可调纳米尺度尺寸与组分的锰铁氧体簇稳定水悬浮液

摘要

我们报道了一种一步水热法合成锰铁氧体簇（MFCs）的方法，该方法可独立调控材料的尺寸和组成。通过磁性分离可实现快速纯化，而利用磺化聚合物进行表面功能化则确保材料在生物相关介质中不发生聚集。所得产物在生物医学应用方面具有良好的前景。

摘要

锰铁氧体簇（MFCs）是由数十至数百个初级纳米晶体组成的球形聚集体，其磁性在多种应用中具有重要价值。本文介绍了一种水热法合成此类材料的方法，该方法可独立调控产物簇的尺寸（30–120 nm）以及所得材料中的锰含量。加入醇类反应体系中的总水量、锰与铁前驱体的比例等参数，是获得多种类型MFC纳米材料的关键因素。一种快速纯化方法利用磁性分离技术回收产物，使克级磁性纳米材料的制备过程非常高效。我们通过在纳米材料表面修饰高电荷磺酸盐聚合物，解决了磁性纳米材料易聚集的难题，从而获得胶体稳定性良好的MFCs，即使在高盐环境中也能保持不聚集状态。这些不聚集、均一且可调控的材料在生物医学和环境领域具有广阔的应用前景。

引言

在适当条件下，将锰作为掺杂剂引入氧化铁晶格中，可使材料在高外加磁场下的磁化强度高于纯氧化铁。因此，锰铁氧体（Mn_x铁_3-xO₄）纳米颗粒由于具有高饱和磁化强度、对外加磁场的强响应性以及低细胞毒性，是极具吸引力的磁性纳米材料^1,2,3,4,5单个纳米晶以及由这些纳米晶组成的簇状结构（称为多畴颗粒）已在多种生物医学应用中得到研究，包括药物递送、用于癌症治疗的磁热疗以及磁共振成像（MRI）。^6,7,8例如，Hyeon 团队在2017年利用单域锰铁氧体纳米颗粒作为芬顿催化剂以诱导肿瘤缺氧，并利用该材料的 T₂MRI 追踪的对比度⁹鉴于这些及其他关于铁氧体材料的积极研究，令人惊讶的是相关研究仍然很少 在体内 与纯氧化铁（Fe₃O₄纳米材料，且尚无在人体中应用的报道^9,10.

将铁氧体纳米材料的特性转化为临床应用面临的一个巨大挑战是生成均匀、不聚集的纳米级团簇^11,12,13,14。尽管单畴纳米晶体的传统合成方法已较为成熟，但本研究中所关注类型的多畴团簇却难以以均匀且可控的方式制备^15,16。此外，铁氧体的组成通常是非化学计量的，且不能简单地由前驱体的初始浓度决定，这进一步阻碍了对这些材料系统性的结构-功能表征^9,12,13,17。在此，我们通过展示一种合成方法解决了这些问题，该方法可独立调控锰铁氧体纳米材料的团簇尺寸和组成。

这项工作还提供了一种克服铁氧体纳米材料胶体稳定性差的方法^18,19,20。磁性纳米颗粒通常由于强烈的颗粒间吸引力而易于发生聚集；铁氧体材料受此问题影响更为严重，因其较大的净磁化强度会加剧颗粒聚集。在相关的生物介质中，这些材料会形成足够大的聚集体，导致材料迅速沉降，从而限制了其对动物或人体的暴露途径^20,21,22。Hilt 等人在研究磁热加热和染料降解时发现了颗粒间聚集的另一后果²³。在颗粒浓度略高或暴露于磁场的时间延长的情况下，随着颗粒随时间发生聚集，活性颗粒表面积减少，材料的效能也随之降低。上述及其他应用均可受益于设计用于提供空间位阻、阻止颗粒间相互作用的团簇表面^24,25。

本文报道了一种可控制尺寸和成分的锰铁氧体簇（MFCs）的合成方法。这些多畴颗粒由初级锰铁氧体纳米晶体紧密聚集而成；初级纳米晶体之间的紧密关联增强了其磁学性能，并使整体簇尺寸（50–300 nm）恰好处于纳米药物所需的最优尺度范围。通过调节水和氯化锰前驱体的用量，可独立调控产物的整体直径和组成。该方法采用简单高效的单釜水热反应，便于频繁实验和材料优化。这些MFCs可被轻松纯化为高浓度产物溶液，并进一步通过磺化聚合物进行修饰，从而赋予其胶体稳定性。其可调性、均一性及溶液相稳定性，均使其成为纳米材料在生物医学与环境工程应用中极具价值的特性。

