本方案描述了从人血液样本中获取单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）的工作流程，一种在不损害细胞活力和行为的前提下，将炎症性半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）报告系统高效导入人MDM的简便方法，以及一种基于成像的技术，用于在活细胞中检测炎症性半胱天冬酶的激活。
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本文内容
摘要
摘要
炎症性胱天蛋白酶包括caspase-1、-4、-5、-11和-12，属于起始型胱天蛋白酶的亚类。caspase-1对于炎症信号通路的正确调控至关重要，其通过被招募至炎性小体后发生邻近诱导的二聚化而被激活。caspase-1在单核细胞谱系中含量丰富，可诱导促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-18前体成熟为具有活性并可分泌的分子形式。其他炎症性胱天蛋白酶caspase-4和-5（及其小鼠同源物caspase-11）则通过诱导细胞焦亡促进IL-1β的释放。胱天蛋白酶双分子荧光互补（BiFC）是一种用于检测炎症性胱天蛋白酶因邻近作用而激活的实验工具。该方法将含有可与炎性小体结合区域的caspase-1、-4或-5前结构域，分别与黄色荧光蛋白Venus的非荧光片段（Venus-N [VN] 或 Venus-C [VC]）融合；当胱天蛋白酶发生诱导性邻近时，这些片段可重新结合并恢复形成具有荧光的Venus复合物。本实验方案描述了如何通过核转染技术将上述报告系统导入人原代单核细胞来源的巨噬细胞（MDM），随后对细胞进行处理以诱导炎症性胱天蛋白酶的激活，并利用荧光和共聚焦显微镜检测胱天蛋白酶的激活情况。该方法的优势在于可用于在活细胞中鉴定炎症性胱天蛋白酶激活复合物的组成成分、必要条件及其亚细胞定位。然而，需设置严谨的对照，以避免影响细胞活力和正常行为。该技术是研究炎性小体水平上动态胱天蛋白酶相互作用，以及分析来源于人血液样本的活MDM和单核细胞中炎症信号级联反应的有力工具。
引言
半胱天冬酶（caspase）是一类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，可分为起始型半胱天冬酶（initiator caspase）和效应型半胱天冬酶（executioner caspase）。效应型半胱天冬酶包括caspase-3、-6和-7，它们在细胞中天然以二聚体形式存在，并由起始型半胱天冬酶切割活化，从而执行细胞凋亡过程1。起始型半胱天冬酶包括人源的caspase-1、-2、-4、-5、-8、-9、-10和-12，它们以无活性的酶原形式（前体caspase）存在，通过邻近诱导的二聚化被激活，并经自蛋白水解切割而稳定2,3。炎症性半胱天冬酶是起始型半胱天冬酶的一个亚群2，在人类中包括caspase-1、-4、-5和-12，在小鼠中包括caspase-1、-11和-124,5。这类酶不参与细胞凋亡，而是在炎症反应中发挥核心作用，介导前体白细胞介素（pro-interleukin, pro-IL）-1β和pro-IL-18的蛋白水解加工及其分泌6,7，而IL-1β和IL-18是机体在病原体入侵后最早释....
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方案
本方案遵循贝勒医学院人类研究伦理委员会关于人源样本操作的指导原则。血液样本的处理符合机构规定的人源样本安全指南。血液样本取自地区血库，采集时使用柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖（CPD）溶液抗凝。然而，使用其他抗凝剂（如肝素钠、肝素锂或EDTA）采集的血液也可用于本方案28,29。
1. 人单核细胞的分离及向巨噬细胞的分化
- 从地区血库获取匿名健康个体的抗凝血，并按以下说明分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
注意：所有步骤均需在组织培养用层流罩内进行。仅使用无菌离心管并佩戴手套。处理与血液相关的产物时，应加入10%漂白剂。无菌PBS（1x）或不含Ca2+和Mg2+的DPBS可互换使用。- 配制稀释缓冲液：在1x无菌PBS中添加2%胎牛血清（FBS）和0.5 mM EDTA。
- 配制培养基：在RPMI-1640培养基中添加FBS（10% (v/v)）、谷氨酰胺（Glutamax，2 mM）和青霉素/链霉素（50 I.U./50 µg/mL）。
- 根据制造商说明书预冷运行缓冲液（材料表）。
- 用两倍体积的稀释缓冲液稀释全血。使用移液管将15 mL抗凝血....
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结果
图中所示方案 图2 概述了如何获取、转染和成像人源MDM。在将选定的CD14+单核细胞与GM-CSF共同孵育7天后，细胞形态随着分化过程的进行而发生变化（图 3A），从球形的悬浮细胞逐渐变为细长并完全贴壁（第3和第4天），最终在完全分化后呈现更铺展的形态（第7天）。完全分化的细胞随后从培养板上解离，并转染caspase BiFC配对质粒（VC和VN）以及报告质粒（例如dsRedmito，一种编码靶向线粒体的红色荧光蛋白的质粒），后者用于标记转染的细胞（图3B）并用于转染后24小时评估转染效率。 图3B-D 展示使用caspase-1前体BiFC转染细胞并用尼日尔菌素处理20小时后的BiFC结果示例5 µM），一种已知的促炎刺激物，可触发NLRP3炎症小体的组装30,.......
