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方法文章

人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化

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DOI：

10.3791/63162

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2022年4月6日

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了从人血液样本中获取单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）的工作流程，一种在不损害细胞活力和行为的前提下，将炎症性半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）报告系统高效导入人MDM的简便方法，以及一种基于成像的技术，用于在活细胞中检测炎症性半胱天冬酶的激活。

摘要

炎症性胱天蛋白酶包括caspase-1、-4、-5、-11和-12，属于起始型胱天蛋白酶的亚类。caspase-1对于炎症信号通路的正确调控至关重要，其通过被招募至炎性小体后发生邻近诱导的二聚化而被激活。caspase-1在单核细胞谱系中含量丰富，可诱导促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-18前体成熟为具有活性并可分泌的分子形式。其他炎症性胱天蛋白酶caspase-4和-5（及其小鼠同源物caspase-11）则通过诱导细胞焦亡促进IL-1β的释放。胱天蛋白酶双分子荧光互补（BiFC）是一种用于检测炎症性胱天蛋白酶因邻近作用而激活的实验工具。该方法将含有可与炎性小体结合区域的caspase-1、-4或-5前结构域，分别与黄色荧光蛋白Venus的非荧光片段（Venus-N [VN] 或 Venus-C [VC]）融合；当胱天蛋白酶发生诱导性邻近时，这些片段可重新结合并恢复形成具有荧光的Venus复合物。本实验方案描述了如何通过核转染技术将上述报告系统导入人原代单核细胞来源的巨噬细胞（MDM），随后对细胞进行处理以诱导炎症性胱天蛋白酶的激活，并利用荧光和共聚焦显微镜检测胱天蛋白酶的激活情况。该方法的优势在于可用于在活细胞中鉴定炎症性胱天蛋白酶激活复合物的组成成分、必要条件及其亚细胞定位。然而，需设置严谨的对照，以避免影响细胞活力和正常行为。该技术是研究炎性小体水平上动态胱天蛋白酶相互作用，以及分析来源于人血液样本的活MDM和单核细胞中炎症信号级联反应的有力工具。

引言

半胱天冬酶（caspase）是一类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，可分为起始型半胱天冬酶（initiator caspase）和效应型半胱天冬酶（executioner caspase）。效应型半胱天冬酶包括caspase-3、-6和-7，它们在细胞中天然以二聚体形式存在，并由起始型半胱天冬酶切割活化，从而执行细胞凋亡过程1。起始型半胱天冬酶包括人源的caspase-1、-2、-4、-5、-8、-9、-10和-12，它们以无活性的酶原形式（前体caspase）存在，通过邻近诱导的二聚化被激活，并经自蛋白水解切割而稳定2,3。炎症性半胱天冬酶是起始型半胱天冬酶的一个亚群2，在人类中包括caspase-1、-4、-5和-12，在小鼠中包括caspase-1、-11和-124,5。这类酶不参与细胞凋亡，而是在炎症反应中发挥核心作用，介导前体白细胞介素（pro-interleukin, pro-IL）-1β和pro-IL-18的蛋白水解加工及其分泌6,7，而IL-1β和IL-18是机体在病原体入侵后最早释放的细胞因子8,9。caspase-1在其活化平台——一种高分子量蛋白复合物，称为炎性小体（inflammasome）——的招募下被激活（图1A）10。caspase-4、-5和-11的二聚化则不依赖此类平台，而是通过非经典炎性小体通路实现11,12。

经典炎性小体是由炎性小体感受器蛋白、接头蛋白ASC（含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白）和效应蛋白caspase-1组成的细胞质多聚体蛋白复合物10。目前研究最为深入的经典炎性小体包括含吡啶结构域的NOD样受体家族（NLRP）成员NLRP1和NLRP3、含CARD结构域的NLR家族成员NLRC4，以及黑色素瘤缺失蛋白2（AIM2）。这些蛋白各自含有吡啶结构域、CARD结构域，或同时含有这两种结构域。CARD结构域介导含CARD的caspase与其上游激活因子之间的相互作用。因此，支架分子ASC（其由N端的吡啶结构域（PYD）和C端的CARD基序组成）13,14对于将caspase-1招募至NLRP110、NLRP315和AIM216炎性小体是必需的。