方案

1. 对微纤毛结构的总体直径和铁氧体成分进行调控的微纤毛结构合成

1. 清洗并将合成过程中使用的所有玻璃器皿彻底干燥。合成中的水量会影响MFC的尺寸，因此必须确保玻璃器皿中无残留水分^16,26。
   1. 清洗玻璃器皿时，先用自来水和洗涤剂冲洗，并用烧瓶刷擦洗以去除残留物。随后彻底冲洗以去除所有洗涤剂，最后用去离子水冲洗一次。
   2. 干燥玻璃器皿时，将表面的水滴甩掉，然后放入60°C的烘箱中直至完全干燥。
   3. 用37%盐酸冲洗聚苯撑衬里（PPL）反应器，以去除之前使用留下的任何残留物。操作时，将反应器及其盖子放入一个大烧杯中，加入盐酸直至完全浸没反应器。静置30分钟后倒出盐酸。接着用自来水持续冲洗装有反应器的烧杯1–2分钟，然后将反应器放入烘箱中干燥。
2. 使用自动移液器将20 mL乙二醇转移至含有磁力搅拌子的50 mL烧杯中。
3. 称取所需量的三氯化铁（FeCl₃·6H₂O，固体），使其最终浓度达到1.3 mM，并加入烧杯中。将烧杯置于搅拌台上，开启搅拌，转速设为480 rpm，开始持续搅拌。
   注意：由于该物质为水合物，必须迅速称量并加入，以避免从空气中吸收水分。
4. 称取250 mg聚丙烯酸（PAA，分子量~6,000，粉末），加入烧杯中。加入PAA后，溶液变为不透明且颜色略变浅。
5. 称取1.2 g尿素（CO(NH₂)₂，粉末），加入烧杯中。
6. 使用移液器向烧杯中加入0.7 mM氯化锰（MnCl₂·6H₂O 水溶液，3.5 M，0.2 mL）。
7. 最后，使用移液器向烧杯中加入所需量的超纯水（0.5 mL）。
8. 让溶液搅拌30分钟，并观察颜色变化。此时溶液呈半透明的深橙色。
9. 将反应混合物转移至聚苯撑衬里（PPL）反应器中。注意：溶液搅拌后，可能有部分固体附着在烧杯壁上。
   1. 使用磁铁（立方体永磁稀土磁铁，40 × 40 × 20 mm，后续所有分离和磁性收集操作中均简称为"磁铁"）带动搅拌子在烧杯内壁移动，确保附着在壁上的固体重新分散到反应溶液中。
   2. 待溶液充分混合后，将其转移至50 mL PPL衬里反应器中。
   3. 使用夹具和杠杆尽可能紧密地将反应器密封于不锈钢高压釜中。将反应器固定在稳定表面上，将一根金属棒插入盖子作为杠杆，推动反应器完成密封。注意：密封后的反应器应无法用手打开。这一点至关重要，因为烘箱内的高压环境要求反应器必须具备严密的密封性。
10. 将反应器放入215 °C的烘箱中反应20小时。
11. 水热反应完成后，从烘箱中取出反应器，使其冷却至室温。随着压力释放，反应器可手动打开。此时，反应器内含有分散在乙二醇中的MFC产物，以及未反应的聚合物等杂质，呈不透明黑色溶液。后续步骤将对产物进行分离。

2. MFCs 的磁分离与纯化

1. 将 200 mg 钢棉放入玻璃小瓶中。用反应器中的反应混合物填充该玻璃小瓶至一半体积，然后用丙酮加满小瓶并充分振荡。注意：钢棉可增强小瓶内的磁场强度，有助于纳米簇从溶液中实现磁性分离。
2. 将小瓶置于磁铁上以进行磁性收集。结果将得到上层为透明溶液、底部有沉淀物的混合物。
   1. 倾倒上清液时，将磁铁保持在小瓶底部，使磁性功能簇（MFCs）被钢棉磁性捕获。此步骤中大部分乙二醇将被去除。
   2. 开始使用丙酮与水较低比例的混合液洗涤，随后逐步提高丙酮比例，直至洗涤液为纯丙酮。重复此步骤 3–4 次。
3. 将小瓶从磁铁上取下，并加满水。充分振荡以溶解磁性功能簇（MFCs）。此时产物将完全分散于水中。
4. 重复前两个步骤数次，直至磁性功能簇（MFCs）的水溶液在振荡时不再产生气泡。最终得到一种深色、不透明的磁性液体，对磁铁具有强烈响应。
   注意：在典型的合成中，使用 20 mL 乙二醇时，可获得约 80 mg 的磁性功能簇（MFCs）产物。

