实时细胞代谢通量检测利用pH和氧气传感器，测量氧消耗速率和细胞外酸化速率，分别对应线粒体和糖酵解途径的三磷酸腺苷（ATP）生成。本文详细阐述了一种用于理解成骨细胞能量状态以及细胞生物能量状态的表征与解读方法。
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本文内容
摘要
摘要
成骨细胞介导的骨形成是实现正常骨量积累和骨转换、维持骨骼稳态并最终预防骨折的关键过程。为了优化峰值骨量并应对多种肌肉骨骼疾病（如绝经后骨质疏松症、神经性厌食、1型和2型糖尿病），骨生物学领域已投入巨大努力，以全面表征成骨细胞在其分化全过程中的特性。鉴于成熟成骨细胞的主要功能是分泌基质蛋白和矿化囊泡，研究发现这些过程需要消耗大量的细胞能量，即三磷酸腺苷（ATP）。细胞总体能量状态通常被称为细胞生物能量学，其包含一系列代谢反应，通过感知底物的可利用性来生成ATP，以满足细胞需求。因此，本方法详细描述了分离原代小鼠骨髓基质细胞（BMSCs）并利用实时细胞代谢通量分析仪，在成骨细胞分化的不同阶段监测其生物能量状态的过程。重要的是，这些数据表明，代谢谱在成骨细胞分化过程中发生显著变化。因此，使用这种生理相关性细胞类型对于充分理解细胞的生物能量状态如何调控其整体功能至关重要。
引言
成骨细胞形成骨骼的过程伴随着破骨细胞对骨骼的协调性破坏或吸收。成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡，是一种偶联过程，描述了骨转换或骨重塑，这对维持骨骼稳态至关重要。成骨细胞功能障碍会导致骨形成受损，进而引发多种疾病，包括骨质疏松症1,2,3. 离体/体外 骨髓基质干细胞（BMSCs）向成骨细胞前体及成熟成骨细胞分化，随时间推移在培养容器中形成并沉积矿化的骨基质4,5,6成骨细胞介导的骨形成需要大量的细胞能量。研究表明，胶原蛋白的合成与分泌高度依赖于细胞内的ATP:ADP比率；此外，矿化囊泡的运输与分泌过程可能也需要额外的ATP。7,8,9,10,11许多研究人员已经证实，成骨细胞生成过程及成骨细胞功能需要充....
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方案
所有实验程序均依据范德堡大学医学中心机构动物护理和使用委员会的指南和批准进行。
1. 试剂的准备与检测设置
- 骨髓基质细胞的分离与培养（亦可参见前一篇文章）30).
- 配制完全α最低必需培养基（αMEM）细胞培养液，通过在含α改良的最低必需培养基中添加10% FBS（胎牛血清）、100 U/mL青霉素和 100 µg/mL 链霉素
- 通过修剪0.6 mL微量离心管的末端，使其细胞可通过，并将其插入含有细胞的1.5 mL微量离心管中，以制备骨髓收集管 100 µL 完全αMEM
- 使用 CO₂ 处死小鼠2 处理步骤如下：将动物放入 CO2 在密闭容器中持续5%异氟烷麻醉2-3分钟，或直至呼吸停止。小鼠意识丧失后，需等待至少1分钟，再将其从容器中取出并行颈椎脱位处死。
- 使用无菌镊子和剪刀，剪开已处死小鼠的下腹部以制造一个小切口。分离小鼠的长骨（股骨、胫骨和髂嵴）。
- 修整长骨以去除所有软组织。骨骼清理干净后，从远端和近端各截去约1-2 mm，以形成供骨髓冲洗通过的开口。
注意：此操作应谨慎进行，以避免丢失骨髓，同时使其充分冲出。 - 将骨骼放入含有 100 µL 加入1×无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）以分....
