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方法文章

检测 疟原虫 子孢子在 按蚊属 利用酶联免疫吸附测定法检测蚊子

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DOI：

10.3791/63158

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2021年9月30日

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1Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 2Department of Molecular Tropical Medicine & Genetics, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 3Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 4Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于检测蚊虫唾液腺子孢子的夹心酶联免疫吸附测定法。该方法利用易于获取的单克隆抗体，可实现对携带恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）或间日疟原虫（Plasmodium vivax）的蚊虫进行经济、高通量的检测。该方法适用于疟疾传播相关研究，包括媒介蚊种调查。

摘要

疟原虫（Plasmodium）子孢子是感染人类的疟疾寄生虫的感染阶段。雌性按蚊（Anopheles）唾液腺中寄居的子孢子通过蚊虫吸血时的叮咬传播给人类。因此，蚊虫唾液腺中是否存在子孢子即决定了蚊虫是否具有传染性。为了确定某只按蚊是否携带疟原虫子孢子，酶联免疫吸附测定法（ELISA）一直是检测子孢子主要表面蛋白——疟原虫环子孢子蛋白（CSP）的标准工具。该方法将每只蚊虫的头胸部与腹部分离，对头胸部进行匀浆处理，随后采用夹心ELISA法检测是否存在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）特异性的CSP，以及间日疟原虫（Plasmodium vivax）的两种亚型VK210和VK247的CSP。该方法已被广泛用于疟疾传播的研究，包括蚊虫感染的季节性动态以及研究地区主要疟疾传播媒介的种类分析。

引言

Plasmodium 子孢子是疟原虫在蚊子体内的感染阶段。子孢子通过蚊虫叮咬传播给人类。在蚊子体内，子孢子首先在中肠壁的卵囊内形成。成熟后，它们被释放到血腔中，并迁移至蚊子的唾液腺。在此处进一步成熟，准备在蚊子吸血时传播给人类。在人体内，子孢子被注入皮肤真皮层，随后进入血管，随血液循环到达肝脏，侵入肝细胞并建立感染1,2。

目前已采用三种不同的方法来检测蚊虫唾液腺中的子孢子感染情况。第一种方法是解剖蚊虫唾液腺，随后在光学显微镜下直接观察子孢子。该方法是检测和定量Anopheles蚊虫唾液腺中子孢子的金标准3。然而，该方法需要技术人员熟练掌握解剖和显微镜检查技术。此外，该方法无法用于鉴定Plasmodium物种以及P. vivax的CSP亚型4,5。第二种方法采用聚合酶链式反应（PCR）检测蚊虫上半部分体段中的Plasmodium DNA6。由于PCR具有高度特异性，因此可实现寄生虫的物种鉴定和亚型分型7,8,9,10。尽管PCR应用日益广泛，但其需要相对昂贵的设备和经过良好培训的技术人员。第三种方法是酶联免疫吸附测定（ELISA），用于检测Plasmodium特异性的环子孢子蛋白（CSP），该方法已沿用三十年11,12,13。CSP存在于卵囊子孢子和唾液腺子孢子中12,14。利用特异性抗体，该方法可实现Plasmodium物种的鉴定以及P. vivax子孢子的CSP亚型分型。该检测方法的设计初衷是需要一种操作简便、通量高的检测手段，以对大量野外捕获的蚊虫进行检测，从而了解疟疾传播情况（即确定子孢子感染率）。

与显微镜检查相比，ELISA 方法具有两个主要优势。首先，它允许研究人员保存蚊虫样本，直至准备进行样本处理。其次，ELISA 方法可通过物种特异性的单克隆抗体来区分Plasmodium物种。此外，ELISA 可同时处理更多的蚊虫标本，从而实现更高的通量15。与可检测子孢子DNA的PCR方法相比，ELISA 操作耗时较长，但成本更低16。本文所述的ELISA检测方法旨在测定蚊虫的感染性，并分别检测P. falciparum的CSP以及P. vivax的两种CSP变异型VK210和VK247。该ELISA方法已被广泛应用于多项研究中，用于确定蚊虫感染的季节性动态，并鉴定野外主要疟疾传播媒介的种类12,13,17,18。实施本检测仅需配备ELISA酶标仪的标准实验室即可。