3. 面向超高胶体稳定性的微纤丝纤维素表面功能化

注意：硝基多巴胺和聚（丙烯酸-共-AMPS-共-PEG）的合成方法可参见我们之前的工作¹⁶。该共聚物通过自由基聚合制备。将0.20 g 2,2′-偶氮二(2-甲基丙腈)（AIBN）、0.25 g 丙烯酸（AA）、0.75 g 2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸（AMPS）和1.00 g 聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯（PEG）加入10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中。将混合物在70 °C水浴中加热1小时，然后转移至透析袋（纤维素膜，3 kDa）中，在水中透析。AA、AMPS和PEG的重量比为1:3:4。这些单体的聚合转化率为100%，经冷冻干燥并称重确认。

1. 在20 mL小瓶中加入10 mL纯化的纳米颗粒（约100 mg）和10 mL饱和的N-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]硝胺（硝基多巴胺）溶液（约1 mg/mL）。静置5分钟。
2. 使用磁分离法洗涤经硝基多巴胺包覆的磁性富勒烯材料（MFCs），倒去淡黄色上清液。加入水并剧烈振荡，然后利用磁铁吸附保留产物，倒去水。重复此洗涤步骤数次，最终在小瓶中保留深棕色产物。
   注意：配制浓度为20 mg/mL的水溶液、浓度为100 mg/mL的缓冲溶液，以及浓度为20 mg/mL的聚（丙烯酸-共-2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-共-聚乙二醇）（poly(AA-co-AMPS-co-PEG)）聚合物溶液。
3. 将1 mL EDC溶液、1 mL MES缓冲液和3 mL聚合物溶液混合，轻轻旋转搅拌混合物，静置约5分钟。完全混合后应得到澄清无色的溶液。
4. 将上述混合液加入MFC收集物中，并将小瓶置于冰浴中。将探头式超声破碎仪插入溶液中，然后开启（功率250瓦，频率20 kHz）。
   1. 超声处理5分钟后，在超声持续进行的同时向小瓶中加入约5 mL超纯水。持续观察容器，确保无产物溅出。保持冰浴中的冰量，因超声过程产生的热量会使部分初始加入的冰融化。
   2. 继续超声处理25分钟，累计超声时间共30分钟。
5. 将小瓶置于磁铁上方，使MFCs磁分离，倒去上清液。
6. 用去离子水多次洗涤修饰后的MFCs。
7. 用超纯水充满含有MFCs的小瓶，将液体用移液器转移至真空过滤系统，使用孔径0.1 µm的聚醚砜膜滤器，以去除任何不可逆聚集的MFCs。确保冲洗漏斗壁，以尽量减少产物损失。
8. 对溶液进行真空过滤，重复此过程2–3次。最终获得单分散MFCs的纯化水溶液。
   注意：约有10%的产物会不可逆聚集，该部分物质将滞留在滤膜上，应予以弃去。

结果

水热处理后，反应混合物会转变为一种黏稠的黑色分散液，如图1所示。经过纯化后得到的是高浓度的磁性纤维素溶液，其行为类似于磁流体。当将样品瓶靠近手持磁铁（<0.5 T）时，液体在数秒内即产生响应，形成可随磁铁位置移动而移动的宏观黑色聚集体。

该合成反应所得产物的尺寸和铁氧体组成取决于反应混合物中添加的水量以及锰与铁前驱体的比例。 图2 说明了团簇形貌如何依赖于水和前驱体浓度；同时还详细描述了获得所列样品的反应条件 表格 1我们发现，MFC 的直径受加水量的影响，而 MFC 的组成则取决于前驱体中铁和锰的比例。因此，这两个参数可独立调控，从而制备出具有不同尺寸和锰含量的 MFC 系列。

尽管这是一种非常简单的合成方法，但实验操作中的错误仍可能导致产物失败。图3展示了具有不规则微纤维簇...