每种炎性小体均以其独特的传感器蛋白命名，该蛋白可识别不同的促炎刺激（图1B）。该通路的激活物被称为经典刺激。炎性小体作为微生物组分和组织应激的感应器，通过激活炎症性caspase来组装并触发强烈的炎症反应17。炎性小体的组装启动caspase-1的活化，进而介导其主要底物pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟与分泌。该过程通过两步机制实现：第一步，启动刺激通过激活NF-κB通路，上调某些炎性小体蛋白及pro-IL-1β的表达；第二步，细胞内（经典）刺激诱导炎性小体组装并募集前体caspase-16,7。

Caspase-4 和 caspase-5 是小鼠 caspase-11 的人源同源物11。它们可通过细胞内脂多糖（LPS）以炎性小体非依赖的方式被激活，LPS 是革兰氏阴性菌外膜中存在的一种分子18,19,20，也可被红细胞溶血产物——细胞外血红素激活21。有研究提出，LPS 可直接结合这些蛋白的 CARD 结构域，从而诱导其发生寡聚化20。Caspase-4 或 caspase-5 的激活可通过切割成孔蛋白 gasdermin D（GSDMD）诱导一种称为焦亡的炎症性细胞死亡形式，进而促进 IL-1β 的释放18,19。此外，由 caspase-4 和 GSDMD 介导的焦亡所导致的钾离子外流可诱导 NLRP3 炎性小体的活化，进而激活 caspase-122,23。因此，caspase-4、-5 和 -11 被认为是能够响应特定刺激而诱导焦亡及 caspase-1 激活的细胞内 LPS 传感器11,24。

Caspase 双分子荧光互补，炎症小体受体，蛋白质相互作用示意图。
图 1：炎症性caspase及caspase双分子荧光互补（BiFC）检测。（A）示意图显示caspase-BiFC系统，其中两个与Venus非荧光片段（Venus-C或Venus-N）相连的caspase-1前结构域（C1-pro）被招募至NLRP3活化平台，促使Venus重新折叠并发出荧光。该复合物在显微镜下呈现为绿色斑点，可作为炎症性caspase诱导的蛋白接近性的读出信号，此为起始caspase活化的第一步。（B）炎症小体组分及炎症性caspase的结构域组成示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

检测特定起始型caspase的活化较为困难，目前可用于成像方法检测的手段较少。半分子荧光互补（Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）技术可用于在活细胞中直接观察炎症性caspase的活化过程（图1A）25。该技术最近已被应用于人单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）中21。Caspase BiFC技术可检测炎症性caspase活化的第一步，即诱导接近以促进二聚化。该方法利用表达质粒，编码含有CARD结构域的caspase前体结构域，并分别与光稳定性黄色荧光蛋白Venus的非荧光片段（Venus-C [VC] 和 Venus-N [VN]）融合。当两个caspase前体结构域被招募至其活化平台或发生诱导性接近时，Venus蛋白的两个片段将被带至彼此邻近的位置，被迫重新折叠并产生荧光（见图1A、B）。该方法可实时报告特定炎症性caspase的活化状态。

人源MDM高表达炎性小体相关基因和能够识别危险信号及病原体产物的模式识别受体，因此是研究炎性caspase通路的理想细胞类型。此外，MDM可来源于外周血，甚至可从患者样本中分离获得，从而用于评估特定疾病状态下炎性caspase的激活情况。本实验方案详细描述了如何通过核转染（一种基于电穿孔的转染方法）将BiFC caspase报告系统导入MDM，如何处理细胞以诱导炎性caspase的激活，以及如何利用显微镜技术对活化的caspase复合物进行可视化观察。此外，该方法还可进一步拓展，用于分析这些高度有序结构的分子组成、亚细胞定位、动力学特征及其大小25,26,27。