整体实验流程如图1所示。在该夹心ELISA中，首先使用针对每种Plasmodium物种/亚型特异性的第一抗体（捕获）单克隆抗体（mAb）包被ELISA板。每块板仅包被一种捕获mAb。该mAb的功能是捕获蚊虫匀浆液中相应的CSP抗原。在完成抗原捕获及洗板步骤后，加入第二种标记有辣根过氧化物酶的CSP特异性抗体，用于检测与捕获mAb结合的CSP是否存在。辣根过氧化物酶催化的化学反应可使含有CSP的孔中产生显色反应。

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方案

1. 试剂的准备

注意：有关本实验方案中所用仪器、试剂及其他耗材的列表，请参见材料表；有关溶液及其成分的列表，请参见表1。

  1. 捕获抗体和辣根过氧化物酶偶联的单克隆抗体
    1. 为重悬单克隆抗体（mAb），将冻干的 mAb 溶解于蒸馏水与甘油按 1:1 比例配制的溶液中，终浓度为 0.5 mg/mL。根据需要分装，避免反复冻融，并于 -20 °C 保存。
  2. 封闭缓冲液（BB）
    1. 通过将 5 g ELISA 级酪蛋白溶解于 100 mL 0.1 N NaOH 中来配制封闭缓冲液。加入 900 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）（见表 1），使最终体积达到 1.0 L。
    2. 加入 0.02 g 酚红作为指示剂，并用 HCl 调节 pH 至 7.4。封闭缓冲液可在 4 °C 下保存最多一周，或分装为 50 mL 份量，于 -20 °C 长期保存。
  3. 阳性对照
    1. 为重悬阳性对照，向冻干蛋白中加入 1,000 μL 封闭缓冲液（BB）进行复溶。根据需要将储备液分装，并于 -20 °C 保存。
    2. 进行系列稀释时，将每种阳性对照进一步用封闭缓冲液（BB）稀释至以下终工作浓度：Pf，2 pg/µL；Pv (VK210)，182 pg/µL；Pv (VK247)，89 pg/µL。
      ​注意：阳性对照的实际浓度可能因批次不同而有所差异。请参考产品信息表以确定准确浓度。从上述工作浓度开始，阳性对照的系列稀释浓度分别为：Pf 为 2、1、0.5、0.25、0.13、0.06 pg/μL；PV210 为 182、91、46、23、11、5.7 pg/μL；PV247 为 89、45、22、11、5.6、2.8 pg/μL。
  4. 阴性对照
    注意：理想的阴性对照是与待测样本相同方式制备的雌性按蚊头胸部匀浆液。然而，封闭缓冲液（BB）也可用作阴性对照。
    1. 若使用封闭缓冲液（BB）作为阴性对照，则应采用 2 倍吸光度阈值以获得可靠的阳性读数。

2. 蚊虫样品制备

  1. 使用无菌剃须刀片将每只采集的成蚊的头部和胸部与腹部分离。将头部和胸部放入预先标记好的1.5 mL离心研磨管中。如需要，可将最多10只蚊虫的头部和胸部混合于同一管中。
    注意：在样本制备过程中，通常需解剖感染蚊虫的唾液腺，并用于CS-ELISA检测。然而，采集的蚊虫头部和胸部也可直接用于CS-ELISA检测（无需单独解剖唾液腺）12,13,19。
  2. 向每根试管中加入50 μL研磨缓冲液（GB），并用洁净的研杵（用肥皂清洗过）充分匀浆样本。再用250 μL GB冲洗使用过的研杵，并将冲洗液全部转移至含有匀浆后蚊虫样本的试管中，最终体积约为300 μL。
  3. 将样本保存在冷冻箱（-20 °C）中待用，或立即进行ELISA检测。

