在本实验方案中，我们描述了如何在E7.5时期向小鼠羊膜腔注射慢病毒，从而实现整个神经板的均匀转导，同时对胚胎存活率或发育过程造成极小的不利影响。
本文内容
摘要
摘要
操控发育中小鼠大脑中的基因表达 在子宫内 在功能遗传学研究中具有巨大潜力。然而，该技术此前主要局限于神经管形成后的胚胎阶段操作。本研究建立了一种在胚胎第7.5天（E7.5）向羊膜腔注射慢病毒的实验方案，所用慢病毒编码靶向特定基因的cDNA或shRNA >95%的神经板和神经嵴细胞，这些细胞将参与形成未来的脑、脊髓以及周围神经系统。本方案描述了实现成功转导所需的各个步骤，包括玻璃毛细注射针的打磨、妊娠确认、利用超声成像进行胚胎发育分期，以及根据胚胎发育阶段确定最佳注射体积。
采用本方案，可通过高滴度慢病毒实现对发育中脑组织超过>95%的转导，从而进行全脑范围的遗传操作。相比之下，使用较低病毒滴度则可实现嵌合式转导，适用于遗传筛选或谱系示踪研究。在胚胎7.5天（E7.5）注射还可靶向参与眼球、舌部及周围神经系统不同结构形成的外胚层和神经嵴细胞。因此，该技术能够在小鼠神经板及外胚层来源组织的神经发生前期阶段操控基因表达，同时有助于减少实验所需小鼠数量。
引言
大脑和脊髓是胚胎发生过程中最早开始形成的器官之一1,2。尽管与神经发育障碍相关的基因正在被陆续鉴定，但对这些遗传变异的功能研究仍相对滞后3,4。由于构建条件性基因敲除小鼠模型通常需要数月甚至数年时间，因此人们迫切需要一种能够快速研究发育中大脑基因功能的替代技术。在小鼠胚胎中，神经管形成（neurulation）——即神经板转变为神经管并最终发育为中枢神经系统（CNS）的形态发生过程——发生在受孕后第8至10天5。在神经管形成开始之前，作为外胚层一部分的神经板由单层柱状细胞构成，这些细胞将增殖并分化为中枢神经系统中的多种神经元和胶质细胞类型6,7。因此，若要在实验上对中枢神经系统中的基因表达进行持久性调控，靶向神经板具有明显优势，其中包括所有前体细胞均易于被操作的特点。
在神经科学领域，鸡胚的 in ovo 电穿孔8,9 以及小鼠胚胎的病毒转导已被用于调控胚胎中枢神经系统（CNS）的基因表达。由于鸡胚在蛋内易于接触，且基因表达操作简便，发育中的鸡胚已成为研究脊髓发育过程中基因功能的首选模型。特别是 in ovo 质粒电穿孔技术，可在每只鸡胚的脊髓中同时建立实验组和对照组条件。电穿孔通过在胚胎两侧施加电脉冲，利用两个电极使细胞膜通透性增加，并将带负电荷的 DNA 从阴极（负极）推向阳极（正极）。在小鼠中，in utero 电穿孔通常仅限于神经管形成已完成的胚胎阶段，此时脑或脊髓已形成多层细胞结构，导致电穿孔效率较低10。质粒电穿孔仅产生短暂的基因表达，且通常只能靶向少数细胞。
超声引导下 在子宫内 显微注射已被用于操控多种胚胎结构，例如皮肤和脑11,12,13,14然而，针对发育中鼠类中枢神经系统的注射方法显示出较低的有效性，或对胚胎存活产生负面影响12,13,14因此，开发了一种改进的方案，用于在E7.5时将高滴度慢病毒递送至羊膜腔（AC），该方案被命名为NEPTUNE。 ne乌拉尔 p晚期 t靶向 在子宫内 n肛门注射e作用15注射实现了持久的靶向效果 >在E13.5时期，覆盖了整个大脑的95%。此外，在超声验证妊娠阶段引入了一个分期步骤，以根据发育阶段对雌性动物和妊娠情况进行分类，从而减少对实验动物的不必要操作，并提高注射成功率。注射效率和胚胎存活率与羊膜腔（AC）尺寸的增加密切相关。因此，本文描述了在注射前如何测量羊膜腔尺寸，以确定注入羊膜腔的适宜体积，避免导致胚胎吸收。NEPTUNE是一种对现有方法的可靠替代方案 在子宫内 方法可适用于多种用途，包括但不限于基因功能获得与缺失研究、谱系示踪或筛选实验15,16.
