在将聚合酶保持在冷块上时，稀释聚合酶
   1. 对于培养的细胞，在步骤6.1的扩增储备液中稀释聚合酶1:80。
   2. 对于切片的组织，在步骤6.1的扩增储备液中稀释聚合酶1∶40。
5. 与步骤4一样，在加入聚合酶之前，从样品中除去尽可能多的洗涤缓冲液A。
6. 对于培养的细胞:将盖玻片转移回副膜培养皿中。将步骤6.4.1中的40μL扩增混合物加入盖玻片中，在盖玻片周围布置小的充满水的培养皿，并覆盖大培养皿。将样品在37°C下孵育100分钟。
7. 对于切片组织:将步骤6.4.2中的250μL扩增混合物加入每个孔中并盖上板。将样品在37°C下孵育2小时。
   注意:在此期间，请准备幻灯片并为其添加标签。

7. 安装

1. 如步骤4所示，小心地转移盖玻片并从切片组织中取出扩增混合物。
2. 在500μL洗涤缓冲液B中洗涤样品2次，在轨道振荡器上轻轻搅拌10分钟。
3. 在500μL1%洗涤缓冲液B中洗涤样品1分钟，在轨道振荡器上轻轻搅拌。
4. 对于培养的细胞:
   1. 将 3 μL 安装介质滴到载玻片上
   2. 从盖玻片上轻拍多余的洗涤缓冲液，然后将盖玻片（细胞朝下）放入安装介质中。用少量透明指甲油密封侧面，将盖玻片密封到位。
5. 对于切片纸巾:
   1. 小心地将纸巾片转移到准备好的载玻片上并排列，使切片平放。将5-10μL上样培养基（量取决于切片的大小）滴到组织切片上
   2. 小心地将玻璃盖玻片放在纸巾片上，并沿边缘用少量透明指甲油密封，以将盖玻片密封到位。
6. 在显微镜下分析之前等待至少15分钟，或储存在-20°C。

8. 使用共聚焦显微镜获取数字图像

1. 优化所有处理样品的采集设置（例如，激光功率、增益、偏移）。确保优化包括降低背景噪声和增强信号，而不会使荧光信号的强度过饱和。确定设置后，对获得的所有图像应用相同的采集设置。
   注:以下采集细节可与尼康A1共聚焦显微镜和尼康NIS AR Elements软件配合使用。
2. 在载物台上设置带有样品的载玻片，并通过目镜使用DAPI找到样品的焦平面。
3. 通过单击"眼睛端口"关闭 眼睛端口 ，然后选择一个光学配置按钮来调整设置。
4. 调整每个荧光通道的增益、偏移和激光功率，以降低背景噪声并增强荧光信号。确保荧光信号不会像步骤8.5-8.6中提到的那样变得过饱和。
5. 使用荧光信号的伪彩色监测过饱和度。在实时图像的底部，右键单击标有当前正在使用的荧光通道的选项卡。
6. 接下来，选择 通道着色 并选择伪颜色（如 彩虹暗）， 以在类似热图的伪颜色中可视化荧光强度。在彩虹暗中，较冷的颜色表示荧光强度较小，较热的颜色表示较高的荧光强度。
7. 优化所有荧光灯通道后，右键单击之前选择的光学配置按钮，然后为此按钮 选择"分配当前相机设置 "。
8. 验证所选设置是否足以用于每个治疗组中的随机样本。如果所选设置使这些样品中的任何一个过饱和，请重复步骤8.4以消除过饱和度。
9. 对于培养的神经元，请按照步骤8.10-8.16进行操作。
10. 使用眼孔，搜索具有与其他树突重叠最小的树突的神经元。
11. 关闭眼孔并使用DAPI通道可视化所选神经元的细胞体。双击体细胞的中心，使神经元在视野的中间居中。
12. 使用 MAP2 通道，通过实时扫描找到 MAP2 信号的最佳聚焦平面。
13. 在" ND 采集 "选项卡下，单击" 保存到文件" ，然后在" 浏览"下选择要将图像保存到的文件。然后，输入文件名。
14. 在 Z 选项卡下，选择" 由范围定义的对称模式 "选项。将焦点设置为最佳 MAP2 平面，然后单击" 相对"按钮 将此焦点平面设置为 z 堆栈的中间。
15. 将范围设置为 5 μm，步长为 1 μm，并确保选中 Z 轴移动期间关闭活动快门。在" 波长 "选项卡下，选择光学按钮的名称，并在" 光学会议"下使用先前配置的采集设置。然后，单击" 立即运行"。
16. 重复步骤8.1.10-8.1.15，每个盖玻片/治疗约10个神经元。
17. 对于切片的组织，请按照步骤8.18-8.22进行操作。
18. 使用眼孔，搜索感兴趣的区域。例如，定位海马体的 CA1。
19. 关闭眼孔并使用 MAP2 通道通过实时扫描找到 MAP2 信号的最佳焦平面。
20. 在" 采集 "菜单下，选择" 扫描大图像"。接下来，从打开的面板中选择光学按钮的名称以及先前配置的采集设置，在" 捕捉 "面板下。此外，请确保在此面板中选择正确的物镜。
21. 在" 面积 "面板和目镜下，使用箭头键设置感兴趣区域的边界。接下来，单击" 将大图像保存到文件" ，然后为图像创建保存路径文件名。
22. 在 "设置" 面板下，确保选中" 多通道捕捉 "，然后在"光学会议"下使用先前配置的采集设置选择 光学按钮的名称。
    注意:可以对大图像使用 z 轴堆栈，但会增加扫描时间。