3. 孢子体ELISA

  1. 填写子孢子ELISA工作表（参见补充材料1）。每种CSP（Pf、Pv-210或Pv-247）准备一块ELISA板。
  2. 通过将抗体溶解于PBS中制备捕获单克隆抗体工作液：Pf为4 µg/mL；Pv-210为2 µg/mL；Pv-247为2 µg/mL。根据每块板加入5 mL计算所需体积。轻轻涡旋混匀溶液。
  3. 从步骤3.2中吸取每种工作用单抗溶液50 μL，加入ELISA板的每个孔中。用塑料盖盖好板，室温孵育30分钟或过夜。
  4. 吸去孔内液体，并将板倒置在纸巾上轻拍至少5次，以彻底去除残留液体。
    注意：若无吸液系统（连接洁净吸头的多通道真空抽吸装置），可将抗体倒入水槽后，再将板倒置在纸巾上轻拍。
  5. 每孔加入200 μL阻断缓冲液（BB），填满所有孔。用塑料盖盖好板，室温孵育1小时。吸去或倾倒孔内液体，将板倒置在纸巾上轻拍5次，彻底去除液体。
  6. 按以下步骤在板上加载蚊虫匀浆样本和对照：
    1. 向H1和H2孔各加入50 μL阳性对照。
    2. 从C行至G行，向第1列和第2列的所有孔中加入50 μL BB。然后向G1和G2孔各加入50 μL阳性对照。从G1和G2开始，依次进行系列稀释，经F1和F2，直至C1和C2。
      注意：所有阳性对照孔最终应含有50 μL液体。
    3. 向A1、A2、B1和B2孔各加入50 μL BB（阴性对照）。
    4. 向“未知”（Unk）孔中各加入50 μL匀浆样本。
    5. 盖好板，室温孵育2小时。
  7. 约2小时后，开始准备底物。对于ABTS双组分底物试剂盒，将底物A与底物B按1:1比例混合。
    注意：完整一块96孔板需要5 mL底物A和5 mL底物B。
  8. 通过向复溶的偶联单抗中加入BB，制备Pf、Pv-210和Pv-247的辣根过氧化物酶标记单抗工作液，使其工作浓度为1 µg/mL。
    1. 根据每块板加入5 mL工作用偶联单抗溶液计算所需体积。
    2. 取5 μL步骤3.8制备的辣根过氧化物酶标记单抗，与100 μL步骤3.7制备的底物溶液在单独的1.5 mL离心管中混合，轻轻涡旋混匀。
      注意：应迅速出现由无色变为绿色的颜色变化，表明辣根过氧化物酶与底物反应正常。
  9. 吸去或倾倒孔内液体，将板倒置在纸巾上轻拍5次，彻底去除液体。
  10. 用200 μL PBS-Tween洗涤各孔两次，每次吸去孔内液体后，将板轻拍5次。
  11. 向每孔加入50 μL步骤3.8制备的辣根过氧化物酶标记单抗。盖好板，室温避光孵育1小时。吸去或倾倒孔内液体，将板倒置在纸巾上轻拍5次。
  12. 用200 μL PBS-Tween洗涤各孔三次，每次吸去孔内液体后，将板轻拍5次。
  13. 向每孔加入100 μL步骤3.7制备的底物溶液。盖好板，室温避光孵育30分钟。
  14. 孵育30分钟后，使用ELISA酶标仪在405–414 nm波长下读取吸光度。
    ​注意：请遵循所用ELISA酶标仪的具体操作说明。有关本实验方案所用软件的操作细节，请参见补充材料S2。阳性对照孔应出现明显的由无色变为绿色的颜色变化。

4. 分析

  1. 检测阳性样本。
    1. 将吸光度值高于临界值（阴性样本平均吸光度值的两倍）的样本标记为阳性。
  2. 定量 CSP
    1. 使用对照稀释系列构建的标准曲线，估算样本中 CSP 的浓度，步骤如下。
      1. 通过将系列稀释对照的吸光度值（y 轴）对其浓度（x 轴）作图，绘制标准曲线。
      2. 进行线性回归分析，采用 y = A + Bx 确定最佳拟合直线，其中 A 和 B 为自由参数。
      3. 根据给定的吸光度值，通过求解方程确定每个阳性样本的 CSP 浓度。

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结果

典型的ELISA结果如图2所示。在本实验中，P. falciparum ELISA检测到A7孔中的子孢子感染。通过微弱的绿色可肉眼识别阳性孔（图2A）。该孔的吸光度值高于临界阈值（四个阴性对照孔平均值的两倍）（图2B）。所有80个未知样本孔的吸光度值分布如图2C所示。通过板内标准曲线对背景（阴性对照）进行校正后，A7孔的CSP定量结果显示CSP浓度为0.35 pg/μL（图2D）。该样本集的P. vivax VK210和VK247检测结果均为阴性（数据未显示），表明A7孔中的子孢子感染为单一物种的P. falciparum。