方案
根据欧洲法规饲养CD1野生型小鼠，采用标准的昼夜循环，并可自由获取食物和水。ad libitum。CD1雌鼠与CD1雄鼠过夜交配，次日早晨检查阴道栓（E0.3）。仅使用妊娠雌鼠进行注射。本研究中所有实验均获得瑞典农业委员会（Jordbruksverket）的伦理批准。
1. 玻璃针的制备：拉针与磨针
注意：尽管可以购买预磨制的针头，但在实验室自行拉制针头可方便地调整针头长度、内径和斜面角度。
- 将玻璃毛细管安装到微电极/毛细管拉制仪中。使用指定设备（参见材料表）设置以下参数：加热 580 单位；拉速 140 单位；时间 200 单位；压力 500–800 单位。
注意：不同参数的单位由毛细管拉制仪定义，不同设备的单位可能有所差异。 - 按下拉制按钮，将毛细管拉断，形成两根末端呈锥形的玻璃毛细管。
注意：拉制完成后，由于微电极拉制仪的高温作用，两根玻璃毛细管的尖端会熔融闭合。 - 使用手术剪剪切尖端，获得长度约为 7 mm 的针头（从针头开始变细的位置起测量）（图 1A）。
注意：对于 E7.5 期的注射，长而细的针头至关重要，因为注射区域非常小且脆弱。短而粗的针头会导致胚胎死亡。 - 研磨剪切后的针头尖端，形成锋利的斜面（图 1C-F）。
- 以 20° 角度在最大转速下研磨至少 30–45 分钟。
注意：向研磨板上添加超纯水，以起到润滑、降低摩擦/温度以及冲走玻璃颗粒的作用（图 1B）。然而，过多液体可能减缓研磨速度。 - 确保针头尖端（图 1C）接触研磨板表面（图 1D），但不发生弯曲（图 1E）。
注意：若发生弯曲研磨，将导致针尖过长且脆弱，斜面角度不正确，在注射过程中容易断裂。断裂的针头可能损伤胚胎，必须更换为完好的针头。正确研磨的针尖如 图 1F、G 所示。研磨完成后，针头内径（ID）约为 15 µm，外径（OD）约为 35 µm（图 1G）。
- 以 20° 角度在最大转速下研磨至少 30–45 分钟。
- 用 1 mL 注射器吸取矿物油，并连接一根 27 G 针头。
- 取下针头帽，将注射器针头插入新研磨的玻璃毛细管中。注入矿物油，直至油从毛细管尖端滴出。在缓慢抽出 27 G 针头的同时持续注入矿物油，直至玻璃毛细管针头完全充满矿物油，然后可将注射器针头拔出。
- 将研磨完成并充满矿物油的针头存放于密闭环境中，以防损坏和积尘。存放时，将两团塑型粘土插入普通培养皿中作为支架（图 1H），将针头轻轻架在粘土上，并保持足够间距以便于取用。
注意：由于针头制备耗时，建议至少在注射前一日完成制备。针头最多使用两窝后应予以丢弃，因其会变钝。务必额外准备备用针头，以应对制备或注射过程中针头损坏的情况。
图 1：E7.5 胚胎羊膜腔注射用针头的制备。（A）拉制后但未切割的玻璃毛细针（左）、切割至适合 E7.5 注射长度的毛细针（中）以及切割过短的毛细针（右）的代表性示例。（B）均匀覆盖水的研磨装置，已准备用于针头研磨。（C–F）不同针尖形态的代表性示例。（C）已安装在研磨装置中但尚未研磨的切割针尖；（D）理想研磨位置，针尖刚好接触研磨面；（E）针尖下压过深并在研磨过程中发生弯曲；（F）适用于 E7.5 羊膜腔注射的理想研磨针尖。（G）研磨后的针尖，显示内径约为 15 µm、外径约为 35 µm，适用于 E7.5 羊膜腔注射。针孔以虚线表示。外径由红色箭头标示；内径由蓝色箭头标示。（H）针头储存：培养皿中装有已拉制并研磨好的针头，两排橡皮泥用作固定支架。注：图 C、F、G 中的目镜测微尺，1 cm 分为 100 格；物镜放大倍数为 3 倍；因此，1 格 = 10,000 µm/(100 × 3) ≈ 33.4 µm。缩写：AC = 羊膜腔（amniotic cavity）；ID = 内径（internal diameter）；OD = 外径（outer diameter）。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 注射前一日：准备用于超声验证妊娠的实验台
注意：使用慢病毒时，所有操作均应在通风的生物安全二级（BSL 2）生物安全柜中进行。超声确认妊娠可在通风柜中操作。
- 打开超声波仪器、加热台和 O2 异氟烷泵的供气（可能因设备而异）。
注意：检查异氟烷系统，确保无异氟烷泄漏至空气中。 - 在BSL 2生物安全台内放置一个空废液袋（用胶带固定在内壁以便取用）、脱毛膏、无菌包装的棉签、水、纸巾和外科胶带。
- 准备四段外科胶带（约7 cm长），用于在超声检查妊娠期间固定小鼠的四肢。
3. 超声检查确认妊娠
注意：此步骤可在 E7.5 注射的前一天（即 E6.5）进行。有关胎龄鉴定的详细说明，请参见讨论部分。
- 将妊娠时间匹配的雌性小鼠放入诱导室中。
- 打开气体流量，调节氧气流速约为2.1 LPM，并使用3-4%的异氟烷初始剂量诱导麻醉。
- 通过检查足垫反射确认雌鼠是否完全麻醉。若足垫反射消失，将异氟烷浓度降低至1.5-2%。
注：诱导麻醉约需 3 min。 - 将气流从诱导室切换至加热台的鼻罩。
- 将麻醉后的雌性小鼠仰卧位（腹部朝上）放置于加热台上，并将其吻部置于连接的鼻罩内，以确保在超声妊娠检查期间维持麻醉状态。
- 用准备好的外科胶带将四只爪子固定在桌面上，注意不要拉伸雌性动物的身体，也不要压住胡须。
- 在下腹部涂抹豌豆大小的脱毛膏。用棉签将脱毛膏均匀涂抹于下腹部（约3 x 3 cm的区域），并通过前后滚动棉签轻轻按摩。
- 一旦毛发开始从皮肤脱落，用湿纸巾润湿后擦去药膏和毛发。用湿润的纸巾清洁脱毛区域，直至所有药膏和毛发完全清除。然后将皮肤擦干。
- 在剃毛区域涂抹约李子大小的超声耦合剂，然后通过以下三种方法中的任意一种，使用超声识别子宫。
- 手动操作时，将超声探头置于超声耦合剂中，并移动探头以寻找子宫。
- 对于半手动方法#1，通过松开并沿x轴移动导轨系统的部分结构，将超声探头（连接在导轨系统上）置于雌性腹部上方。将超声探头下降至凝胶中（z轴），并在下腹部区域进行扫描（y轴）（图2A).
- 对于半手动方法 #2，将超声探头（连接至栏杆系统）降低至凝胶中，以成像下腹部。在此过程中保持超声探头静止，沿 x 和/或 y 平面移动带有附着轮子的加热台图2B).