9. 分析

1. 与采集设置类似，使用来自所有处理的样本来优化阈值设置。确保阈值优化侧重于降低背景噪声和增强信号，而不会使荧光信号的强度过饱和。确定这些设置后，按照步骤 9.2-9.3 中所述，对用于分析的所有影像应用相同的阈值设置。
2. 在 ImageJ 中，阈值选项位于"图像"菜单 "下，>调整>阈值"。如果图像 具有深色背景 ，请选择"深色背景"选项。
3. 接下来，根据先前确定的优化阈值设置调整阈值的上限和下限，然后单击" 应用"。
4. 对于培养的细胞，使用 MAP2 通道和手绘感兴趣区域 （ROI） 工具为每个神经元（包括树突和体细胞）绘制 ROI。对于切片组织，在切片图像中绘制一个手绘ROI，该图像封装了感兴趣的区域（例如，海马体内CA1的放射性层）。
5. 获取 ROI 的面积。在 ImageJ 中，测量菜单" 分析">"测量"下的面积。
6. 按照步骤 9.7-9.9，使用自动检测工具（如 ImageJ 中的粒子分析）检测每个 ROI 中的点点数。
7. 在"分析"菜单下找到"粒子分析"选项>"分析粒子"。首先，定义点状直径，通常为0.1-3μm2。
8. 接下来，从显示下拉菜单中选择叠加蒙版选项，然后选中显示结果选项。然后，单击"确定"。
9. 如果在选择的直径范围下未检测到点状点，请调整范围，直到使用此分析检测到所有点状点。确保对所有图像使用相同的粒子分析设置。
10. 按照步骤9.11-9.13将点符号的数量除以单个感兴趣区域的区域。
11. 将 ImageJ 的"结果"弹出窗口中每个图像的结果复制并粘贴到电子表格中。
12. 首先，确定从哪个文件和样本中获取数据。然后，将 ROI 的面积除以点数。
13. 然后，清除"结果"弹出窗口中的数据，并重复步骤 9.2-9.12。
14. 将结果归一化为对照样品:对对照样品的结果（点状/ROI 区域数）求平均值。然后，将所有样品获得的结果除以对照的平均值，以获得归一化结果。对照样本的新平均值应等于 1。

本文介绍了从Heaney等人6 修改的数据，以证明一个预计突触形成增加的实验（有关更多信息和对该机制的更深入讨论，请参阅6 ）。先前，已经证明快速抗抑郁药需要激活抑制性代谢受体GABAB（γ-氨基丁酸亚型B）才能有效13。此外，先前的数据表明，快速抗抑郁药增加突触后标志物14;因此，DetectSyn被用来验证快速抗抑郁药增加突触数量是有效的假设。

在培养的神经元中，测试四种条件。首先，在 图2A的顶部面板中，在与实验对照相同的条件下用载体处理培养的神经元。然而，为了提供 DetectSyn 测定的技术对照，省略了 PSD95 一抗（参见 图 1 了解每种组分如何对信号产生影响）。接下来，在控制面板中，神经元再次用载体处理，但同时接受PSD95和Synapsin1原代。接下来，仅用快速抗抑郁药Ro-25-6981（Ro）或Ro加上GABAB激动剂巴氯芬（Bac）治疗培养的神经元。如前所述13，快速抗抑郁药Ro-25-6981和GABAB激动剂巴氯芬都是Ro-25-6981 体外 疗效所必需的。因此，突触形成的增加通过白色点状细胞的增加来证明（图2A）。如果没有巴氯芬， 体外 突触形成没有增加。

