方法文章

炎症性半月酶诱导的人单核细胞来源巨噬细胞邻近性的可视化

DOI：

10.3791/63162

⸱

2022年4月6日

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

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该协议描述了从人血液样本中获取单核细胞来源巨噬细胞（MDM）的工作流程，一种在不损害细胞活力和行为的情况下将炎症半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）报告基因有效引入人MDM的简单方法，以及一种基于成像的方法来测量活细胞中的炎症半胱天冬酶活化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

炎症性半胱天冬酶包括半胱天冬酶-1、-4、-5、-11 和 -12，属于引发者半胱天冬酶的亚组。半胱天冬酶-1是确保炎症信号传导正确调节所必需的，并且在募集到炎症小体后通过接近诱导的二聚化激活。半胱天冬酶-1在单核细胞谱系中含量丰富，并诱导促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-18向活性分泌分子成熟。其他炎症性半胱天冬酶，半胱天冬酶-4和-5（及其小鼠同源半胱天冬酶-11）通过诱导焦磷酸化来促进IL-1β的释放。半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）是一种用于测量炎症性半胱天冬酶诱导的接近度作为半胱天冬酶活化的读数的工具。半胱天冬酶-1，-4或-5原结构域，其中包含与炎症小体结合的区域，与黄色荧光蛋白Venus（Venus-N [VN]或Venus-C [VC]）的非荧光片段融合，当半胱天冬酶发生诱导接近时，这些片段与荧光金星复合物结合以重整荧光金星复合物。该协议描述了如何使用细胞核感染将这些报告基因引入原代人单核细胞来源的巨噬细胞（MDM），处理细胞以诱导炎症性半胱天冬酶活化，并使用荧光和共聚焦显微镜测量半胱天冬酶活化。这种方法的优点是它可用于鉴定活细胞中炎症性半胱天冬酶活化复合物的组分，要求和定位。然而，需要考虑仔细的控制，以避免损害细胞活力和行为。该技术是一种强大的工具，用于分析炎症小体水平的动态半胱天冬酶相互作用，以及询问活MDM和来自人类血液样本的单核细胞中的炎症信号级联。

引言

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半胱天冬酶是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的一个家族，可以分为引发子半胱天冬酶和刽子手半胱天冬酶。刽子手半挂酶包括半胱天冬酶-3、-6和-7。它们以二聚体的形式天然存在于细胞中，并被引发剂半胱天冬酶切割以执行细胞凋亡1。引发剂半胱天冬酶包括人半胱天冬酶-1、-2、-4、-5、-8、-9、-10和-12。它们被发现为无活性酶原（前半胱天冬酶），通过接近诱导的二聚化激活，并通过自体蛋白水解裂解2，3稳定。炎症性半胱天冬酶是引发子半胱天冬酶2 的一个子集，包括人类中的半胱天冬酶-1、-4、-5 和 -12，以及小鼠4、5 中的半胱天冬酶-1、-11 和 -12。它们不是凋亡作用，而是在炎症中起核心作用。它们介导蛋白水解处理和促白细胞介素（IL）-1β和亲IL-186，7的分泌，这是响应致病性入侵者释放的第一批细胞因子8，9。半叶酶-1在其激活平台募集时被激活;称为炎症小体的大分子量蛋白质复合物（图1A）10。半胱天冬酶-4、-5 和 -11 的二聚化通过非规范的炎性小体途径11，12 独立于这些平台发生。

典型炎性粒体是胞质多聚体蛋白复合物，由炎性粒体传感器蛋白、适应蛋白ASC（含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白）和效应蛋白半胱天冬酶-110组成。研究最充分的规范炎小体是含有pyrin结构域（NLRP），NLRP1和NLRP3的NOD样受体家族，含有CARD（NLRC），NLRC4的NLR家族以及黑色素瘤2（AIM2）中不存在的。它们各自包含一个pyrin域，一个CARD或两个域。CARD域介导含CARD的半链酶与其上游激活剂之间的相互作用。因此，由N端pyrin结构域（PYD）和C端CARD基序13，14组成的支架分子ASC是将半胱天冬酶-1募集到NLRP110，NLRP315和AIM216 炎性小体所必需的。

每个炎症小体都以其独特的传感器蛋白命名，该传感器蛋白可识别不同的促炎刺激（图1B）。该途径的激活剂被称为规范刺激。炎症小体充当微生物成分和组织应激的传感器，并通过激活炎症半胱天冬酶17来组装以触发强大的炎症反应。炎症小体组装启动半胱天冬酶-1活化以介导其主要底物pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟和分泌。此过程通过两步机制进行。首先，启动刺激通过激活NF-κB途径上调某些炎症小体蛋白和pro-IL-1β的表达。其次，细胞内（规范）刺激诱导炎症小体组装和前卡星酶-16，7的募集。