注意：在这些早期胚胎阶段，内脏器官（例如肠道）在超声成像中可能与子宫表现相似。然而，胚胎和蜕膜呈现为一系列球状结构（类似于项链上的珠子），而肠道则表现为连续的管状结构。通过前后扫描目标结构，观察管腔空间的连通性（分离的球状结构 versus 连续的管状结构），可判断该结构是离散的球体（胚胎/蜕膜）图2C）或连续的管道（肠道）（图 2D此时无需记录胚胎数量，只需确认其存在与否即可。
- 确定妊娠状态后，将超声探头从腹部移开，并用湿润的纸巾擦拭下腹部，以清除超声耦合剂。
- 关闭异氟烷泵，移除手术胶带以松开四肢。
- 将雌性动物俯卧位（腹部朝下）放入一个洁净的笼子中 40 °C 加热板。密切观察雌性个体，直至其恢复意识，通常需要2-6分钟。
注意：确保对一位女性进行超声检查 <10 分钟，以尽量减少接触异氟烷。 - 移除所有材料和废弃物，并用70%乙醇清洁所有表面。使用干燥、柔软且无绒的纸巾擦拭超声探头上残留的超声耦合剂。关闭超声仪、通风台/BSL2工作台、加热台及O2 供应
4. 胚胎分期的超声检查
注意：此步骤在手术前进行，用于根据孕鼠的卵黄囊（AC）大小对其进行分层。当目标是靶向发育中的中枢神经系统（CNS）时，该步骤在胚胎发育第7.5天（E7.5）尤为关键。在此发育早期阶段，发育时间相差数小时会显著影响卵黄囊的大小以及神经管形成的进程。
- 按照步骤 3.1–3.5 的操作流程麻醉第一只怀孕雌性小鼠。
- 将雌鼠置于解剖台上并固定，操作方法见步骤 3.6。
- 在剃净毛发的腹部涂抹约李子大小的超声耦合剂，然后降低超声探头以成像雌鼠下腹部。
注意：此步骤假设雌鼠在前一天已通过超声检查确认怀孕，且腹部毛发已去除。若未进行前述处理，则需在涂抹超声耦合剂前按照步骤 3.7–3.8 去除毛发。在胚胎发育第 7.5 天（E7.5），子宫和蜕膜体积更大，更容易与内脏器官区分。此外，羊膜腔（AC）也更大，可与外胚膜腔（ExC）明确区分。 - 尽可能完整地扫描左右两侧子宫角。
注意：部分胚胎位于雌鼠体内较深位置，可能被遗漏。 - 记录胚胎的数量及其发育阶段。记录理想大小的羊膜腔数量、可接受大小的羊膜腔数量，以及无腔蜕膜的数量（图 2E–G）。
- 对所有妊娠状态进行分期，并据此排序。
- 对于羊膜腔多数为理想大小的雌鼠，在完成超声检查后（步骤 4.4）立即按照步骤 4.5–4.7 的说明进行注射。
- 对于羊膜腔多数为可接受大小（即外胚膜腔与羊膜腔尚未明显分为两个腔室）或无腔的雌鼠，应推迟注射，并在数小时后再次进行分期评估。若大多数腔室仍过小，则将注射时间推迟 10–12 小时。
图 2：超声检查期间对羊膜腔的观察与分期。（A）带有连接超声探头、纳米注射器和加热台的导轨系统概览。超声探头可在 x、y 和 z 平面移动，以实现与雌性小鼠腹部或羊膜腔（AC）的最佳对齐。（B）加热台可通过两个轮子在 x 和/或 y 平面移动，从而实现对羊膜腔的精确定位和评估，同时保持超声探头静止。（C）在超声检查期间，雌性小鼠腹腔内 E6.5 期蜕膜的代表性超声图像，用于确认妊娠（白色虚线轮廓）。此时尚未形成腔体，但有时可见胚外体腔锥（ectoplacental cone，白色星号）。蜕膜因其球形结构可被识别，并可与呈连续管状的肠道相区分。（D）小肠的代表性图像序列（白色虚线轮廓），在扫描下腹部时呈连续结构。（E-G）E7.5 期注射前进行腔体分期时的代表性超声图像。羊膜腔和胚外体腔已形成，并由羊膜（amnion）分隔。胚外体腔锥作为主要血供结构，在超声图像中呈现为明亮区域。羊膜腔位于距离胚外体腔锥最远端。（E）理想大小的羊膜腔（AC）比胚外体腔更大，而中等大小的腔体则较小（F）。若未观察到任何腔体（G），则表明胚胎可能已被吸收或尚未发育至 E7.5 期。比例尺 = 1 mm。缩写：A = 羊膜（Amnion）；AC = 羊膜腔（Amniotic Cavity）；ExC = 胚外体腔（Exocelomic Cavity）；EC = 胚外体腔锥（Ectoplacental Cone）。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 注射当天：准备 BSL2 操作台以进行手术
- 将一块弹性膜粘贴至市售改良型培养皿的圆形中央开口处。确保弹性膜与培养皿紧密贴合，以防止泄漏。
注意：若培养皿出现泄漏或粘合不牢固，可用胶带进一步固定弹性膜边缘。 - 在弹性膜中心处切开一个1-1.5 cm长的切口。
- 开启超声仪、BSL2级生物安全台、加热板、异氟烷泵的O2供气装置以及玻璃珠灭菌器（设定温度为300 °C）。
- 在BSL2级生物安全台内，放置一个空的废液袋（用胶带固定于内壁以便取用）；无菌包装的棉签（每次手术或每只雌性动物使用一根新的）；手术器械（剪刀、镊子、夹子、缝合线）及手术胶带；一瓶室温磷酸盐缓冲液（PBS）、一个用于收集废液的空瓶和一支25 mL移液管；一个带弹性膜的培养皿用于手术；培养皿盖上固定一块2 x 2-3 x 3 cm大小的Parafilm膜（用一滴水固定）；油泥：4个较大的球体或立方体（约3 x 3 x 3 cm³）和一个圆柱形条状物（约4 x 1 cm）；一支装有镇痛剂（例如，布托啡诺，0.05-0.1 mg/kg体重）的注射器以及眼用凝胶。注意：油泥制成的球体（或立方体）将在培养皿置于雌性动物腹部上方时充当“支脚”或支撑架；圆柱形油泥条用于固定培养皿内的胚胎。若需注射多种溶液，或在注射过程中需重新填充针头，只要溶液之间保持足够间距，可重复使用同一块Parafilm膜。
