无需细胞分选从速冻异质组织样本中分离细胞类型特异性RNA

摘要

本方案旨在利用 NuTRAP 小鼠模型分离特定细胞类型的翻译核糖体 mRNA。

摘要

细胞异质性为在转录组水平上理解复杂组织的功能带来了挑战。利用细胞类型特异性的RNA可避免由组织异质性引起的各种潜在问题，并充分发挥转录组分析的强大能力。本文所述方案展示了如何在无需细胞分选的情况下，使用翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法从复杂组织中少量表达EGFP的细胞中分离核糖体结合的RNA。该方案适用于利用近期可获得的NuTRAP小鼠模型来分离特定细胞类型的RNA，也可用于分离任何表达EGFP的细胞中的RNA。

引言

高通量方法（包括RNA测序（RNA-seq）和微阵列技术）使得在全基因组水平上研究基因表达谱成为可能。对于心脏、脑和睾丸等复杂组织而言，细胞类型特异性的数据相比使用整个组织的RNA能够提供更详细的分析结果^1,2,3。为了克服细胞异质性的影响，自2010年代初期以来，研究人员开发了翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification, TRAP）技术⁴。TRAP能够在不进行组织解离的情况下，从特定细胞类型中分离出与核糖体结合的RNA。该方法已被用于多种生物中的转译组（即正在被招募至核糖体进行翻译的mRNA）分析，包括在果蝇胚胎中靶向极为稀有的肌细胞群体⁵，研究模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中不同类型的根细胞⁶，以及对哺乳动物内皮细胞进行转录组分析⁷。

TRAP 技术需要对模式生物的核糖体进行基因改造标记。Evan Rosen 及其同事近期开发了一种名为核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）的小鼠模型⁸，该模型自 2017 年起可通过杰克逊实验室获取。通过与表达 Cre 的小鼠品系杂交，研究人员可利用该 NuTRAP 小鼠模型直接从表达 Cre 的细胞中分离出与核糖体结合的 RNA 和细胞核，而无需进行细胞分选。在同时携带 NuTRAP 等位基因且表达 Cre 的细胞中，EGFP/L10a 标记的核糖体可通过亲和捕获实验分离正在翻译的 mRNA。在同一细胞中，被生物素连接酶识别肽（BLRP）标记且呈 mCherry 阳性的核膜，可通过亲和或基于荧光的方法实现细胞核的分离。同一研究团队还构建了另一种类似的小鼠品系，其核膜仅用 mCherry 标记而不含生物素标签⁸。这两种基因修饰小鼠品系使得研究人员能够同步分析特定类型细胞的表观基因组与转录组特征。

Hedgehog（Hh）信号通路在组织发育中发挥关键作用⁹。GLI1 是 GLI 家族的成员，作为转录激活因子介导 Hh 信号通路。Gli1⁺ 细胞存在于多种分泌激素的器官中，包括肾上腺和睾丸。为了利用 NuTRAP 小鼠模型从 Gli1⁺ 细胞中分离细胞类型特异性的 DNA 和 RNA，将 Gli1-CreER^T2 小鼠与 NuTRAP 小鼠杂交。同时，将 Shh-CreER^T2 小鼠也与 NuTRAP 小鼠杂交，以分离表达 sonic hedgehog（Shh）的细胞。以下方案展示了如何使用 Gli1-CreER^T2;NuTRAP 小鼠从成年小鼠睾丸中的 Gli1⁺ 细胞中分离核糖体结合的 RNA。

方案

所有动物实验均遵循奥本大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

注意：以下实验方案使用 P28 期 Gli1-CreER^T2; NuTRAP 小鼠（Mus musculus）的一个睾丸（约 100 mg）。根据样本类型和组织数量，试剂的体积可能需要相应调整。

1. 组织采集

1. 使用 CO₂ 麻醉箱处死小鼠，用 70% 乙醇对腹部表面进行消毒。
2. 用剪刀打开下腹部并取出睾丸。 立即使用液氮 (LN₂) 对睾丸进行速冻。
3. 将样品储存于 LN₂ 的气相中，直至使用。

