本方案旨在利用 NuTRAP 小鼠模型分离特定细胞类型的翻译核糖体 mRNA。
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本文内容
摘要
摘要
细胞异质性为在转录组水平上理解复杂组织的功能带来了挑战。利用细胞类型特异性的RNA可避免由组织异质性引起的各种潜在问题，并充分发挥转录组分析的强大能力。本文所述方案展示了如何在无需细胞分选的情况下，使用翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法从复杂组织中少量表达EGFP的细胞中分离核糖体结合的RNA。该方案适用于利用近期可获得的NuTRAP小鼠模型来分离特定细胞类型的RNA，也可用于分离任何表达EGFP的细胞中的RNA。
引言
高通量方法（包括RNA测序（RNA-seq）和微阵列技术）使得在全基因组水平上研究基因表达谱成为可能。对于心脏、脑和睾丸等复杂组织而言，细胞类型特异性的数据相比使用整个组织的RNA能够提供更详细的分析结果1,2,3。为了克服细胞异质性的影响，自2010年代初期以来，研究人员开发了翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification, TRAP）技术4。TRAP能够在不进行组织解离的情况下，从特定细胞类型中分离出与核糖体结合的RNA。该方法已被用于多种生物中的转译组（即正在被招募至核糖体进行翻译的mRNA）分析，包括在果蝇胚胎中靶向极为稀有的肌细胞群体5，研究模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中不同类型的根细胞6，以及对哺乳动物内皮细胞进行转录组分析7。
TRAP 技术需要对模式生物的核糖体进行基因改造标记。Evan Rosen 及其同事近期开发了一种名为核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP....
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方案
所有动物实验均遵循奥本大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
注意：以下实验方案使用 P28 期 Gli1-CreERT2; NuTRAP 小鼠（Mus musculus）的一个睾丸（约 100 mg）。根据样本类型和组织数量，试剂的体积可能需要相应调整。
1. 组织采集
- 使用 CO2 麻醉箱处死小鼠，用 70% 乙醇对腹部表面进行消毒。
- 用剪刀打开下腹部并取出睾丸。 立即使用液氮 (LN2) 对睾丸进行速冻。
- 将样品储存于 LN2 的气相中，直至使用。
2. 试剂与磁珠的制备
- 配制匀浆储存液：加入 50 mM Tris（pH 7.4）、12 mM MgCl2、100 mM KCl、1% NP-40 和 1 mg/mL 肝素。将溶液储存于 4 °C，直至使用（最多可保存 1 个月）。
- 使用前新鲜配制匀浆工作缓冲液（步骤 2.1）：向匀浆储存液中加入 DTT（终浓度：1 mM）、环己酰亚胺（终浓度：....
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结果
Gli1-CreERT2 小鼠（杰克逊实验室品系编号：007913）首先与 NuTRAP 报告基因小鼠（Jackson实验室货号：029899）以生成双突变小鼠。携带两种基因工程等位基因的小鼠（即 Gli1-CreER）T2 和 NuTRAP) 每隔一天注射一次他莫昔芬，共注射三次。组织样本于第7天采集th 1 天后st 注射当天。免疫荧光分析显示，EGFP在睾丸的间质细胞中表达（图1）。已知肾上腺被膜是另一种表达阳性细胞群体 Gli112,13在肾上腺被膜细胞中也检测到 EGFP Gli1-CreERT2;NuTRAP 小鼠（图1）。我们实验室也进行 Shh-CreERT2;.......
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讨论
全组织转录组分析的应用价值可能会受到限制，尤其是在研究结构复杂的异质性组织时。如何获取特定细胞类型的RNA，已成为充分发挥RNA-seq技术强大功能的迫切需求。分离特定细胞类型的RNA通常依赖于通过显微操作、荧光激活细胞分选（FACS）或激光捕获显微切割（LCM）来收集特定类型的细胞18。此外，其他现代高通量单细胞采集方法和仪器也已相继开发出来19。这些方法通常采用微流控技术对单个细胞进行条形码标记，随后进行单细胞RNA测序。细胞解离是获得悬浮细胞溶液的必要步骤，之后细胞悬液将通过细胞分选仪或微流控装置对每个细胞进行条形码标记。然而，在针对特定细胞类型的研究中，细胞解离步骤给这些方法带来了挑战，因为酶处理不仅会破坏组织结构，还会影响细胞活力和转录谱型20。此外，单细胞RNA-seq的成本通常较高，且需要现场配备专用设备。
最近，两项研究利用 NuTRAP 小鼠成功地从完整组织中分离出特定细胞类型的 RNA/DNA
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）R00HD082686项目资助。我们感谢内分泌学会暑期研究奖学金对H.S.Z.的支持。同时感谢袁康博士在小鼠品系繁育与种群维护方面的工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Actb | 欧陆检测 | qPCR 引物 | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT（正向引物/反向引物） |
| Bioanalyzer | 安捷伦 | 2100 Bioanalyzer 仪器 | |
| cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 | 默克密理博 | 11836170001 | |
| 放线菌酮 | 默克密理博 | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | 欧陆检测 | qPCR 引物 | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT（正向引物/反向引物） |
| dNTP | 赛默飞世尔科技 | R0191 | |
| DTT，二硫苏糖醇 | 赛默飞世尔科技 | P2325 | |
| DynaMag-2 磁力架 | 赛默飞世尔科技 | 12321D | |
| 15 mL Falcon 管 | VWR | 89039-666 | |
| GFP 抗体 | Abcam | ab290 | |
| 玻璃研磨器套装 | DWK Life Sciences | 357542 | |
| 肝素 | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | 欧陆检测 | qPCR 引物 | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC（正向引物/反向引物） |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| 2 mL 微量离心管 | 赛默飞世尔科技 | 02-707-354 | |
| 小鼠 Clariom S 检测微阵列 | 赛默飞世尔科技 | 微阵列服务 | |
| NP-40 | 默克密理博 | 492018-50 mL | |
| oligo (dT)20 | 英潍捷基 | 18418020 | |
| PicoPure RNA 提取试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead 磁珠 | 赛默飞世尔科技 | 10003D | |
| 无 RNase 水 | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | 10777019 | |
| Sox9 | 欧陆检测 | qPCR 引物 | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT（正向引物/反向引物） |
| Superscript IV 逆转录酶 | 英潍捷基 | 18090050 | |
| SYBR Green PCR 主混合液 | 赛默飞世尔科技 | 4309155 | |
| Sycp3 | 欧陆检测 | qPCR 引物 | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA / GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA（正向引物/反向引物） |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
参考文献
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al.
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