6. 针头装载
- 用纸巾擦去多余的矿物油，以获得更好的握持效果。
注意：始终从尖端向外清洁，以防止损坏或造成伤害。 - 确保所有组件（一个密封O形圈、一个垫片和一个前部垫圈——均位于卡套下方，图3A）按正确方向安装（图3B，为便于观察已移除卡套），以固定毛细针并形成气密连接，在推进或回撤针内金属推杆时避免产生气泡。
- 确保纳米注射器的金属推杆已完全回缩。通过按下填充按钮并等待双声提示音，以确认推杆已完全回缩。
- 将卡套装上但略微松开（逆时针旋转45–90度），将玻璃针滑至金属推杆上，并连同金属推杆一起穿过前部垫圈，直至抵达垫片位置（图3C、D，为便于观察已移除卡套）。
注意：当推杆穿过垫圈时会略有阻力，到达垫片时阻力减小。确保毛细针牢固插入垫片，以形成气密连接（图3D）。 - 通过拧紧纳米注射器的卡套来固定针头。
注意：切勿过度拧紧，以免压碎针头。 - 按下排空按钮，将推杆推入针内，排出针尖处的油。若玻璃针发生移动，应先回缩推杆，取下针头并重新装载。若此过程导致气泡形成，则取下针头并用矿物油重新填充。
注意：正确固定的针头在推杆运动时不应移动。 - 在一小片Parafilm1上滴加病毒溶液（约 6 µL）或其他注射液（图3E；图中使用伊文思蓝染料以便观察）。
注意：纳米注射器的最大容量约为 5 µL。 - 按下填充按钮，形成一个气泡，作为油与溶液之间的分隔层（图3F）。
注意：该气泡也可在填充或排空针头时作为位置标记。 - 将针头下移，使针尖浸入溶液中，然后按下填充按钮（图3F、G）。
- 观察溶液在气泡后进入针内的液面变化。若气泡被拉长但液体未进入针内，说明发生堵塞，应先按下排空按钮排出堵塞物，再按下填充按钮重新加载。若此操作无法解决问题，则更换针头。
- 当针头完全装填后（图3H），将针头在Z轴方向上抬，并在针尖处吸入少量空气，以防止溶液在针尖处蒸发或针头堵塞。
- 将连接针头的纳米注射器转向远离操作者的方向，朝向实验台后方放置，以避免意外损坏或造成伤害。
图3将针头连接至纳米注射仪并加载溶液。 (A) 针头安装到纳米注射仪之前的起始位置：金属柱塞完全缩回，夹头已安装。B在卡盘下方，显示了用于固定和夹紧针头的三个组件，其正确顺序（从左到右）为：密封O形圈（黑色，较细）、垫片（白色）、带大孔的O形圈（黑色，针头需穿过此孔）。为确保气密性连接，将玻璃针头套入金属推杆上C）并向前推过前部 O 形圈的开口，直至到达垫片处（D). (E-H) 将溶液装入针头。E在培养皿盖内的石蜡膜上滴加一滴溶液。F) 通过按压产生一个气泡 填充 在加载溶液之前，将针尖浸入溶液中。G溶液正在装入针头。H) 将溶液装入针管中。注意：此处已移除夹头(B-D）用于可视化，但在实验过程中应保持连接。固定针头的最后一步是拧紧夹头。伊文思蓝染料用于可视化 E-H. 请点击此处以查看此图的放大版本。
7. 注射
注意：本实验步骤中使用的所有仪器均需在手术前及每只小鼠操作之间进行灭菌处理。
- 用理想的腔体大小对第一只雌性动物进行麻醉（参见第4节）。
- 按照步骤3.1–3.6所述，将雌性动物放置并固定在手术台上。
- 在眼睛上涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥，并皮下注射镇痛药。
注意：推荐使用的镇痛药包括布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg 体重）、氟尼辛（2.5 mg/kg）或符合当地动物福利法规的类似药物。围手术期多模式镇痛通过注射镇痛药和异氟烷维持。 - 用浸有0.5 mg/mL 氯己定溶液（或类似物）的纱布无菌擦拭下腹部，并擦干皮肤。使用手术剪在下腹部做一条1.5–2.0 cm的垂直正中皮肤切口。
注意：按照当地批准的消毒程序准备手术区域。 - 轻柔提起皮肤，并将切口周围约1 cm范围内的皮肤与下方肌肉层分离，以便术后缝合。
- 在肌肉层做一条1 cm长的垂直正中切口。
- 用一对镊子轻轻提起一侧皮肤和肌肉层，用另一对镊子寻找子宫角。
注意：蜕膜呈串珠状排列，而肠道为一条长而连续的管道（图4A）。 - 用镊子小心地将两侧子宫角从腹腔中拉出。持镊时应夹住胚胎之间的组织，切勿直接挤压胚胎（图4B）。
注意：子宫在宫颈处与身体相连，两个卵巢/输卵管通过韧带附着。切勿从这些固定点拉扯或分离子宫。 - 计数并记录左侧和右侧的胚胎数量。
- 将胚胎编号，方向可从卵巢向宫颈，或从宫颈向卵巢。
注意：若需在胚胎发育阶段回收已注射胚胎，此步骤尤为重要。 - 用湿润的棉签轻轻将除前三个待注射胚胎外的所有胚胎推回腹腔。
- 在培养皿中的弹性膜上滴加一滴PBS，并立即将其置于胚胎上方。
- 将闭合的镊子插入弹性膜的切口，然后松开镊子以打开弹性膜切口，使液体滴落在胚胎上。
注意：此举可确保胚胎再水化，并使弹性膜贴附于雌性动物湿润的皮肤，防止后续步骤中PBS泄漏。 - 用镊子将对应三个胚胎长度的一段子宫穿过弹性膜，并将培养皿轻轻放置在雌性动物腹部上方。
- 使用镊子和湿润棉签调整子宫位置及弹性膜，确保弹性膜与雌性动物皮肤密封，防止PBS泄漏。
- 使用四个黏土支脚将培养皿固定在腹部正上方，以减少对雌性动物的压力，并降低成像过程受其呼吸和心跳影响的敏感性。
- 将黏土圆柱体压在胚胎/子宫右侧，以固定子宫（图4C）。