2. 试剂与磁珠的制备

1. 配制匀浆储存液：加入 50 mM Tris（pH 7.4）、12 mM MgCl₂、100 mM KCl、1% NP-40 和 1 mg/mL 肝素。将溶液储存于 4 °C，直至使用（最多可保存 1 个月）。
2. 使用前新鲜配制匀浆工作缓冲液（步骤 2.1）：向匀浆储存液中加入 DTT（终浓度：1 mM）、环己酰亚胺（终浓度：100 µg/mL）、重组核糖核酸酶（终浓度：200 单位/mL）和蛋白酶抑制剂混合物（终浓度：1×），配制成所需体积的匀浆工作缓冲液。 freshly prepared working buffer on ice until use.
3. 配制低盐洗涤缓冲液和高盐洗涤缓冲液：
   1. 配制低盐洗涤缓冲液：混合 50 mM Tris（pH 7.4）、12 mM MgCl₂、100 mM KCl 和 1% NP-40。使用前加入 DTT（终浓度：1 mM）和环己酰亚胺（终浓度：100 µg/mL）。
   2. 配制高盐洗涤缓冲液：混合 50 mM Tris（pH 7.4）、12 mM MgCl₂、300 mM KCl 和 1% NP-40。使用前加入 DTT（终浓度：2 mM）和环己酰亚胺（终浓度：100 µg/mL）。
4. 准备蛋白 G 磁珠（材料表）：
   1. 每个样品需要 50 µL 蛋白 G 磁珠。将所需体积的磁珠转移至 1.5 mL 离心管中，将离心管置于磁力架上静置 30–60 秒，使磁珠与溶液分离。
   2. 用移液器吸除上清液。每次用 1 mL 冰冷的低盐洗涤缓冲液洗涤磁珠，共洗涤三次。

3. 组织裂解与匀浆化

1. 向玻璃组织研磨器中加入 2 mL 冰冷的匀浆工作缓冲液（按步骤 2.2 新鲜配制）。迅速将冷冻样品放入研磨器中，使用松动的研杵在冰上研磨 30 次以匀浆组织。
2. 将匀浆液转移至一个 2 mL 圆底离心管中，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
3. 将上清液转移至一个新的 2 mL 离心管中。取 100 µL 上清液保存至一个 1.5 mL 离心管中作为 "输入"样品。
4. 在 2 mL 离心管中，将上清液与抗 GFP 抗体（5 µg/mL；1:400）在 4 °C 条件下于翻转旋转仪（24 rpm）上孵育过夜。

4. 免疫沉淀

1. 将匀浆/抗体混合物转移至一个新的2 mL圆底离心管中，该离心管内含有步骤2.4中已洗涤的蛋白G磁珠。在4 °C下，使用翻转混合仪（24 rpm）孵育2小时。
2. 使用磁力架将磁珠与上清液分离。将上清液保留作为"阴性组分"。阴性组分包含：(1) EGFP阴性细胞中的RNA，以及(2) EGFP阳性细胞中未与核糖体结合的RNA。
3. 向磁珠中加入1 mL高盐洗涤缓冲液，短暂涡旋振荡离心管以洗涤磁珠。将离心管置于磁力架上。
4. 移除洗涤缓冲液。重复洗涤步骤两次。此时磁珠上含有来自EGFP阳性细胞的磁珠-核糖体-RNA复合物。

5. RNA 提取

注意：以下步骤改编自RNA提取试剂盒（材料表）。将每个组分（即上样组、阳性组和阴性组）视为独立样本，并分别独立提取RNA。

1. 将4.4步骤中的磁珠与50 µL洗脱缓冲液（来自RNA提取试剂盒）在恒温混匀仪中孵育（42 °C，500 rpm）30分钟，以释放磁珠上的RNA。
2. 使用磁力架分离珠子，将含有珠子-核糖体-RNA复合物的上清液转移至1.5 mL离心管中。
3. 将试管在3000 x g条件下离心 g 2分钟，然后用移液器将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。此管含有 "阳性组分" TRAP 步骤的
   注意：对于输入样品和阴性组分，使用1 mL裂解缓冲液从25 µL样品中提取RNA。在恒温混匀仪中孵育（42 °C，500 rpm）30分钟。
4. 预处理RNA纯化柱：用移液器将250 µL平衡缓冲液加入纯化柱中，在室温（RT）孵育5分钟。将纯化柱在16,000 x g下离心 g 1 分钟。
5. 移液 等体积的70% EtOH加入到 步骤5.3的上清液（阳性组分约50 µL 70% EtOH，输入组分和阴性组分各1 mL 70% EtOH）。用移液器反复吹打充分混匀。
6. 将步骤5.4中的混合物用移液器转移至柱中。
7. 以 100 x g 离心柱子 g 2 分钟，使 RNA 结合并吸附于柱中膜上，随后继续在 16,000 x g 立即弃去流出液。
   注意：对于输入样品和阴性组分，每次向柱中加入 250 µL 混合物。重复步骤 5.6 和 5.7，直至用完所有混合物。
8. 用移液器将100 µL洗脱缓冲液1（W1）加入柱中，于8,000 x g离心 g 1 分钟。弃去滤液。
9. 将75 µL DNase溶液混合物直接移液至纯化柱膜中，在室温下孵育15分钟。
10. 将40 µL W1加入柱中，8,000 x g离心 g 30秒后弃去滤液。
11. 将100 µL洗脱缓冲液2（W2）移液至柱中，于8,000 x g离心 g 1 分钟。弃去滤液。
12. 用移液器将100 µL W2加入柱中，于16,000 x g离心 g 2 分钟。弃去流出液。将同一层析柱在 16,000 x g 1分钟，以在洗脱步骤前彻底去除洗涤缓冲液残留。
13. 将柱子转移至一个新的1.5 mL微量离心管中。
14. 将 12 µL 无 RNase 水直接移取至纯化柱膜上。移液枪头不应接触膜。室温孵育 1 分钟，然后以 1000 x g 离心 g 1分钟。然后以16,000 x g 孵育1分钟以洗脱RNA。