讨论

本研究展示了一种改进的多元醇法合成四氧化锰铁纳米晶体，这些纳米晶体聚集形成尺寸均一的纳米级聚集体²⁹。在此合成过程中，三氯化铁和二氯化锰经历强制水解反应与还原反应，生成分子式为Mn_xFe_3-xO₄的铁氧体分子。这些铁氧体分子在反应器内的高温高压条件下形成初级纳米晶体，并最终组装成球形聚集体，本文将其称为磁铁矿铁氧体簇（MFCs）。若反应时间不足或水量不足，聚集过程无法充分完成，导致生成的颗粒不均一且形貌不良。相反，在足够的时间和充足的水条件下，金属氧化物的结晶与组装过程得以完全进行，形成由数十至数百个初级纳米晶体组成的均一球形聚集体。这些材料中的初级纳米晶体为硬聚集态，共享部分晶界界面，因而具有较高的初始磁化率，即使在手持永磁体产生的弱磁场下也能表现出显著的磁响应²⁷。因此，这类材料在药物递送、磁热疗、磁共振成像以及磁粒子成像等领域具有广阔的应用前景^30,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 微米真空过滤滤器	Thermo Fisher Scientific	NC9902431	用于在合成及表面包覆后过滤聚集的团簇，以获得均匀溶液
2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸（AMPS，99%）	Sigma-Aldrich	282731-250G	共聚物中用于纳米团簇表面包覆及在生物介质中功能化的试剂
2,2′-偶氮双(2-甲基丙腈)（AIBN）	Sigma-Aldrich	441090-100G	作为自由基引发剂用于共聚物制备
4-吗啉乙磺酸，2-(N-吗啉基)乙磺酸（MES）	Sigma-Aldrich	M3671-250G	酸性缓冲液，用于稳定纳米团簇表面包覆过程
丙烯酸	Sigma-Aldrich	147230-100G	共聚物中用于纳米团簇表面包覆及在生物介质中功能化的试剂；无水，含200 ppm MEHQ作为抑制剂，99%
分析天平	Avantor	VWR-205AC	用于称量合成和稀释过程中使用的固体化学试剂
数字超声波破碎仪及探头	Branson	B450	在表面包覆过程中对纳米团簇溶液进行超声处理，以打破聚集体
盐酸多巴胺	Sigma-Aldrich	H8502-25G	用于表面包覆中的配体交换反应
乙二醇（无水，99.8%）	Sigma-Aldrich	324558-2L	作为溶剂用于纳米团簇的水热合成
玻璃小瓶（20 mL）	Premium Vials	B1015	用于纳米团簇溶液在洗涤和表面包覆过程以及聚合物溶液中的容器
量筒烧杯（100 mL）	Corning	1000-100	用于水热合成过程中固体和液体试剂的混合（需在放入烘箱前转移至高压反应釜）
手持磁铁	MSC Industrial Supply, Inc.	92673904	1/2" 长 × 1/2" 宽 × 1/8" 高，5极，矩形钕磁铁，低强度磁铁，用于从溶液中沉淀纳米团簇（必要时可通过钢丝绒增强磁场强度）
盐酸（ACS级，37%）	Fisher Scientific	7647-01-0	用于去除残留的纳米团簇残渣并清洁高压反应釜以供下次使用
水热高压反应釜	Toption	TOPT-HP500	用于容纳最终试剂混合物，以承受水热合成过程中烘箱产生的高温和高压
三氯化铁六水合物（FeCl3·6H2O，ACS试剂，97%）	ACS	236489-500G	用于纳米团簇合成中作为铁(III)源，在最终纳米团簇产物中转化为铁(II)（需保持干燥并快速称量以避免水分污染）
实验室器皿清洗刷	Fisher Scientific	13-641-708	用于合成前清洗玻璃器皿
磁力搅拌器	Thermo Fisher Scientific	50093538	用于水热合成过程中固体和液体试剂的混合
四水合氯化锰（MnCl2·4H2O，99.0%，晶体，ACS）	Sigma-Aldrich	1375127-2G	用于纳米团簇合成中作为锰源
微量移液器（100–1000μL）	Thermo Fisher Scientific	FF-1000	用于转移水和氯化锰等液体试剂
N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）	Sigma-Aldrich	25952-53-8	用于表面包覆中辅助共聚物的配体交换（大量试剂应保存在冷冻柜中，稀释溶液保存在冰箱中）
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）	Sigma-Aldrich	227056-2L	作为溶剂用于共聚物制备
聚丙烯酸钠盐（PAA，分子量~6,000）	PolyScience Inc.	06567-250	用于水热合成中初步包覆纳米团簇（最终在表面包覆步骤中被取代）
聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯	Sigma-Aldrich	454990-250ML	共聚物中用于纳米团簇表面包覆及在生物介质中功能化的试剂；平均分子量480，含100 ppm BHT和100 ppm MEHQ作为抑制剂
试剂丙酮，4L，ACS级	Cole-Parmer	UX-78920-66	作为溶剂用于洗涤过程中沉淀纳米团簇
单通道移液器，可调范围1–10 mL	Eppendorf	3123000080	用于转移乙二醇及其他液体
钢丝绒	Lowe's	788470	用于增强小瓶中的磁场强度，以帮助在洗涤和表面包覆过程中沉淀纳米团簇
搅拌子	Thomas Scientific	8608S92	用于水热合成过程中固体和液体试剂的混合
台式夹具	Grainger	29YW53	用于高压反应釜的紧密密封，以承受水热合成过程中烘箱的高压
尿素（ACS试剂，99.0%）	Sigma-Aldrich	U5128-500G	用于水热合成中形成碱性溶液
真空过滤瓶盖	Thermo Fisher Scientific	596-3320	用于在合成及表面包覆后过滤聚集的团簇，以获得均匀溶液
真空控制器 V-850	Buchi	BU-V850	用于在合成及表面包覆后过滤聚集的团簇，以获得均匀溶液
真空烘箱	Fisher Scientific	13-262-51	用于产生水热合成中纳米团簇形成所需的高温和高压