注意：此方向说明假设注射针位于雌性动物左侧，且暴露的是其左侧子宫角的胚胎。子宫侧别（左或右子宫角）至关重要，因为羊膜腔（AC）可能朝向注射针（左侧子宫角；图4D），或朝向固定用的黏土圆柱体（右侧子宫角；图4E）。 - 若需注射右侧子宫角的胚胎，应将黏土圆柱体置于胚胎左侧（图4F），并将加热台旋转180°（图4G），以获得正确方向。若可移动注射针，则根据具体实验设置进行相应调整。
- 向培养皿中加入PBS，直至胚胎和子宫完全浸没于PBS中。
- 将超声探头浸入PBS中，并调整小鼠/手术台位置，使第一个胚胎与超声探头对齐，以便记录注射过程。
注意：“第一个”指从卵巢向宫颈方向编号的第一个胚胎。 - 扫描全部三个胚胎并检查羊膜腔（AC）。按以下方法确定注射体积：
- 使用超声设备测量AC直径：若AC直径 ≤0.2 mm，注射69 nL；若AC直径 >0.2 mm 且 ≤0.29 mm，注射2 × 69 nL（= 138 nL）；若AC直径 >0.29 mm，注射3 × 69 nL（= 207 nL）（图4H）。
注意：先前实验表明，在E7.5阶段，注射体积高达207 nL均可良好耐受15。当AC相对体积增加不超过90%时，可实现成功注射且对胚胎存活影响最小15。同窝仔鼠或不同小鼠品系间AC大小存在差异，可能需要进一步优化。
- 使用超声设备测量AC直径：若AC直径 ≤0.2 mm，注射69 nL；若AC直径 >0.2 mm 且 ≤0.29 mm，注射2 × 69 nL（= 138 nL）；若AC直径 >0.29 mm，注射3 × 69 nL（= 207 nL）（图4H）。
- 使用注射控制器设定注射体积。
- 将注射速度设为慢速，注射速率为23 nL/s。
注意：不同型号的设备可能导致不同的注射力。 - 使用导轨系统的主轮（x轴和z轴平面，图4I）将注射针浸入PBS中，并在纳米注射控制器上按下排空，直至液体到达针尖。
注意：若针头堵塞，按下排空可溶解或排出堵塞物。 - 将针头从PBS中提起，并按下注射，确认释放出一滴近似目标体积的液体。
- 将针头重新浸入PBS中，并通过显微操作仪的y轴轮移动纳米注射装置，使针头与超声探头及胚胎对齐（图4J）。
注意：当针尖在超声图像上呈现为一个亮点时，即为完全对齐（图4K、L）。显微操作仪可在三个方向平面上移动针头。 - 调节注射角度旋钮，确保注射角度相对于子宫壁接近垂直。使用显微操作仪上的注射旋钮一次性将针头插入AC内（图4J–M）。密切观察针尖亮度。若针尖在超声图像中消失，可前后移动超声探头以重新对焦。
注意：一旦针头进入AC内，可在不损伤胚胎的前提下进行微小位置和对焦调整（调整范围约~0.3 mm）。切勿超出此范围调整针头位置。 - 按下注射（对于207 nL，设定体积为69 nL并注射三次）。注射完成后，等待额外5–10秒，再以一次轻柔动作撤回针头。
图 4：成功注射所需羊膜腔的最佳大小与方向。（A）子宫角含有多个E7.5天的蜕膜，呈串珠状球形结构（下方），与上方的大肠进行对比。（B）在蜕膜之间夹住子宫组织（白色虚线所示）。避免用镊子直接挤压蜕膜（白色箭头所示），因为在发育早期阶段，蜕膜及其中的胚胎较为脆弱，受到过度外力时容易被吸收。（C）将小鼠仰卧固定，蜕膜暴露于盛有PBS的培养皿中，并由四脚造型的油泥支撑。额外的一小块圆柱形油泥用于稳定蜕膜。（D、E）羊膜腔（AC）的方向受子宫角暴露侧的影响。若使用左侧子宫角的蜕膜，羊膜腔将远离油泥稳定器，针头可从左侧轻松进入（D）；但若使用右侧子宫角，滋养层锥体（ectoplacental cone）将朝向针头，使羊膜腔更难接近（E）。因此，在对右侧子宫角注射时，应将油泥稳定器置于朝向针头的一侧（F），并将整个加热台旋转180°（G）。（H）根据羊膜腔大小推荐的注射体积。通常，直径 ≤ 0.2 mm 的腔室最多可注射69 nL；直径 > 0.2 mm 且 ≤ 0.29 mm 的腔室可耐受最多2 × 69 nL（138 nL）的体积；而直径 > 0.29 mm 的腔室可注射3 × 69 nL（207 nL）。比例尺 = 1 mm。（I, J）纳米注射装置连接至导轨系统，可在x轴和/或z轴方向移动。通过注射角度调节轮可调整针头角度。（K, L）当针尖（白色箭头所示）在超声图像中最亮时，表示其已与羊膜腔对齐（L）。（M）超声图像显示注射过程，针尖位于羊膜腔内且位置良好（白色箭头所示）。缩写：A = 羊膜（Amnion）；AC = 羊膜腔（Amniotic Cavity）；ExC = 外体腔（Exocelomic Cavity）；EC = 滋养层锥体（Ectoplacental Cone）。请点击此处查看该图的高清版本。
- 移动载物台至下一个胚胎，若其余两个胚胎的AC大小合适，则重复步骤7.22–7.26。
- 使用显微操作器将超声探头和针头从 PBS 中提起。将针头转向远离操作者的方向，以避免损坏和造成伤害。
- 用镊子引导 1st 和 2nd 将胚胎通过弹性组织轻轻推回雌性腹部。轻柔地夹住靠近3的邻近组织rd 胚胎并轻拉子宫朝向弹性切口的上端。轻轻提起 4th-6th 用镊子夹取胚胎，并让其继续培养3rd 胚胎重新进入腹腔。
注意：此步骤可在不更换 PBS 或移除培养皿的情况下进行。 - 根据需要重复操作，直至所有具有最佳ACs的胚胎完成注射或达到时间限制。
- 轻轻地将胚胎/子宫推回雌性动物的腹腔内。
- 吸除 PBS，并移去培养皿。若使用了病毒，应作为感染性废物处理。
- 用Vicryl（USP 6-0，针长13 mm，3/8弧形）连续或间断缝合肌层，然后用1-2个皮钉闭合皮肤（参见 材料清单).