半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-5是小鼠半胱天冬酶-11 11的人类同源物。它们通过细胞内脂多糖（LPS）以炎症小体独立的方式被激活，LPS是在革兰氏阴性细菌18，19，20的外膜中发现的分子，以及细胞外血红素，红细胞溶血21的产物。已经提出LPS直接与这些蛋白质的CARD基序结合并诱导其寡聚化20。半胱天冬酶-4或半胱天冬酶-5的活化通过裂解形成孔隙蛋白gasdermin D（GSDMD）18，19诱导称为焦磷酸化的炎症形式的细胞死亡来促进IL-1β的释放。此外，由半胱天冬酶-4和GSDMD介导的热融性死亡引起的钾离子外排诱导NLRP3炎症小体的活化和随后的半胱天冬酶-122，23的活化。因此，半胱天冬酶-4、-5 和 -11 被认为是 LPS 的细胞内传感器，它们能够诱导焦磷酸化和半胱天冬酶-1 激活以响应特定的刺激11，24。

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图1:炎症半胱天冬酶和半胱天冬酶 - 双分子荧光互补（BiFC）测定。 （A）显示半胱天冬酶-BiFC系统的图表，其中与金星的每个非荧光片段（Venus-C或Venus-N）相连的两个半胱天冬酶-1蛋白结构域（C1-pro）被招募到NLRP3激活平台，迫使金星重新折叠并发出荧光。该复合物在显微镜下显示为绿点，并用作炎症性半胱天冬酶诱导的接近的读数，这是引发半胱天冬酶激活的第一步。（B）显示炎症小体成分和炎症性半胱天冬酶的结构域组织的示意图。 请点击此处查看此图的大图。

测量特异性引发剂半胱天冬酶活化是困难的，并且通过成像方法没有多少方法可以做到这一点。半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）可用于直接在活细胞中可视化炎症半胱天冬酶活化（图1A）25。该技术最近已被改编用于人单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）21。半胱天冬酶BiFC测量炎症性半胱天冬酶活化的第一步，诱导接近以促进二聚化。使用编码含CARD的半胱天冬酶pro结构域的质粒的表达，这些质粒融合到光稳定黄色荧光蛋白Venus（Venus-C [VC]）和Venus-N [VN]）的非荧光片段中。当两个半胱天冬酶前跨域被招募到它们的激活平台或经历诱导的接近时，金星的两半被靠近并被迫重新折叠和发出荧光（见 图1A，B）。这提供了特定炎症性半胱天冬酶激活的实时读数。

人类MDM大量表达炎症小体基因和模式识别受体，识别危险信号和病原体产物。这为炎症半胱天冬酶途径的询问提供了理想的细胞类型。此外，它们可以来自外周血，甚至来自患者样本，以评估特定疾病状态下的炎症性半胱天冬酶激活。该协议描述了如何使用核感染，一种基于电穿孔的转染方法将BiFC半胱天冬酶报告基因引入MDM，如何处理细胞以诱导炎症性半胱天冬酶活化，以及如何使用显微镜方法可视化活性半胱天冬酶复合物。此外，该方法可以适于确定这些复合物的分子组成，亚细胞定位，动力学和这些高度有序结构的大小25，26，27。

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方案

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该协议遵循贝勒医学院人类研究伦理委员会关于操纵人类样本的指导方针。血液样本的处理遵循人体样本的机构安全指南。血液样本在区域血库获得，在那里用柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）溶液收集。然而，用其他抗凝剂如肝素钠，锂肝素或EDTA收集的血液也可用于该方案28，29。

1.人单核细胞的分离和分化成巨噬细胞

  1. 从区域血库的去识别健康个体处获取抗凝血，并分离外周血单核细胞（PBMC），如下所示。
    注意:在组织培养层流罩中执行所有步骤。仅使用无菌管并戴上手套。处理时，在所有与血液相关的产品中添加10%的漂白剂。无菌 PBS （1x） 或 DPBS（无 Ca2+ 和镁2+） 可以互换使用。

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结果

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图2所示的方案概述了如何获得，转染和成像人MDM.在选定的CD14 +单核细胞与GM-CSF孵育7天后，细胞形态在分化期间发生变化（图3A），从球形悬浮细胞到旋转和完全附着（第3天和第4天）， 最后，在完全分化时（第7天）进行更多的扩散细胞。然后将完全分化的细胞从平板中分离出来，并用半胱天冬酶BiFC对（VC和VN）以及报告质粒（例如，dsRedmito，一种编码靶向线粒体的红色荧光蛋白的质粒）转染，用于标记转染细胞（图3B），并用于评估24小时后转染的效率。 显示了使用半胱天冬酶-1 pro BiFC转染细胞用尼日利亚霉素（5μM）处理20小时的BiFC结果示例，尼日利亚红素是一种已知的促炎刺激物，可触发NLRP3炎症小体30，...