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结果
图6：用于了解对照组与处理组细胞生物能量特征及其相应标准误差的常规检测代表性图示。（A）细胞能量表型检测。该图展示了对照组与两个处理组（n = 3）的糖酵解（ECAR）与线粒体呼吸（OCR）的关系。寡霉素A和FCCP刺激剂的加入提高了基础活性，以空心符号表示；实心符号表示细胞对不同刺激剂的反应。（B）实时ATP生成速率检测。ATP生成速率检测表明，对照组和处理组（n = 2）均通过糖酵解产生比氧化磷酸化更多的ATP。（.......
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讨论
实时细胞代谢通量分析仪可用于研究不同条件下细胞的能量代谢。本方案详细阐述了骨髓间充质干细胞（BMSCs）的高效分离、在适宜细胞培养板中进行培养，以及向成熟成骨细胞分化的步骤，所获得的细胞可用于基于细胞外通量分析仪的多种检测。此外，还详细说明了实时细胞代谢通量检测的关键步骤，包括传感器微孔板的水化、加样孔的加载、检测操作、数据归一化及数据分析。该检测通过评估成骨细胞对不同线粒体和糖酵解抑制剂的反应，以解析细胞的生物能量学特征。本方案针对成骨细胞的细胞类型进行了专门优化，相较于仪器制造商的标准操作流程，提供了更可靠且精确的指导。本方案中的多个参数，包括细胞接种密度、化合物浓度、培养基中外源底物的添加以及缓冲能力等，均需根据特定的细胞类型及其背景进行优化。
细胞外通量分析仪可快速、可靠地检测细胞代谢功能 离体 培养的细胞。与其他生物学检测方法相比，该检测的总时长通常为60至120分钟。仪器通过维持预设的37 °C温度，保持细胞和生理条件的正常状态，从而在降低操作复杂性的同时实现高效且可重复的检测结果。通常在加入抑制剂之前，连续记录三到四次基础氧消耗率（OCR）和细胞外酸.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）资助项目 AR072123 和国家老龄化研究所（NIA）资助项目 AG069795（资助给 ERR）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶 EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| 2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙烯酸 | Sigma - Aldrich | PZ0160 | UK5099 |
| 抗霉素 A | Sigma - Aldrich | A8674 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4544-100G | |
| 双-2-(5-苯乙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-基)乙基硫醚 | Sigma - Aldrich | SML0601 | BPTES |
| 羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙 | Sigma - Aldrich | C2920 | FCCP |
| Cytation 5 成像读板仪 | BioTek | N/A | 微孔板成像仪 |
| 依托莫西钠盐水合物 | Sigma - Aldrich | E1905 | |
| Hoechst 33342 溶液 (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | |
| 胰岛素 | Sigma - Aldrich | I6634 | |
| 牛血清白蛋白-油酸复合物 | Sigma - Aldrich | O3008 | |
| 寡霉素 A - 5 mg | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| 鱼藤酮 | Sigma - Aldrich | R8875-1G | |
| Seahorse XF 1.0 M 葡萄糖溶液 | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM 丙酮酸溶液 | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM 谷氨酰胺溶液 | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM 培养基 | Agilent Technologies | 103575-100 | 含 5 mM HEPES (pH 7.4) 的 DMEM 检测培养基，不含酚红、碳酸氢钠、葡萄糖、丙酮酸和 L-谷氨酰胺 |
| Seahorse XFe96 分析仪 | Agilent Technologies | S7800B | 实时代谢通量分析仪 |
| Seahorse XFe96 FluxPak 试剂盒 | Agilent Technologies | 102416-100 | 包含 XFe96 传感器微孔板、细胞培养微孔板和 Seahorse XF 校准液 |
| The Cell imaging 1.1.0.11 软件 | Agilent Technologies - BioTek | ||
| Wave 软件 2.6.1 | Agilent Technologies | ||
| β-甘油磷酸钠 | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
参考文献
- Rodan, G. A. Bone homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).
- Nakahama, K. I. Cellular communications in bone homeostasis and repair. Cellular and Molecular Life Science....
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重印与许可