- 关闭异氟烷泵。
- 移除手术胶带，将雌性动物俯卧位（腹部向下）放置于洁净的笼具中，并置于 40 °C 加热板
注意：雌性小鼠预计在10分钟内恢复意识并能够活动。确保整个操作在30分钟内完成。雌性小鼠的遗传背景、年龄和体重可能影响其对麻醉的敏感性。手术过程中应密切监测小鼠是否出现呼吸减慢（呼吸减慢提示麻醉过深）或活动（提示麻醉过浅）。根据当地动物福利法规，若需要，可在首次注射后8小时给予布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg体重）或氟尼辛（2.5 mg/kg）或其他类似药物。 - 如果需要对另一只雌性动物进行注射，在监测第一只动物苏醒的同时，准备手术区域。
- 用70%乙醇擦拭手术器械，以去除残留的血液或组织，并在预热的玻璃珠灭菌器中灭菌10秒。丢弃棉签和用过的纸巾。用纸巾将培养皿和黏土块擦干。
- 重复步骤 7.1–7.35，直至所有雌性个体完成注射。
- 弃置并丢弃针头。
- 如果针头中残留有病毒或注射溶液，按压 空 将纳米注射器上的针头内容物排空至纸巾上。
- 完全按下金属柱塞并回抽 填充 直到控制器发出两声蜂鸣声，表示活塞已完全缩回。
- 松开夹头，将针头从金属推杆上滑下。将针头丢弃至锐器废物容器中。
- 清洁BSL-2实验台。
- 如果使用了病毒，用消毒剂喷洒整个手术区域（参见 材料表15分钟后，擦去消毒剂，并用70%乙醇清洁整个手术区域。若未使用病毒，应用70%乙醇清洁所有表面。
- 用干燥、柔软且无绒的纸巾擦去超声探头表面残留的 PBS。
- 根据生物安全指南丢弃废弃物。
- 关闭超声波仪、加热台、BSL2 操作台和 O2 供应
结果
在E7.5时期注射hPGK-H2B-GFP慢病毒11,12的胚胎于E13.5时期收集，并在荧光解剖显微镜下观察（图5A）。神经板成功转导的胚胎主要在脑部，以及皮肤等其他外胚层来源组织中表现出强烈的荧光报告基因表达（图5A、B）。若注射体积过大（超过本方案推荐体积，例如≥500 nL），会增加羊膜腔（AC）内压力，可能导致胚胎完全吸收（数据未显示）或出现神经管缺陷，如露脑畸形（图5A）。在E7.5时期成功注射的胚胎，其前脑至后脑区域呈现均匀的转导效果（图5C–J）。
约 2 × 1010 感染单位（IFU）的慢病毒滴度可实现超过 95% 的靶向效率，而约 1 × 109 IFU 的滴度则可达到 15% 的靶向效率15。此外，以往使用电穿孔难以靶向的结构，如脉络丛17,18，也可被有效靶向（图 5 E,F）。通过调整注入前脑室（AC）的病毒滴度，可调节转导效率。低滴度注射可实现单细胞克隆的转导（图 5C、图 5E 和 图 5G,H），而高滴度病毒则几乎可转导全脑近 100% 的细胞（图 5D、图 5F、图 5H 和 图 5J）。因此，NEPTUNE 技术既可用于克隆转导、谱系示踪和遗传筛选研究，也可用于研究基因在全脑范围内过表达或下调所产生的整体效应。
哺乳动物眼睛的发育是胚胎外胚层三个衍生物之间有序通讯的结果：神经视网膜（NR）和视网膜色素上皮（RPE）来源于前脑腹侧的神经上皮，而表面外胚层则发育为晶状体和角膜上皮。然而，角膜的另外两层——中央基质层和后部内皮层——则起源于眼周间充质的神经嵴细胞19,20。对E7.5时注射高滴度慢病毒的E13.5胚胎进行冠状切片观察，结果显示，与大脑类似，眼部的神经组织、晶状体、角膜以及间充质均实现了高效且均匀的转导（图5K）。随着神经管的进一步发育，在E8.5和E9.5注射后，晶状体和角膜上皮仍能持续被靶向（图5L 和 图5N），而起源于神经外胚层的眼部组织在E8.5时的转导效率较低（图5L,M），在E9.5时则几乎未被靶向（图5N）。
尽管大多数病毒颗粒在注射后会感染暴露的组织，但部分颗粒可转导后期发育的非外胚层来源组织。图6A）。唾液腺及其导管在E11.5左右从口腔上皮发育而来21 并以NEPTUNE为靶向（图6B）。在E9.5注射后，舌部的舌上皮可实现良好转导；然而，其下方的间充质呈阴性（图6C；方括号表示转导的细胞；星号表示未转导细胞的自发荧光信号）。此外，舌上皮内存在阳性簇状区域，由阴性区段分隔（图6C，白色箭头所示），提示乳头表面发生了转导。已有关于神经嵴细胞存在于舌部下方间充质及舌上皮内的描述，这些细胞参与味觉乳头和味蕾的发育过程22的确，在 E7.5 时期注射可在 E13.5 时期实现舌间充质的广泛转导（图6D，表明早期注射靶向神经嵴细胞，这些细胞有助于舌部间充质的形成。
在脊椎动物中，背根神经节（DRGs）是外周神经系统（PNS）的核心组成部分，因为来自身体外周的所有躯体感觉输入（如温度、疼痛、压力）均通过激活背根神经节神经元传递至大脑23背根神经节中的神经元和胶质细胞均起源于躯干神经嵴细胞24. 慢病毒注射使用普遍性hPGK启动子控制荧光报告基因的表达，可实现对中枢和外周神经系统广泛靶向图7A），在脊髓中转导神经元和前体细胞图 7B)，以及背根神经节（DRG）图7C). 使用 doublecortin 的 MiniPromoter25 使其能够将GFP表达限制在神经元中15 和 图7D，E).
