利用圆二色光谱研究DNA-蛋白质相互作用

摘要

利用圆二色光谱法描述了ATP依赖性染色质重塑因子与DNA配体之间的相互作用。通过产生的峰分析基因启动子上发生的诱导构象变化，可用于理解转录调控的机制。

摘要

圆二色光谱（CD光谱）是一种简单且便捷的方法，可用于研究生物大分子的二级结构及其相互作用。近年来，CD光谱技术的进步使得研究人员能够详细探究DNA-蛋白质相互作用以及DNA在不同微环境中的构象动态，从而更深入地理解体内转录调控机制。in vivo 转录发生前，潜在的转录区域周围必须发生解旋。这一过程十分复杂，需要组蛋白修饰、转录因子与DNA的结合以及其他染色质重塑活动的协同作用。利用CD光谱技术，可以研究由调控蛋白（如ATP依赖性染色质重塑因子）引起的启动子区域构象变化，进而促进转录过程。同时，也可监测蛋白质自身发生的构象变化。此外，通过在目标DNA序列中引入突变，还可探讨蛋白质对其靶标DNA的亲和力及序列特异性等问题。总之，这种灵敏且经济的方法所提供的独特见解，有助于预测染色质动态的变化，从而提升对转录调控机制的理解。

引言

圆二色性（CD）是一种光谱技术，依赖于生物大分子固有的手性，这种手性导致对右旋和左旋圆偏振光的吸收存在差异。这种吸收差异被称为圆二色性。因此，该技术可用于解析生物大分子（如蛋白质和DNA）的构象，这两种分子均含有手性中心^1,2。

电磁波包含电场和磁场两个组分。电场和磁场均在垂直于波传播方向的平面内振荡。对于非偏振光，这些场在多个方向上振荡。当光为圆偏振光时，两个电磁场之间存在90°的相位差。手性分子表现出圆二色性（双折射），会不同程度地吸收右旋圆偏振光和左旋圆偏振光³。由此产生的电场轨迹呈椭圆形，且依赖于波长。因此，圆二色光谱以椭圆率（q）记录，数据以平均残基椭圆率对波长作图的形式呈现。

对于蛋白质而言，除甘氨酸外，氨基酸的Cα原子具有手性，这一特性被圆二色光谱（CD）用于测定该大分子的二级结构⁴。蛋白质分子的CD光谱通常在远紫外区记录。α-螺旋结构的蛋白质在222 nm和208 nm处有两个负峰，在193 nm处有一个正峰⁴。具有反平行β-折叠二级结构的蛋白质在218 nm处呈现一个负峰，在195 nm处有一个正峰⁴

方案

1. 反应组分的工作浓度

1. 新鲜配制圆二色谱（CD）及其他反应组分所需的缓冲液工作浓度（参见表1），并在进行反应前将其保存于4 °C。
   注意：本文所述CD反应中各组分的工作浓度如下：磷酸钠缓冲液（pH 7.0）1 mM、ATP 2 mM、DNA 500 nM、蛋白质 1 µM、MgCl₂ 10 mM、EDTA 50 mM、ADAADiN 5 µM。

2. ATP酶活性

1. 在进行圆二色光谱分析之前，需先检测蛋白质在不同DNA分子存在下的ATP酶活性，以确保用于圆二色光谱分析的蛋白质具有活性，并确定最能有效促进ATP水解的DNA分子。
2. 通过NADH偶联氧化法测定蛋白质在不同DNA分子存在下的ATP酶活性，该方法包含以下两个反应。
   1. 在96孔板中混合0.1 µM ADAAD、2 mM ATP、10 nM DNA和1x REG缓冲液，最终体积为250 µL。
      注：丙酮酸激酶利用ADP和Pi将磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸，从而再生ATP。这可确保反应体系中ATP始终处于饱和浓度。在第二个反应中，丙酮酸激酶作用生成的丙酮酸被乳酸脱氢酶转化为乳酸。在此过程中，一个NADH分子被氧化为NAD⁺。通过测定340 nm处的吸光度来检....

结果

ADAAD 能够稳定 MYC 启动子上的茎环样结构
先前的实验证据表明，SMARCAL1 是 MYC²⁹ 的负调控因子。通过 QGRS mapper 对 MYC 基因的 159 bp 长启动子区域进行分析显示，正链具有形成 G-四链体的潜力（表 2）。Mfold 分析表明，MYC DNA 的两条链均可形成类似茎环的结构（表 2）。合成了一个长 34 bp、包含 G-四链体（G_EC_E）的 DNA 序列。G_EC_E 寡核苷酸正链和反向序列的 Mfold 结构如 图 1A、B 所示。

使用6X His-ADAAD进行的.......

讨论

本文旨在介绍圆二色光谱技术作为一种研究方法，用于分析在依赖ATP的染色质重塑蛋白存在下DNA发生的构象变化，并将这些构象变化与基因表达关联起来。圆二色光谱技术为研究DNA的构象变化提供了一种快速且易于实施的方法。

该技术需要考虑的一个关键点是DNA和蛋白质的纯度。建议确保DNA和蛋白质的纯度均高于>95%。实验中必须使用经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的寡核苷酸，而蛋白质则最好通过亲和层析纯化至>95%的纯度。另一个关键参数是比色皿必须清洁，使得基线读数不超过1 mdeg。缓冲液应使用高压灭菌水配制，且缓冲液本身的基线读数也不应超过1 mdeg。为了研究启动子的构象，必须确定蛋白质结合的区域。因此，建议使用目标蛋白质进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，因为该过程有助于鉴定效应基因启动子区域中被该蛋白质结合的DNA序列。一旦确定了结合区域，即可利用现有的生物信息学工具分析该序列形成特定结构的能力。这一点非常重要，因为ChIP引物通常长达200 bp，可能具有多种构象。因此，使用生物信息学工具识别结构有助于将寡核苷酸的长度缩短至仅包含一种结构的片段。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Fisher scientific	O3446I-100
腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物	Sigmaaldrich	A2383
CD 石英比色皿	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 圆二色光谱仪	Applied Photophysics	不可用
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	SRL	43272
谷胱甘肽 Sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	谷胱甘肽亲和层析
Hellmanex III 清洗液	Hellma	9-307-011-4-507
L-乳酸脱氢酶	Sigmaaldrich	L2625
乙酸镁四水合物	Fisher scientific	BP215-500
氯化镁六水合物	Fisher scientific	M33-500
NADH 二钠盐	Sigmaaldrich	10107735001
磷酸烯醇式丙酮酸单环己胺盐	SRL	40083
乙酸钾	Fisher scientific	P178-3
丙酮酸激酶	Sigmaaldrich	P1506
磷酸氢二钠无水物	Fisher scientific	S374-500
磷酸二氢钠一水合物	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT 微孔板读板仪	BioTek	不可用
Tris 碱	Fisher scientific	BP152-500