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讨论

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该协议描述了从从人血液样本中分离的单核细胞中获取巨噬细胞的工作流程，以及一种在不影响细胞活力和行为的情况下将炎症性半胱天冬酶BiFC报告基因有效地引入人MDM的方法。

该协议利用BiFC技术35 用分裂荧光蛋白Venus的非荧光片段标记半胱天冬酶募集结构域（CARD）处的炎症半胱天冬酶。炎症性半胱天冬酶编码由大（p20）和小（p10）亚基组成的催化结构域，以及在其N端或prodomain36 处称为CARD的保守蛋白质 - 蛋白质相互作用基序（图1B）。炎症性半胱天冬酶招募到其激活平台取决于完整的CARD。对于这种方法，生成两个半胱天冬酶prodomain构建体（编码CARD基序），每个构建体都与光稳定黄色蛋白Venus（Venus-C [VC]）和Venus-N [VN]）的非荧光片段以及荧光转染报告基因一起链接，以允许在半胱天冬酶BiFC报告基因激活之前或没有激活的情况下可视化细胞。只有当相互作用的蛋白质足够接近并允许二聚化...

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披露

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作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢LBH实验室过去和现在的成员，他们为这项技术的发展做出了贡献。该实验室由NIH / NIDDK T32DK060445（BEB），NIH / NIDDK F32DK121479（BEB），NIH / NIGMS R01GM121389（LBH）提供支持。图2是使用Biorender软件绘制的。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
48 孔组织培养2：34 板Genesee Scientific25-108
10 cm 组织培养皿VWR25382-166
2 巯基乙醇 1000xThermo Fisher Scientific21985023
8 孔腔室盖玻片，带 1.5 HP 盖玻片Cellvisc8-1.5H-N
AutoMACS 色谱柱Miltenyi （Biotec）130-021-101仅用于使用 AutoMACS Pro 分离器进行自动分离
AutoMACS Pro 分离器Miltenyi （Biotec）130-092-545仅用于使用 AutoMACS Pro 分离器进行自动分离
AutoMACS Pro 清洗液Miltenyi （Biotec）130-092-987仅用于使用 AutoMACS Pro 分离器进行自动分离
AutoMACS 冲洗液Miltenyi （Biotec）130-091-222仅用于使用 AutoMACS Pro 分离器进行自动分离
AutoMacs 运行缓冲液Miltenyi （Biotec）130-091-221用于使用 QuadroMACS 或 AutoMACS pro 分离器进行手动或自动分离
Axio Observer Z1 电动倒置显微镜，配备 CSU-X1A 5000 转盘装置蔡司任何配备激光模块的共聚焦显微镜都可以使用，该激光模块配有 568 nm （RFP） 和 488 或 512 nm（GFP 或 YFP）波长的激光线
AxioObserver A1，研究级倒置显微镜司带有荧光滤光片的落射荧光显微镜，能够激发 568 nm （RFP） 和 488 或 512 nm（GFP 或 YFP）波长的荧光显微镜
CD14+ 微珠Miltenyi （Biotec）130-050-201使用 QuadroMACS 或 AutoMACS pro 分离器 DPBS 进行手动或自动分离
不含氯化钙和氯化镁SigmaD8537-6 x 500ML
DsRed 线粒Clontech632421荧光报告基因的类似质粒可在 Addgene
胎牛血清Thermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100mLSigmaGE17-1440-02
GlutaMAX 补充剂 （100x）Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra，来自猪，≥96.0% （HPLC）Sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific15630106
炎性半胱天冬酶 BiFC 质粒可根据要求从 LBH 实验室获得
LPS-EB 超纯InvivogenTLRL-3PELPS
LS 色谱柱Miltenyi （Biotec）130-042-401仅用于使用 QuadroMACS 分离器进行手动分离
MACS 15 mL 试管架Miltenyi （Biotec）130-091-052仅用于使用 QuadroMACS 分离器进行手动分离
MACS MultiStandMiltenyi （Biotec）130-042-303仅用于使用 QuadroMACS 分离器
mCherry 质粒Yungpeng Wang 实验室荧光报告基因的类似质粒可在 Addgene
Neon 转染系统上找到Thermo Fisher ScientificMPK5000包括 Neon 电穿孔设备、移液器和移液器站
Neon 转染系统 10 &微量;L 试剂盒Thermo Fisher ScientificMPK1096包括重悬缓冲液 R、重悬缓冲液 T、电解缓冲液 E、96 x 10 和微量;L 霓虹灯头和霓虹电穿孔管
尼日利亚菌素钠盐，即用型溶液SigmaSML1779-1ML
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140122
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐SigmaP7280-5mg
QuadroMACS 分离器Miltenyi （Biotec）130-090-976用于手动分离仅限 QuadroMACS 分离器
qVD-OPhFisher （ApexBio）50-101-3172
RPMI 1640 培养基Thermo Fisher Scientific11875119
胰蛋白酶-EDTA （0.25%），酚红Thermo Fisher Scientific25200072
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575020
Zeiss Zen 2.6（蓝色版）软件Zeiss用于作所选共聚焦显微镜的任何软件
蔡 任何， 可用作上找到 可用作

参考文献

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标签

Caspase Caspase BiFC

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