图5：使用NEPTUNE实现高效或克隆型转导。 (A在解剖显微镜下观察，采用标准照明（左图）和 GFP 荧光照明（右图）的 E13.5 胚胎。最左侧为未注射胚胎，最右侧为成功注射胚胎，脑部显示阳性信号（最右侧胚胎）。中间胚胎因注射体积过大导致露脑畸形。B) E7.5 注射实现皮肤和脑靶向。比例尺 = 50 µm. (C, DE13.5 期前脑低克隆转导的共聚焦图像C）或高效转导（D). (C、E、G、I) 脑内不同区域的克隆转导。D、F、H、J) 高效转导大脑不同区域。比例尺 = 200 µm. 不同的转导效率代表了中枢神经系统其他区域的情况。E, F脉络丛靶向，克隆性E）或具有高效率（F。比例尺 = 200 µm. (G, H克隆靶向G）和高效（H)针对后脑的定位，在（中放大I, J。比例尺 = 200 µm. (K) E13.5 时眼睛中 GFP 报告基因的表达情况 在子宫内 E7.5 时注射L, M) E15.5 时眼睛中 GFP 报告基因的表达 在子宫内 E8.5 时注射L），框选区域在（M），或在E9.5（N）。自体荧光血管用白色星号标记。比例尺 = 100 µm缩写：NEPTUNE = ne乌拉尔 p晚期 t靶向 在子宫内 n肛门注射eC = 角膜；LE = 晶状体上皮；LF = 晶状体纤维；M = 间充质；NR = 神经视网膜；ON = 视神经；RPE = 视网膜色素上皮；GFP = green fluorescent protein；CNS = central nervous system 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6: 在子宫内 非神经组织的转导 (AE15.5 口腔腔隙的共聚焦图像。胚胎在 E9.5 时注射了荧光报告病毒慢病毒。比例尺 = 200 µm. (B, C) (B) 插图放大图；经病毒转导的唾液腺导管上皮。C) 插图放大；转导了GFP报告病毒的背侧舌上皮（白色括号）。源自神经嵴细胞的下方间充质呈阴性。白色箭头指示出被病毒转导的上皮细胞包围的乳头结构，其中神经嵴细胞为阴性（自体荧光的血细胞/血管以白色星号标记）。比例尺 = 50 µm. (D) E7.5 时注射荧光报告病毒后 E13.5 舌间充质的示意图与共聚焦图像。比例尺 = 50 µm缩写：D = 背侧；M = 间充质；N = 鼻咽部；SLD = 舌下管；SMD = 颌下管；T = 舌；V = 腹侧；GFP = green fluorescent protein。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图7神经嵴来源的背根神经节细胞的转导 (A) NEPTUNE 在 E7.5 时期靶向可同时作用于中枢神经系统和外周神经系统。 (BE13.5 脊髓和DRG注射后的共聚焦图像 hPGK-H2B-GFP 报告慢病毒在E7.5时显示对SOX2的转导+ 神经前体细胞和 NeuN+ 神经元。比例尺 = 100 µm. (CB图中框选区域显示DRG中SOX2的GFP表达+ （白色箭头）和 NeuN+ （白色箭头）细胞群体。比例尺 = 20 µm. (DE13.5 脊髓和DRG注射后的共聚焦图像 DCX-H2B-GFP 在E7.5阶段靶向DCX的慢病毒+ 细胞。比例尺 = 100 µm. (E) 方框所示区域 D 显示DRG中GFP表达局限于DCX+ 神经元（白色箭头）。DCX- 细胞GFP染色呈阴性（白色箭头）。比例尺 = 20 µm缩写：NEPTUNE = ne乌拉尔 p晚期 t靶向 在子宫内 n肛门注射e作用；CNS = 中枢神经系统；PNS = 外周神经系统；DRGs = 背根神经节；GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
本方案中有多个步骤会影响胚胎存活率、注射质量和实验结果。胚胎的孕龄定义为：过夜交配后，以发现阴道栓当天中午为 E0.5。在 E6.5 下午晚些时候或傍晚进行超声妊娠检查，可确保胚胎发育到足以通过超声识别的阶段。该检查具有以下作用：（1）可预先筛选出实际怀孕的栓阳性小鼠数量；（2）避免在栓阳性小鼠未怀孕的情况下解冻病毒，造成不必要的浪费；（3）减少对小鼠的不必要干预（避免对未怀孕雌鼠进行手术）。
在E7.5时期，胚胎对外力非常敏感，应小心操作。例如，牵拉子宫角或挤压蜕膜可导致胚胎被吸收。当子宫组织暴露于雌性腹部外时，应始终保持其湿润，以防组织干燥。大部分蜕膜应保留在雌性腹部内，仅暴露3-4个用于注射。针头的锋利程度是影响注射成功与否的另一个关键因素。钝化或破损的针尖会导致对蜕膜反复穿刺，或在进入羊膜腔前压迫建模黏土，从而增加胚胎吸收率。因此，应始终妥善保存研磨良好且锋利的针头，并在最多使用2只雌性动物后及时更换。
本方案描述了如何通过一次慢病毒注射靶向神经板。此外，该方法可调节转导效率，从而实现从单细胞克隆到全脑范围的表达。然而，该方法也会靶向其他非神经组织，包括皮肤和口腔上皮。同时，所有细胞类型（包括前体细胞和分化细胞）均会被转导，使得该方法效率较高但缺乏特异性。在病毒载体中使用MiniPromoters可实现外源基因在神经元或星形胶质细胞中的特异性表达15。这种方法的优势在于无需使用特定的转基因Cre动物模型，从而减少了工作量（品系维持和基因型鉴定）以及相关成本。
NEPTUNE 技术的局限性包括操作技术难度较高、难以以可预测且稳定的速度获得妊娠雌性动物，以及获取专用仪器的成本较高。此外，慢病毒对细胞的非特异性靶向作用既可被视为该技术的优势，也可被视为其局限性之一。向动脉管腔内注射较大体积的液体可导致露脑畸形。13，尽管采用本文所述的体积可避免脑部畸形和露脑畸形15因此，对大脑发育产生负面影响是一种潜在风险 在子宫内 纳米注射需谨慎操作，应根据胚胎发育阶段和心腔（AC）大小注入适量的液体，避免过量。
未来对该技术的改进可能聚焦于病毒嗜性。腺相关病毒（AAVs）具有不同的血清型，已被证明可有效靶向中枢神经系统中的不同细胞类型。17,26然而，腺相关病毒（AAV）不会整合到宿主细胞基因组中，因此在分裂速率较高的细胞中可能会丢失。尽管有多种方法可提高NEPTUNE的特异性，但在基因操作领域，转基因动物仍然是金标准。 体内Cas9 小鼠和编码 sgRNA 的慢病毒已用于胚胎表皮中的遗传筛选27 也可适用于发育中的中枢神经系统。
在E7.5时期向AC注射可高效靶向神经管形成开始前的神经外胚层细胞，且对发育中脑组织的靶向效率高于 在子宫内 电穿孔。这使得能够从更早的时间点研究对大脑发育重要的遗传信号。与经典的遗传小鼠模型相比，NEPTUNE 提供了一种灵活的功能基因分析方法。相较于需要数月甚至数年的传统模型，NEPTUNE 可在数天至数周内观察基因过表达或基因敲除后的表型。通过注射多种病毒载体，可在单个胚胎内同时操控多个基因，避免了构建双敲除或三敲除动物模型的需要。因此，NEPTUNE 不仅节省了时间，还能减少科研中动物的使用数量。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
感谢Bettina Semsch和Jia Sun（Infinigene）对小鼠的精心护理；感谢Biomedicum影像核心设施（BIC）的Florian Salomons和Göran Månsson在图像采集和咨询方面提供的帮助。资助：我们感谢以下机构对本项目的支持：瑞典研究理事会、卡罗林斯卡学院（KI基金会、职业发展资助、博士生KID资助、SFO StratNeuro资助、创新医学中心）、Ollie和Elof Ericssons基金会、Tornspiran基金会、Jeansssons基金会、Sven和Ebba-Christina Hagbergs奖项及研究资助、Knut和Alice Wallenberg项目资助、Fredrik和Ingrid Thurings基金会、Lars Hiertas Minne、瑞典儿童癌症基金会（Barncancerfonden）、Åhlen基金会、Åke Wiberg基金会、Tore Nilssons基金会，以及授予ERA的瑞典基金会启动资助。图4D、E使用BioRender.com制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD Bioscience | 309628 | |