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讨论
本方案描述了从人血液样本中分离的单核细胞获取巨噬细胞的工作流程，以及一种在不损害细胞活力和行为的前提下，将炎症性caspase BiFC报告系统高效导入人MDM的方法。
本方案利用双分子荧光互补（BiFC）技术35，将炎症性caspase的caspase募集结构域（CARD）与分裂型荧光蛋白Venus的非荧光片段进行标记。炎症性caspase包含一个由大亚基（p20）和小亚基（p10）组成的催化结构域，以及位于其N端或前结构域的一个保守的蛋白质-蛋白质相互作用基序，称为CARD36（图1B）。炎症性caspase向其活化平台的募集依赖于完整的CARD结构域。在本方法中，构建两种caspase前结构域载体（编码CARD基序），每种分别连接光稳定性黄色荧光蛋白Venus的非荧光片段（Venus-C [VC] 和 Venus-N [VN]），并同时引入一种荧光转染报告基因，以便在caspase BiFC报告系统激活之前或未激活时对细胞.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢LBH实验室过去和现在的成员为本技术的开发所做出的贡献。本实验室的研究工作得到了美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所T32DK060445（BEB）、F32DK121479（BEB）以及美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所R01GM121389（LBH）项目的资助。图2使用BioRender软件绘制。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 48 孔组织培养 2:34 板 | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10 cm 组织培养皿 | VWR | 25382-166 | |
| 2-巯基乙醇 1000 倍浓缩液 | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 带 1.5 HP 盖玻片的 8 孔腔室载玻片 | Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS 柱 | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | 仅用于使用 AutoMACS Pro 分离仪进行的自动化分离 |
| AutoMACS Pro 分离仪 | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | 仅用于使用 AutoMACS Pro 分离仪进行的自动化分离 |
| AutoMACS Pro 洗涤液 | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | 仅用于使用 AutoMACS Pro 分离仪进行的自动化分离 |
| AutoMACS 冲洗液 | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | 仅用于使用 AutoMACS Pro 分离仪进行的自动化分离 |
| AutoMacs 运行缓冲液 | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | 可用于使用 QuadroMACS 或 AutoMACS Pro 分离仪进行的手动或自动化分离 |
| 配备 CSU-X1A 5000 转盘单元的 Axio Observer Z1 电动倒置显微镜 | Zeiss | 任何配备激光模块（支持 568 nm（RFP）和 488 或 512 nm（GFP 或 YFP）波长）的共聚焦显微镜均可使用 | |
| AxioObserver A1 研究级倒置显微镜 | Zeiss | 任何配备可激发 568 nm（RFP）和 488 或 512 nm（GFP 或 YFP）波长的荧光滤光片的落射荧光显微镜均可使用 | |
| CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | 可用于使用 QuadroMACS 或 AutoMACS Pro 分离仪进行的手动或自动化分离 |
| 不含氯化钙和氯化镁的 DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed mito 质粒 | Clontech | 632421 | 可在 Addgene 上找到可用作荧光报告基因的类似质粒 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 × 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| GlutaMAX 补充剂（100 倍浓缩） | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| 血红素 BioXtra，来源于猪，≥96.0%（HPLC） | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| 炎症性半胱天冬酶 BiFC 质粒 | 可向 LBH 实验室申请获取 | ||
| LPS-EB 超纯品 | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS 柱 | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | 仅用于使用 QuadroMACS 分离仪进行的手动分离 |
| MACS 15 mL 管架 | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | 仅用于使用 QuadroMACS 分离仪进行的手动分离 |
| MACS 多功能支架 | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | 仅用于使用 QuadroMACS 分离仪进行的手动分离 |
| mCherry 质粒 | Yungpeng Wang 实验室 | 可在 Addgene 上找到可用作荧光报告基因的类似质粒 | |
| Neon 转染系统 | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | 包含 Neon 电穿孔装置、移液器和移液器工作站 |
| Neon 转染系统 10 µL 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | 包含重悬缓冲液 R、重悬缓冲液 T、电穿孔缓冲液 E、96 个 10 µL Neon 吸头和 Neon 电穿孔管 |
| 尼日利亚菌素钠盐，即用型溶液 | Sigma | SML1779-1ML | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma | P7280-5mg | |
| QuadroMACS 分离仪 | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | 仅用于使用 QuadroMACS 分离仪进行的手动分离 |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6（蓝色版）软件 | Zeiss | 任何用于操作所选共聚焦显微镜的软件均可使用 |
参考文献
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2....
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