Ex Vivo 小鼠门静脉肝脏灌注

摘要

本方案描述了一种通过门静脉灌注对完整小鼠肝脏进行切片以用于代谢研究的简便方法。

摘要

糖尿病、前驱糖尿病、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等代谢性疾病正变得越来越普遍。ex vivo 肝脏灌注技术可利用核磁共振（NMR）在严格控制的营养条件下对肝脏代谢进行综合分析。由于in silico模拟仍主要是评估激素作用和药物干预效果的理论手段，灌注肝脏模型仍然是研究肝脏代谢最有价值的实验平台之一。由于这些研究为肝脏生理学的基本认知提供指导，其实验结果必须准确且可重复。ex vivo肝脏灌注实验可重复性的最关键因素在于手术质量。因此，我们提出了一种系统化且高效的方法，用于在in situ NMR实验背景下开展小鼠肝脏ex vivo灌注。我们还描述了一种独特的应用方式，并讨论了此类研究中常见的问题。总体目标是提供一份简明的指南，介绍我们经过多年优化、认为是in situ NMR实验中实现肝脏切除与灌注可重复结果的“金标准”技术。由于磁体中心距离较长，且在NMR实验过程中无法对组织进行干预，使得我们的方法具有创新性。

引言

离体 灌注在肝脏代谢研究中至关重要，经门静脉灌注是此类研究的标准方法。为了单独研究肝脏代谢，必须将肝脏从体内切除，以避免其他器官代谢（即全身代谢）带来的干扰，并能够控制激素的可利用性（如胰岛素、胰高血糖素等）。该方法对于理解糖尿病、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等疾病对肝脏代谢的影响以及药物作用机制具有重要意义。本文旨在提供肝脏切除与灌注的操作指南。我们建立了一套简化的操作流程，以确保这些肝脏代谢研究具备足够的严谨性和可重复性。若手术操作不当，所获得的代谢数据将出现显著变异。本文详细描述了一种系统化的方法，用于在代谢研究背景下实施门静脉插管与肝脏切除。 原位 在核磁共振（NMR）波谱仪中，如文献所述^1,2,3,4,5.

目前尚无文献描述一种 离体 使用核磁共振仪中的玻璃柱进行肝脏灌注。目前尚无视频或文字资料能清晰展示如何对小鼠肝脏实施该操作，特别是如何插管门静脉、切除肝脏、转移并将其悬挂于玻璃柱上。鉴于基因修饰小鼠已广泛用于肝脏代谢研究，这一操作步骤亟需完整详尽的描述。....

方案

涉及小鼠的实验均按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会的规定进行（方案编号 #201909320）。所使用的小鼠品系为 C57BL/6J；所有小鼠均为雄性。该方法通常也适用于采用其他标准小鼠品系的研究。该手术最好由两人协作完成。

1. 初始设置

1. 用含有 Krebs-Henseleit 电解质⁶（25 mM NaHCO₃、112 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、1.2 mM KH₂PO₄、0.5 mM 乙二胺四乙酸钠、1.25 mM CaCl₂）、6 mM 乳酸钠、0.6 mM 丙酮酸钠、0.2 mM [U-¹³C] 丙酸钠、10% (v/v) D₂O 以及 0.63 mM 混合脂肪酸（包含棕榈酸（占总量的 22.1%）、棕榈油酸（5.2%）、硬脂酸（2.7%）、油酸（27%）、亚油酸（37.7%）、γ-亚麻酸（2.4%）和二十二碳六烯酸（2.8%））并添加 2% (w/v) 牛血清白蛋白的灌注液对肝脏进行灌注。使用 HCl（必要时可用 NaOH）将灌注液的终末 pH 值调节至 7.3。

....