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讨论

CSP-ELISA 是一种高特异性和经济有效的方法，用于检测疟原虫的 CSP。该方法能够区分恶性疟原虫和间日疟原虫子孢子，以及间日疟原虫的两个亚型 VK210 和 VK24711,13,14,15。为获得可靠且可重复的结果，需注意若干关键步骤。所有溶液应在冰箱中保存不超过 1 周，以防止微生物生长。单克隆抗体应保存在含 50% 甘油的稀释液中，并根据需要分装，避免反复冻融。阳性对照应分装为单次使用量。ELISA 板在孵育期间应盖上盖子，防止蒸发。涉及辣根过氧化物酶标记单克隆抗体的孵育步骤应在避光条件下进行。

所有涉及溶液更换的步骤均应迅速完成，以防止干燥导致背景过高。工作用底物溶液应使用铝箔包裹避光保存，并在配制后立即加入到板中。处理冻存的蚊虫匀浆样本时，应...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢MVRU的Kirakorn Kiatibutr先生提供的培训与指导。同时感谢MVRU的Pinyapat Kongngen女士在制备图2过程中提供的技术支持。本研究工作由美国国家过敏与传染病研究所和美国国立卫生研究院（U19 AI089672）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
ELISA酶标仪BioTek Instrument, Inc.Synergy H1使用紫外-可见光吸收检测模式测量吸光度
研磨杵AxygenPES-15-B-SI用于匀浆蚊虫头部/胸部组织
试剂
ABTS双组分底物KPL50-62-00用于过氧化物酶驱动的检测
封闭缓冲液（BB）注：溶液
捕获抗体及过氧化物酶标记的单克隆抗体（mAbs）注：mAbs可从BEI资源库（https://www.beiresources.org）获取，以冻干粉形式提供，包含于子孢子ELISA试剂盒中（恶性疟原虫用MRA-890，间日疟原虫用MRA-1028K）
酪蛋白Sigma aldrich9000-71-9用于配制封闭缓冲液
研磨缓冲液（GB）注：溶液
Igepal CA-630Sigma aldrich9002-93-1用于配制研磨缓冲液
KClSigma aldrich7447-40-7用于配制磷酸盐缓冲液（PBS）
KH2PO4Sigma aldrich7778-77-0用于配制磷酸盐缓冲液（PBS）
Na2HPO4Sigma aldrich7558-79-4用于配制磷酸盐缓冲液（PBS）
NaClSigma aldrich7647-14-5用于配制磷酸盐缓冲液（PBS）
NaOHSigma aldrich1310-73-2用于配制封闭缓冲液
PBS-Tween
Pf 捕获单抗CDCPf-CAP用于捕获恶性疟原虫环子孢子蛋白
Pf 过氧化物酶标记单抗CDCPf-HRP用于检测恶性疟原虫环子孢子蛋白
Pf 阳性对照CDCPf-PC恶性疟原虫阳性对照
酚红Sigma aldrich143-74-8用于配制封闭缓冲液
磷酸盐缓冲液（PBS）注：溶液
阳性对照注：溶液
Pv210 捕获单抗CDCPv210-CAP用于捕获间日疟原虫Pv210型环子孢子蛋白
Pv210 过氧化物酶标记单抗CDCPv210-HRP用于检测间日疟原虫Pv210型环子孢子蛋白
Pv210 阳性对照CDCPv210-PC间日疟原虫Pv210型阳性对照
Pv247 捕获单抗CDCPv247-CAP用于捕获间日疟原虫Pv247型环子孢子蛋白
Pv247 过氧化物酶标记单抗CDCPv247-HRP用于检测间日疟原虫Pv247型环子孢子蛋白
Pv247 阳性对照CDCPv247-PC间日疟原虫Pv247型阳性对照
Tween20Sigma aldrich9005-64-5用于配制PBS-Tween
耗材
一次性移液槽通用用于工作试剂
ELISA板：96孔透明圆底聚苯乙烯板Corning Life Science2797用于ELISA实验
手套：一次性手套和冷冻手套通用用于个人防护
实验服通用用于个人防护
多通道移液器 P30-300通用用于溶液转移
移液器套装：P2、P20、P200 和 P1000通用用于溶液转移
移液器吸头：10 µL、200 µL 和 1000 µL通用用于溶液转移
血清移液管：5 mL、10 mL通用用于溶液转移
转移移液管通用用于溶液转移

参考文献

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