6. RNA 浓度与质量

1. 使用生物分析仪评估提取的RNA的质量和数量¹⁰。

7. 储存与进一步分析

1. 将RNA储存于-80 °C（最长可达1年），直至进行后续分析（例如微阵列、定量PCR（qPCR）和RNA测序等）。
   注意：有关qPCR分析的详细信息，包括cDNA合成，请参见Lyu等人的研究¹¹。qPCR所用引物列于材料表中。

结果

Gli1-CreER^T2 小鼠（杰克逊实验室品系编号：007913）首先与 NuTRAP 报告基因小鼠（Jackson实验室编号：029899）以生成双突变小鼠。携带两种基因工程等位基因（即 Gli1-CreER）的小鼠^T2 和 NuTRAP) 每隔一天注射一次他莫昔芬，共注射三次。组织样本于第7天采集^th 1天后^st 注射当天。免疫荧光分析显示，EGFP 在睾丸的间质细胞中表达（图1）。肾上腺囊膜已被证实是另一种表达阳性细胞群体 Gli1^12,13. 在肾上腺被膜细胞中也检测到 EGFP Gli1-CreER^T2;NuTRAP 小鼠（图1）。我们实验室也进行 Shh-CreER^T2

讨论

全组织转录组分析的应用价值可能会受到限制，尤其是在研究结构复杂的异质性组织时。如何获取特定细胞类型的RNA，已成为充分发挥RNA-seq技术强大功能的迫切需求。分离特定细胞类型的RNA通常依赖于通过显微操作、荧光激活细胞分选（FACS）或激光捕获显微切割（LCM）来收集特定类型的细胞¹⁸。此外，其他现代高通量单细胞采集方法和仪器也已相继开发出来¹⁹。这些方法通常采用微流控技术对单个细胞进行条形码标记，随后进行单细胞RNA测序。细胞解离是获得悬浮细胞溶液的必要步骤，之后细胞悬液将通过细胞分选仪或微流控装置对每个细胞进行条形码标记。然而，在针对特定细胞类型的研究中，细胞解离步骤给这些方法带来了挑战，因为酶处理不仅会破坏组织结构，还会影响细胞活力和转录谱型²⁰。此外，单细胞RNA-seq的成本通常较高，且需要现场配备专用设备。

最近，两项研究利用 NuTRAP 小鼠成功地从完整组织中分离出特定细胞类型的 RNA/DNA

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Actb	欧陆检测	qPCR 引物	ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT（正向引物/反向引物）
Bioanalyzer	安捷伦	2100 Bioanalyzer 仪器
cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	默克密理博	11836170001
放线菌酮	默克密理博	239764-100MG
Cyp11a1	欧陆检测	qPCR 引物	CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT（正向引物/反向引物）
dNTP	赛默飞世尔科技	R0191
DTT，二硫苏糖醇	赛默飞世尔科技	P2325
DynaMag-2 磁力架	赛默飞世尔科技	12321D
15 mL Falcon 管	VWR	89039-666
GFP 抗体	Abcam	ab290
玻璃研磨器套装	DWK Life Sciences	357542
肝素	BEANTOWN CHEMICAL	139975-250MG
Hsd3b	欧陆检测	qPCR 引物	GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC（正向引物/反向引物）
KCl	Biosciences	R005
MgCl2	Biosciences	R004
2 mL 微量离心管	赛默飞世尔科技	02-707-354
小鼠 Clariom S 检测微阵列	赛默飞世尔科技		微阵列服务
NP-40	默克密理博	492018-50 mL
oligo (dT)20	英潍捷基	18418020
PicoPure RNA 提取试剂盒	赛默飞世尔科技	KIT0204
Protein G Dynabead 磁珠	赛默飞世尔科技	10003D
无 RNase 水	growcells	NUPW-0500
RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂	赛默飞世尔科技	10777019
Sox9	欧陆检测	qPCR 引物	TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT（正向引物/反向引物）
Superscript IV 逆转录酶	英潍捷基	18090050
SYBR Green PCR 主混合液	赛默飞世尔科技	4309155
Sycp3	欧陆检测	qPCR 引物	GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA / GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA（正向引物/反向引物）
Tris	Alfa Aesar	J62848