结果

肝脏功能主要通过耗氧量和灌注流速来评估。典型的灌注流速为4-8 mL/min，耗氧量为1 µmol/min·g。这些指标会因具体的实验条件和生物学差异而有所变化。

异氟烷的确切用量取决于所使用的麻醉系统类型以及小鼠的环境、年龄和体重。在手术过程中，异氟烷及其输送气体的流量保持不变，尽管根据手术区域的具体情况（如背景噪音）可能需要进行一些调整¹⁰。当肝素深层皮下注射时，其起效时间可能延迟达20–40分钟。肝素注射后等待10分钟可确保其起效¹⁶。利多卡因的起效时间为2分钟¹¹。

插入导管时，保持斜面向上，与门静脉的夹角不超过15°。两条缝线均打两个结。第一条缝线必须在导管锥形末端之后打结。若门静脉插管成功，肝脏会因灌注而变苍白。当外科医生切除肝脏时，助手使用棉签清除切除的组织。为避免污染肝脏并防止损伤肝叶，切勿切穿胃部。在持握导管时，不要对门静脉或肝脏施加过大的张力，以免导致门静脉移位或撕.......

讨论

该手术操作具有挑战性，需要经过大量练习才能获得可重复的结果。应根据需要调整异氟烷和载气，以尽可能在整个手术过程中维持动物的生命体征。环境、一天中的时间、年龄、体重以及其他多种因素均会影响麻醉效果。体重、饮食、小鼠品系和年龄也可能影响手术，因为脂肪堆积会干扰门静脉的可视化。固定四肢时需注意，避免对颈部施加任何可能导致窒息的牵拉力。此外，小鼠脂肪越多，缝线在导管周围的结扎就需要越紧，以抵消脂质导致导管与血管之间摩擦系数降低的影响。肝素的作用起始时间至关重要，因为异氟烷暴露过久会在器官中产生假象¹⁷。肝素和利多卡因注射需使用23G、19.05 mm长度的针头，以确保注射过程中不会对内脏器官造成损伤。缝线环必须套在导管的锥形端上，否则在收紧时会阻塞血管。一旦插入导管，通常会因压力导致血液从导管回流，这是导管位置正确的积极信号。可轻微上提导管以直观确认导管尖端已越过第一道缝线足够距离。操作时转动腕部和肩部，可确保助手打结时缝线不会从锥形尖端滑脱。将肝脏从硅胶灌注管转移至柱子时，会在导管顶部保留一滴灌注液。该液滴可防止气泡进入导管并流入肝脏。导管顶部灌注液的弯月面提供了足够的体积，使肝脏在连接完成前维.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 鲁尔锁一次性无菌一次性注射器	N/A	N/A	非特定品牌
100 cm 水套玻璃柱	N/A	N/A	定制
2-0 丝线缝合线	布雷因特里科学公司	N/A
22 号导管 1 英寸 无安全装置	泰尔茂	SRFF2225
23 G 0.75 英寸皮下针头	Exel International	26407
27 G 1.5 英寸皮下针头	Exel International	26426
4×4 英寸外科手术平台	N/A	N/A	定制
70% 酒精擦拭巾	N/A	N/A	非特定品牌
循环水浴锅	MS Lauda	N/A	该型号已停产
棉签	N/A	N/A	非特定品牌
精细手术剪；直型；尖-尖；30 mm 刀片长度；4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 镊子	精细科学工具公司	11251-35
Dumont #7 - 精细镊子	精细科学工具公司	11274-20
止血钳	精细科学工具公司	13015-14
肝素钠注射液 1000 单位/mL	RX Generics	71288-0402-02
异氟烷	Patterson Veterinary	14043-0704-06
盐酸利多卡因 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
膜式薄层氧合器	Radnoti	N/A
梅岑鲍姆剪；弯型；钝头；27 mm 刀片长度；5 "	Roboz	RS-6013
氧气测定系统	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
0.9% 生理盐水溶液	N/A	N/A	生理盐水在实验室配制
天平	N/A	N/A	非特定品牌
可调速模拟控制台泵系统	Cole Palmer	N/A	型号根据应用定制
称量舟	N/A	N/A	非特定品牌