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方案

本方案遵循贝勒医学院人类研究伦理委员会关于人源样本操作的指导原则。血液样本的处理符合机构规定的人源样本安全指南。血液样本取自地区血库，采集时使用柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖（CPD）溶液抗凝。然而，使用其他抗凝剂（如肝素钠、肝素锂或EDTA）采集的血液也可用于本方案28,29。

1. 人单核细胞的分离及向巨噬细胞的分化

  1. 从地区血库获取匿名健康个体的抗凝血，并按以下说明分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
    注意：所有步骤均需在组织培养用层流罩内进行。仅使用无菌离心管并佩戴手套。处理与血液相关的产物时，应加入10%漂白剂。无菌PBS（1x）或不含Ca2+和Mg2+的DPBS可互换使用。
    1. 配制稀释缓冲液：在1x无菌PBS中添加2%胎牛血清（FBS）和0.5 mM EDTA。
    2. 配制培养基：在RPMI-1640培养基中添加FBS（10% (v/v)）、谷氨酰胺（Glutamax，2 mM）和青霉素/链霉素（50 I.U./50 µg/mL）。
    3. 根据制造商说明书预冷运行缓冲液（材料表）。
    4. 用两倍体积的稀释缓冲液稀释全血。使用移液管将15 mL抗凝血转移至含有30 mL稀释缓冲液的50 mL离心管中，轻轻颠倒混匀。
    5. 每10 mL全血或30 mL稀释后的血液，向一个空的50 mL离心管中加入15 mL密度梯度介质。
    6. 使用25 mL移液管，缓慢而稳定地将步骤1.1.5中的密度梯度介质上覆盖30 mL稀释后的血液。保持移液管尖端紧贴管壁，并将离心管倾斜放置。
    7. 小心将离心管转移至水平转子离心机中，避免扰动两相界面。在室温（RT）下以400 x g离心25分钟，加速度和减速度均设为最小值。
    8. 使用10 mL移液管小心吸除上层透明血浆层，并将其弃入含10%漂白剂的容器中。
    9. 使用10 mL移液管收集中间相白色外周血单个核细胞（PBMCs，图2）层，并转移至新的50 mL离心管中。将同一供体不同离心管中的白色层合并至一个50 mL离心管中，总体积不超过30 mL。
    10. 用步骤1.1.1中的稀释缓冲液将每管体积补至50 mL，在4 °C下以300 x g离心10分钟。使用10 mL移液管吸除上清液，并将其弃入含10%漂白剂的容器中。
    11. 使用P1000微量移液器将每个细胞沉淀重悬于1 mL步骤1.1.3中预冷的运行缓冲液中。将同一供体的细胞悬液合并至一个新的15 mL离心管中，用预冷的运行缓冲液补至15 mL总体积，并轻轻颠倒混匀。
    12. 取步骤1.1.11中细胞悬液20 µL，用1x无菌PBS进行1:100稀释。使用血细胞计数板测定细胞数量。
    13. 将步骤1.1.11中的细胞悬液在4 °C下以300 x g离心10分钟，使用10 mL移液管吸除上清液。如有必要，使用P200微量移液器彻底去除残留上清。
    14. 每1 x 107个细胞使用80 µL预冷的MACS运行缓冲液重悬分离得到的PBMCs，最多使用800 µL缓冲液。
    15. 每1 x 107个细胞加入20 µL抗人CD14微珠（MicroBeads），或每份血液样本（约100 mL未稀释血液）最多加入100 µL。轻轻颠倒混匀后，置于4 °C旋转仪上持续旋转孵育20分钟。
    16. 从旋转仪上取下样本，每管加入10 mL预冷的运行缓冲液，在4 °C下以300 x g（加速度=5，减速度=5）离心10分钟。
    17. 使用10 mL移液管吸除上清液，并将最多1 x 108个细胞重悬于500 µL预冷的运行缓冲液中（浓度为2 x 108/mL）。
    18. 按照制造商说明书，使用手动或自动系统（材料表）通过磁性细胞分选法分离CD14阳性细胞。
    19. 在完成CD14阳性细胞筛选后，取步骤1.1.18中的细胞悬液20 µL，用1x无菌PBS进行1:100稀释。通过血细胞计数板计数确定细胞数量。
    20. 将CD14阳性细胞在室温下以300 x g离心10分钟，使用10 mL移液管或真空系统吸除上清液。
    21. 将步骤1.1.20所得细胞沉淀用步骤1.1.2中预热的培养基重悬，调整终浓度为1 x 107个细胞/mL。
  2. 以5 x 106个细胞的密度接种分离得到的CD14阳性单核细胞。
    1. 在10 cm组织培养皿中加入10 mL步骤1.1.2中的培养基，并补充50 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。
    2. 将步骤1.1.21中的细胞悬液0.5 mL逐滴加入培养基中，轻轻摇晃培养皿混匀。将细胞置于加湿的组织培养孵箱中（37 °C，5% CO2）过夜培养。
    3. 次日，使用真空系统吸除培养基，去除未贴壁的细胞。加入10 mL新鲜培养基并补充GM-CSF（50 ng/mL），在加湿的组织培养孵箱中（37 °C，5% CO2）继续培养7天，以完成完全分化（参见图3A了解GM-CSF条件下CD14+单核细胞在不同分化阶段的形态）。每2–3天更换一次培养基，并每次补充新鲜GM-CSF（50 ng/mL）。