| 27 G 针头 | BD Bioscience | 300635 | |
| 3.5英寸毛细管 | Drummond Scientific | 3000203G/X | 用于自制玻璃毛细管针的拉制 |
| 70 MHz MS系列换能器 | Visual Sonics | MS700 | |
| Aquasonic 清澈超声波凝胶 | Parker Laboratories | 3月50日 | |
| Autoclip Applier 9 mm | Angthos | 12020-09 | |
| CD1小鼠 | 查尔斯河实验室，德国 | Crl:CD1(ICR) | 雌性：8 周龄以上 雄性：从12周龄开始 |
| 棉签 | OneMed Sverige AB | 120788 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| 精细直型手术镊 13 cm | Agnthos | 08-032-130 | |
| EG-400 Narishige 微量移液器研磨仪 | Narishige | NA | |
| EZ夹子 9 mm | Angthos | 59027 | 夹子 |
| 虹膜剪，超锐型，直剪，9 cm | Agnthos | 307-336-090 | |
| 异氟烷 | Baxter Medical AB | EAN: 50085412586613 | 瑞典药店购买 |
| Kimwipes | Kimberly Clarke | 7557 | |
| 膜带 | Visual Sonics | SA-11053 | |
| 微移液管拉制仪 | Sutter Instrument | P-97 | |
| 黏土模型 | 正义链 AB | 10209 | |
| 小鼠操作表 | Visual Sonics | 50249 | |
| Nanoject II 自动注射仪套装 | Drummond | 3-000-205A | |
| Parafilm | 贝米斯 | HS234526C | |
| 带中央开口的培养皿（低壁） | Visual Sonics | SA-11620 | |
| 培养皿，（ØxH)：92 × 16 毫米 | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Rely+On Virkon | DuPont | 130000132037 | 消毒剂 |
| 硅胶膜 | Visual Sonics | SA-11054 | |
| Steri 250 热珠灭菌器 | Angthos | 31100 | |
| 手术胶带（1.25 cm × 9.14 m） | Medicarrier | 67034 | |
| Vevo Compact Dual（Med. Air & O2麻醉系统 | Visual Sonics | VS-12055 | |
| Vevo 成像系统 2 | Visual Sonics | VS-11983 | |
| Vevo2100 | Visual Sonics | VS-20047 | |
| Vicryl 6-0；C-3 针头，45 cm 紫色缝线 | Agnthos | J384H |
参考文献
- Theiler, K. The House mouse. Atlas of embryonic development. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).
- Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).
- Taylor, J. C., et al. Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders. Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).
- Pizzo, L., et al. Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants. Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).
- Sakai, Y. Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure. The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).
- Schoenwolf, G. C. Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses. Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).
- Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate. Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047(2010).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).
- Slevin, J. C., et al. High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice. BMC Developmental Biology. 6, 10(2006).
- Mangold, K., et al. Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE. Cell Reports Methods. 1, 100043(2021).
- Kameneva, P., et al. Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin. Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101(2013).
- Heavner, W., Pevny, L. Eye development and retinogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391(2012).
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, 103947(2013).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop. Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).
- Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds. Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).
- Marmigère, F., Ernfors, P. Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).
- Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).
- Portales-Casamar, E., et al. A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
重印与许可