在体内，基础GABA水平足以使快速抗抑郁药起作用13，因此只有快速抗抑郁药Ro-25-6981通过腹膜内注射给小鼠（图2B）。图2B的左侧面板代表DetectSyn测定的另一种技术控制。来自盐水处理的小鼠的海马组织用PSD95和Synapsin1的原代物探测，但省略了其中一个次级。与盐水处理的小鼠相比，使用快速抗抑郁药Ro-25-6981治疗引起的突触形成增加在 图2B的中间和右侧面板中显示。

显示 体外 和 离体 技术对照的代表性图像。在 图2A中，省略了突触对的一个原基（即PSD95），在 图2B中，省略了其中一个次级。虽然技术控制图像中出现了一些点状点，但它们的尺寸通常不同，如图 2A 顶部面板中的白色斑点与其他面板中的大点状点相比所示。此外，这些pncta与量化的pncta不在同一位置，如图 2B中技术控制的soma中出现的一些puncta所示。通常，非特异性点状细胞发生在细胞核内，可能是由于DNA的存在。

为了分析 图2A中的代表性结果，使用手绘工具追踪枝晶（通过MAP2染色可视化并以灰色轮廓表示）以创建感兴趣区域（ROI）。首先，使用NIS Elements函数（ "自动测量结果 "选项卡下的ROI数据）获得MAP2 ROI的面积。接下来，使用 NIS 元素中的阈值函数检测 puncta。此函数为落在定义的强度阈值内的对象创建二进制遮罩。然后，使用" 自动测量结果 "选项卡下的 NIS 元素函数（ROI 中的二进制）检测 MAP2 ROI 中的二进制对象数。 图2A 右侧图表中显示的数据是点状点的归一化值除以ROI的面积。

为了分析图2B中的代表性结果，使用手绘工具追踪CA1的地层辐射层以创建ROI。首先，使用ROI数据函数获得ROI的面积，如上段所述。接下来，使用位于"二进制"菜单下的"斑点检测 - 亮点"功能检测点状点。接下来，根据对所有处理中的多个切片的目视检查来选择直径和对比度值。确定这些值后，将它们均匀地应用于所有分析的图像。斑点检测功能可在定义的直径和对比度参数集内创建对象的二进制蒙版。然后，使用"自动测量结果"选项卡下的 NIS 元素函数（ROI 中的二进制）检测 MAP2 ROI 中的二进制对象数。图2B右侧图表中显示的数据是点的归一化值除以ROI的面积。

图2:使用DecatchSyn测定检测突触。 白色点状突触代表使用 DetectSyn PSD95-Synapsin1 邻近连接测定（黄色箭头）在 （A） 体外 培养的原代海马神经元和 （B） 离体 CA1 层辐射中检测到的突触。在（A）中，灰色轮廓表示MAP2染色。在（A）中，标记为PLA控制的顶部面板表示仅使用车辆处理的样品，如控制装置。然而，PSD95原代未包含在反应中。在最后两个小组中，用快速抗抑郁药Ro-25-6981（Ro，10μM）或Ro加GABAB激动剂巴氯芬（Bac，50μM）处理神经元90分钟。点状物数量的增加（用黄色箭头标识）表明 ，在体外，只有当快速抗抑郁药Ro-25-6981与GABAB激动剂一起施用时，突触形成才会增加。在（B）中，绿色代表用MAP2染色的树突，蓝色代表用DAPI染色的细胞核。在合并图像中以黄色矩形勾勒的单个树突被隔离在代表性图像下方，以证明点状突定位于树突上。用Ro-25-6981（10mg / kg）处理动物，并在处理后45分钟收集组织。点状突触数量的增加（由黄色箭头标识）表明 ，在体内，突触的数量随着基底GABA信号传导和快速抗抑郁药Ro-25-6981的增加而增加。代表性结果的量化由条形图表示，并指示 DetectSyn 点数除以 MAP2 面积的平均数量。结果归一化到实验对照。使用尼康A1plus共聚焦显微镜获得图像。比例尺 = （A） 10 μm;（B，顶部）50μm;（B，底部）5 μm。柱表示平均值的平均值 +/- 标准误差。单因子方差分析结果:*p <0.05，**p <0.01，*** p <0.001，**** p < 0.0001。该图已从Heaney等人6修改而来。 请点击此处查看此图的大图。

作者报告没有利益冲突。