CD14+ 单核细胞的分离与分化；核转染过程；荧光成像。
图 2：实验流程示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 电穿孔组分的制备

注意：本方案适用于 10 µL Neon 尖端（材料表）。每次转染使用 1-2 × 105 个细胞。建议将转染后的细胞接种于 48 孔板或 8 孔培养板（每孔加入 10 µL 转染细胞）。可使用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 1× 无菌 DPBS 代替 PBS。

  1. 第7天，通过在RPMI-1640培养基中添加FBS（10% (v/v)）和GlutaMAX（2 mM），制备无抗生素培养基。
  2. 将无血清RPMI-1640培养基、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）溶液、1×无菌PBS（不含Ca2+和Mg2+）以及步骤1.1.2中的完全培养基置于37 °C水浴中预热。
  3. 若使用底部为玻璃的培养皿（用于共聚焦显微镜观察），需用聚-D-赖氨酸氢溴化物对培养皿进行包被。
    1. 向8孔培养板的每个孔中加入200 µL聚-D-赖氨酸氢溴化物溶液（0.1 mg/mL溶于1×无菌PBS），室温孵育5分钟。
    2. 吸除聚-D-赖氨酸溶液，用1×无菌PBS洗涤玻璃表面一次，吸除PBS后进行步骤2.4。
  4. 向48孔板或8孔培养板的每孔中加入200 µL无抗生素培养基，在湿润的组织培养箱（37 °C，5% CO2）中预孵育，直至准备接种转染后的细胞。

3. 电穿孔细胞的制备

注意：在7天分化期结束时，从一个10 cm培养皿中获得的单核细胞来源巨噬细胞（MDM）产量约为1.5 × 106 个细胞。可使用不含Ca2+和Mg2+的1×无菌DPBS替代PBS。本方案已优化，可在维持细胞活力和完整性的前提下使大多数巨噬细胞从培养板上脱落。MDM难以从细胞培养板上脱离，因此可能需要重复步骤3.2和3.3两次以充分解离细胞。确保每次使用0.25%胰蛋白酶-EDTA的孵育时间不超过5分钟。

  1. 从10 cm培养皿中完全分化的巨噬细胞中吸除培养基，并用预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞单层。确保彻底去除培养基。
  2. 每10 cm培养皿加入2 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于湿润的组织培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育5分钟，以收获细胞。
  3. 使用p1000移液器将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液在培养皿表面轻柔吹打数次，使细胞完全脱落。将细胞悬液转移至含有5 mL步骤1.1.2中预热的完全培养基的15 mL锥形管中。
  4. 将培养皿置于明场显微镜下，观察多个视野中的细胞脱落情况。若仍有大量细胞附着，重复步骤3.2–3.3。
  5. 在室温下以250 × g离心5分钟，收集细胞。
  6. 吸除上清液，将细胞重悬于10 mL预热至37 °C的1×无菌PBS中。取20 µL细胞悬液，使用血细胞计数板测定细胞数量。
  7. 按每组转染所需取1–2 × 105个细胞，置于15 mL离心管中，用预热的1×无菌PBS补至终体积15 mL。在室温下以250 × g离心5分钟。
  8. 吸除PBS后，再以250 × g短暂离心1分钟。使用p200移液器彻底去除细胞沉淀中的残留PBS。

4. 将半胱天冬酶 BiFC 组分转染至人单核细胞来源的巨噬细胞

注意：本实验步骤使用 Neon 转染系统（材料表）。本方案描述了使用 10 µL Neon 尖端（材料表）转染 1-2 × 105 个细胞的操作步骤。若使用 100 µL Neon 尖端，请相应放大试剂用量。避免细胞在重悬缓冲液 R 中暴露超过 15 分钟，否则可能导致细胞活力和转染效率下降。

  1. 将报告质粒（例如 mCherry 或 dsRedmito，浓度为 100 ng/µL）用无核酸酶水或 0.5x TE 缓冲液稀释，以便观察转染的细胞。
  2. 将半胱天冬酶 BiFC 质粒用无核酸酶水或 0.5x TE 缓冲液稀释至适当浓度，使质粒总体积不超过总转染体积（10 µL）的 30%（例如，C1 Pro-VC 为 300 ng/µL，C1 Pro-VN 为 300 ng/µL）。
  3. 为每次预期的转染准备一支 1.5 mL 无菌微量离心管，加入适量的报告质粒（例如 50 ng 或 0.5 µL）和半胱天冬酶 BiFC 质粒（例如 C1 Pro-VC 300 ng 或 1 µL，C1 Pro-VN 片段 300 ng 或 1 µL）。始终将微量离心管置于生物安全柜中。
  4. 将移液工作站、设备、枪头、电穿孔管和移液器放置于无菌超净工作台内。
    注意：移液工作站、设备、枪头、电穿孔管和移液器均包含在 Neon 转染系统中。
  5. 根据制造商说明，将移液工作站上的高压和传感器连接器连接至设备背面的接口。将移液工作站放置在设备附近。
  6. 将电源线连接至设备背面的交流电源输入口，并将设备接入电源插座。按下电源开关以开启设备。
  7. 在设备开启并正确连接后，于启动界面输入转染参数。点击 电压，输入 1000，然后点击 完成，将电压设为 1000 V。点击 脉宽，输入 40，然后点击 完成，将脉冲持续时间设为 40 ms。最后点击 脉冲次数，输入 2，然后点击 完成，将电脉冲次数设为 2 次。
  8. 取一支试剂盒中提供的电穿孔管，在室温下加入 3 mL 电解缓冲液 E（适用于 10 µL 枪头，试剂盒中提供）。将电穿孔管插入移液工作站的枪管架中。确保管壁上的电极朝向内侧，并在插入时听到“咔哒”声。
  9. 取步骤 3.8 中获得的细胞沉淀，每 1–2 × 105 个细胞加入 10 µL 预热的重悬缓冲液 R（试剂盒中提供）。用 p20 微量移液器轻轻混匀。将 10 µL 细胞悬液加入步骤 4.3 中准备好的每支电穿孔管中，并用 p20 微量移液器轻轻混匀。
  10. 取移液器，通过按下 Push 按钮至第二档位安装枪头。确保夹具完全夹住枪头内活塞的安装杆，且移液器顶部无间隙。
  11. 吸取样品时，将移液器上的 Push 按钮按至第一档位，插入装有细胞/质粒 DNA 混合物的第一支管中。缓慢将混合物吸入移液器枪头。
    注意：避免产生气泡，因为气泡可能在电穿孔过程中引起电弧放电；若设备检测到气泡，可能阻止电脉冲的传递。若观察到气泡，应将内容物排回管中，并重新吸取。
  12. 将含有样品的移液器非常小心地插入枪管架中。确保移液器卡入到位并正确放置。
  13. 在触摸屏上按下 开始，等待电脉冲完成传递。屏幕上的提示信息将显示操作完成。
  14. 缓慢将移液器从工作站中取出，并立即通过缓慢按下 Push 按钮至第一档位，将转染后的细胞悬液加入对应孔中，孔内已含有步骤 2.4 中预热的无抗生素培养基。
    注意：该枪头可针对同一种质粒重复使用最多三次；否则，应通过按下 Push 按钮至第二档位，将枪头丢弃至生物危害废物容器中。
  15. 对每支含有细胞/质粒 DNA 混合物的电穿孔管重复执行步骤 4.10–4.14。
  16. 轻轻摇动培养板，使转染细胞均匀分布，并在加湿的组织培养孵育箱（37 °C，5% CO2）中孵育 1–3 小时。
  17. 向每孔中加入 200 µL 步骤 1.1.2 中预热的培养基（完全培养基）。再次将培养皿放入加湿的组织培养孵育箱（37 °C，5% CO2）中。让细胞至少表达基因 24 小时。
  18. 次日，使用落射荧光显微镜检查细胞活力和转染效率。
    1. 根据制造商说明，打开落射荧光显微镜和荧光光源箱，将培养皿放置在显微镜载物台上。
    2. 选择 10x 或 20x 物镜以及 568 nm（RFP）滤光片。
    3. 为评估细胞活力，按下 透射光 LED（TL） 按钮，以观察所选视野中的所有细胞。通过显微镜目镜观察时，调节焦距旋钮直至细胞清晰可见，并检查所选视野中细胞的贴壁情况。
      注意：完全贴壁的细胞代表活细胞，而悬浮的细胞代表非活细胞。若孔内细胞汇合度较高，出现未贴壁细胞可能是由于细胞数量估算过高，而非细胞活力低下所致。然而，若细胞汇合度较低且悬浮细胞比例较高，则表明细胞活力低下，可能由电穿孔过程中的电弧放电、质粒毒性或重悬缓冲液 R 过度暴露引起。不应使用表现出后一种情况的孔。
    4. 为评估转染效率，如上所述在透射光下对所选视野中的细胞进行聚焦。计数所选视野中的总细胞数。关闭 透射光 LED（TL） 开关，按下 反射光 LED 按钮（RL） 开启荧光照明。
    5. 精细调节焦距以观察报告基因的荧光信号（红色细胞），并计数红色荧光细胞的总数。对每孔至少再重复步骤（4.18.4–4.18.5）两次。

5. 转染MDM的处理及caspase BiFC数据采集

注意：如果计划使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对细胞进行成像，建议在给予选定刺激物之前，先用 qVD-OPh（20 µM）处理细胞 1 小时，以防止半胱天冬酶（caspase）依赖性细胞死亡（主要是凋亡）。在成像过程中使用该处理可防止细胞因凋亡而脱落，避免细胞移出焦平面导致成像困难。需要注意的是，caspase 向活化平台的募集及其相关的 caspase BiFC 并不依赖于 caspase 的催化活性，因此 caspase 抑制不会影响此步骤。

  1. 转染后约 24 小时加入选定的刺激物，并根据每种药物的要求孵育相应的时间。
    1. 通过在步骤 1.1.2 的培养基中添加 Hepes（20 mM，pH 7.2–7.5）和 2-巯基乙醇（55 µM）来制备成像培养基。
    2. 将所需浓度的刺激物加入预热的成像培养基中，轻轻混匀。
    3. 用 p1000 移液器小心吸去细胞中的培养基，沿孔壁加入 500 µL 步骤 5.1.2 中的刺激溶液。
    4. 对于未处理的对照孔，加入不含刺激物的成像培养基。
    5. 将细胞置于加湿的组织培养孵箱中（37 °C，5% CO2），根据每种处理条件的要求孵育相应时间。
  2. 使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察细胞。
    1. 按照制造商的说明打开显微镜和荧光光源。
    2. 选择 10x 或 20x 物镜，将培养皿放置在显微镜载物台上。
    3. 通过显微镜目镜，在 568 nm 滤光片下寻找细胞，并聚焦于表达 dsRedmito/mCherry 报告基因的细胞（红色细胞）。
    4. 计数视野内所有红色细胞，并记录数量。
    5. 在同一视野下，切换至 488 nm 或 512 nm 滤光片（GFP 或 YFP），继续计数同时呈绿色的红色细胞（Venus 阳性或 BiFC 阳性细胞），并记录数量。
    6. 从至少三个独立的视野中，总计数不少于 100 个 dsRedmito/mCherry 阳性细胞。
    7. 计算每个视野中 Venus 阳性转染细胞的百分比，并对每种处理（孔）的百分比取平均值，以获得标准差。
  3. 使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对细胞进行成像
    注意：若使用 20x 物镜或更高倍率进行共聚焦成像，除非显微镜配备长工作距离物镜，否则应将细胞接种于玻璃底培养皿中。
    1. 执行步骤 5.2.1–5.2.3。若使用配备 40x、60x 或 63x 油镜的共聚焦显微镜，请在物镜上滴加一滴镜油。
    2. 在计算机屏幕上观察相机获取的细胞实时图像。使用落射荧光光源获取荧光图像，或切换至激光光源以获取共聚焦图像。
    3. 使用操纵杆和调焦旋钮精细调节细胞的焦点和位置。
    4. 设置 512 nm 或 488 nm（YFP 或 GFP）以及 568 nm（RFP）激光器的激光功率百分比和曝光时间，使图像中的信号清晰且未达到饱和。
    5. 开启实时采集并查看所得图像。确保两个通道的显示直方图中每种荧光染料均出现明显峰值。
    6. 根据需要调整激光功率和曝光时间。在仍能检测到两种荧光信号（RFP 和 GFP/YFP）的前提下，尽量保持这些参数值最低。
    7. 在观察细胞实时图像的同时，对每个孔中表达 mCherry/dsRedmito 报告基因的一个或多个细胞区域采集多张代表性图像，并保存数据。

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结果

图中所示方案 图2 概述了如何获取、转染和成像人源MDM。在将选定的CD14+单核细胞与GM-CSF共同孵育7天后，细胞形态随着分化过程的进行而发生变化（图 3A），从球形的悬浮细胞逐渐变为细长并完全贴壁（第3和第4天），最终在完全分化后呈现更铺展的形态（第7天）。完全分化的细胞随后从培养板上解离，并转染caspase BiFC配对质粒（VC和VN）以及报告质粒（例如dsRedmito，一种编码靶向线粒体的红色荧光蛋白的质粒），后者用于标记转染的细胞（图3B）并用于转染后24小时评估转染效率。 图3B-D 展示使用caspase-1前体BiFC转染细胞并用尼日尔菌素处理20小时后的BiFC结果示例5 µM），一种已知的促炎刺激物，可触发NLRP3炎症小体的组装30,...

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讨论

本方案描述了从人血液样本中分离的单核细胞获取巨噬细胞的工作流程，以及一种在不损害细胞活力和行为的前提下，将炎症性caspase BiFC报告系统高效导入人MDM的方法。

本方案利用双分子荧光互补（BiFC）技术35，将炎症性caspase的caspase募集结构域（CARD）与分裂型荧光蛋白Venus的非荧光片段进行标记。炎症性caspase包含一个由大亚基（p20）和小亚基（p10）组成的催化结构域，以及位于其N端或前结构域的一个保守的蛋白质-蛋白质相互作用基序，称为CARD36（图1B）。炎症性caspase向其活化平台的募集依赖于完整的CARD结构域。在本方法中，构建两种caspase前结构域载体（编码CARD基序），每种分别连接光稳定性黄色荧光蛋白Venus的非荧光片段（Venus-C [VC] 和 Venus-N [VN]），并同时引入一种荧光转染报告基因，以便在caspase BiFC报告系统激活之前或未激活时对细胞...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢LBH实验室过去和现在的成员为本技术的开发所做出的贡献。本实验室的研究工作得到了美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所T32DK060445（BEB）、F32DK121479（BEB）以及美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所R01GM121389（LBH）项目的资助。图2使用BioRender软件绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
48 孔组织培养 2:34 板Genesee Scientific25-108
10 cm 组织培养皿VWR25382-166
2-巯基乙醇 1000 倍浓缩液Thermo Fisher Scientific21985023
带 1.5 HP 盖玻片的 8 孔腔室载玻片Cellvisc8-1.5H-N
AutoMACS 柱Miltenyi (Biotec)130-021-101仅用于使用 AutoMACS Pro 分离仪进行的自动化分离
AutoMACS Pro 分离仪Miltenyi (Biotec)130-092-545仅用于使用 AutoMACS Pro 分离仪进行的自动化分离
AutoMACS Pro 洗涤液Miltenyi (Biotec)130-092-987仅用于使用 AutoMACS Pro 分离仪进行的自动化分离
AutoMACS 冲洗液Miltenyi (Biotec)130-091-222仅用于使用 AutoMACS Pro 分离仪进行的自动化分离
AutoMacs 运行缓冲液Miltenyi (Biotec)130-091-221可用于使用 QuadroMACS 或 AutoMACS Pro 分离仪进行的手动或自动化分离
配备 CSU-X1A 5000 转盘单元的 Axio Observer Z1 电动倒置显微镜Zeiss任何配备激光模块（支持 568 nm（RFP）和 488 或 512 nm（GFP 或 YFP）波长）的共聚焦显微镜均可使用
AxioObserver A1 研究级倒置显微镜Zeiss任何配备可激发 568 nm（RFP）和 488 或 512 nm（GFP 或 YFP）波长的荧光滤光片的落射荧光显微镜均可使用
CD14+ MICROBEADSMiltenyi (Biotec)130-050-201可用于使用 QuadroMACS 或 AutoMACS Pro 分离仪进行的手动或自动化分离
不含氯化钙和氯化镁的 DPBSSigmaD8537-6x500ML
DsRed mito 质粒Clontech632421可在 Addgene 上找到可用作荧光报告基因的类似质粒
胎牛血清Thermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 × 100 mLSigmaGE17-1440-02
GlutaMAX 补充剂（100 倍浓缩）Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
血红素 BioXtra，来源于猪，≥96.0%（HPLC）Sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific15630106
炎症性半胱天冬酶 BiFC 质粒可向 LBH 实验室申请获取
LPS-EB 超纯品InvivogenTLRL-3PELPS
LS 柱Miltenyi (Biotec)130-042-401仅用于使用 QuadroMACS 分离仪进行的手动分离
MACS 15 mL 管架Miltenyi (Biotec)130-091-052仅用于使用 QuadroMACS 分离仪进行的手动分离
MACS 多功能支架Miltenyi (Biotec)130-042-303仅用于使用 QuadroMACS 分离仪进行的手动分离
mCherry 质粒Yungpeng Wang 实验室可在 Addgene 上找到可用作荧光报告基因的类似质粒
Neon 转染系统Thermo Fisher ScientificMPK5000包含 Neon 电穿孔装置、移液器和移液器工作站
Neon 转染系统 10 µL 试剂盒Thermo Fisher ScientificMPK1096包含重悬缓冲液 R、重悬缓冲液 T、电穿孔缓冲液 E、96 个 10 µL Neon 吸头和 Neon 电穿孔管
尼日利亚菌素钠盐，即用型溶液SigmaSML1779-1ML
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140122
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐SigmaP7280-5mg
QuadroMACS 分离仪Miltenyi (Biotec)130-090-976仅用于使用 QuadroMACS 分离仪进行的手动分离
qVD-OPhFisher (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 培养基Thermo Fisher Scientific11875119
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红Thermo Fisher Scientific25200072
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575020
Zeiss Zen 2.6（蓝色版）软件Zeiss任何用于操作所选共聚焦显微镜的软件均可使用

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人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化
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