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方法文章

利用斑马鱼和青鳉鱼视顶盖成年 stab wound 损伤模型进行再生能力比较分析

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DOI：

10.3791/63166

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2022年2月10日

 , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2DBT-AIST International Laboratory for Advanced Biomedicine, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology

本文内容

摘要

本文描述了一种用于研究成年斑马鱼高度再生能力所涉及的分子调控机制的机械性脑损伤模型。该方法阐述了如何在多种小型鱼类的视顶盖区域制造刺伤损伤，以通过荧光免疫染色评估其再生反应。

摘要

尽管斑马鱼具有较强的中枢神经系统（CNS）再生能力，而青鳉鱼的中枢神经系统再生能力则较弱。本研究建立了成年斑马鱼和青鳉鱼视顶盖的脑损伤模型，并通过比较组织学和分子分析，以阐明调控这两种鱼类视顶盖组织高再生能力的分子机制。本文介绍了一种使用针头在成年视顶盖中制造穿刺损伤的模型，并对神经干细胞（NSCs）的增殖与分化进行组织学分析。通过手动将针头插入视顶盖中央区域造成损伤，随后对鱼类进行心脏灌流并解剖其脑组织。这些组织经冷冻切片后，利用针对神经干细胞增殖和分化标志物的免疫染色进行评估。该视顶盖损伤模型在斑马鱼和青鳉鱼中均能获得稳定且可重复的结果，可用于比较损伤后神经干细胞的反应。该方法适用于斑马鱼、青鳉鱼及非洲鳉鱼等小型辐鳍鱼类，使我们能够比较它们的再生能力，并探究其独特的分子机制。

引言

与其它哺乳动物相比，斑马鱼（Danio rerio）具有更强的中枢神经系统（CNS）再生能力1,2,3。近年来，为了更深入地理解这种增强再生能力背后的分子机制，研究人员已利用下一代测序技术开展了组织再生的比较分析4,5,6。斑马鱼与四足动物的脑结构存在显著差异7,8,9。因此，为促进对上述增强再生能力相关分子机制的研究，已开发出多种脑结构和生物学特征相似的小型鱼类脑损伤模型。

此外，青鳉（Oryzias latipes是一种常用实验动物，其心脏和神经元再生能力较弱10,11,12,13 与斑马鱼相比，斑马鱼和青鳉鱼具有相似的成年神经干细胞（NSCs）脑结构和生态位14,15,16,17在斑马鱼和青鳉鱼中，视顶盖包含两种类型的神经干细胞，即类似神经上皮的干细胞和放射状胶质细胞（RGCs）。15,18. 此前已建立成年斑马鱼视顶盖刺伤损伤模型，并利用该模型研究调控这些动物脑再生的分子机制19,20,21,22,23该年轻成年斑马鱼刺伤损伤模型可诱导视网膜神经节细胞（RGCs）来源的再生性神经发生19,24,25该视顶盖刺伤损伤是一种稳定且可重复的方法13,19,20,21,22,23,24,25当相同的损伤模型应用于成年青鳉时，揭示了青鳉视顶盖中视网膜神经节细胞的神经发生能力较低 通过 损伤后RGC增殖与分化的比较分析13.

在鳉鱼模型中也已建立了视顶盖的刺伤损伤模型26，但与端脑损伤相比，视顶盖损伤的详细情况尚未得到充分记录27。利用斑马鱼和青鳉进行视顶盖刺伤损伤，可研究不同再生能力物种之间的细胞反应差异及基因表达差异。本实验方案描述了如何使用注射针在视顶盖中实施刺伤损伤。该方法适用于斑马鱼和青鳉等小型鱼类。本文还介绍了用于组织学分析以及利用荧光免疫组织化学和冷冻切片进行细胞增殖与分化分析的样品制备流程。

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方案

所有实验方案均获得产业技术综合研究所机构动物护理和使用委员会的批准。斑马鱼和青鳉鱼的饲养遵循标准操作程序28。

1. 成年视顶盖的刺伤损伤

  1. 制备0.4% (w/v) 的三卡因储备液用于麻醉。配制100 mL储备液时，将400 mg甲磺酸三卡因（见材料表）溶解于90 mL蒸馏水中，并用1 M Tris HCl缓冲液（pH 9.0）调节pH至7.0。pH调节完成后，加水定容至100 mL，分装成适当体积后于-20 °C保存。
  2. 为麻醉成年斑马鱼或青鳉鱼，用养殖水将0.4%三卡因储备液稀释，配制成0.02% (w/v) 的三卡因工作液。
  3. 用0.02%三卡因溶液麻醉鱼类；当鱼体不再活动且对触碰无反应时（1–2分钟），即表示已进入麻醉状态。
  4. 将麻醉后的鱼置于聚苯乙烯泡沫托盘上（见材料表），并用插入泡沫中的两枚30 G针头垂直固定鱼体，使其保持直立。
  5. 固定鱼体以防止头部移动，将一枚30 G针头垂直穿过颅骨，插入视顶盖半球中侧区域（图1A，B）。进针深度约为0.75 mm，接近30 G针头斜面长度的一半。由于斑马鱼与青鳉鱼体型相似，该进针深度可在两种鱼类中均诱导脑损伤。
    注意：青鳉鱼颅骨上有鳞片。需使用30 G针头刮除并去除鳞片，以高效且准确地造成穿刺损伤（图1C）。
  6. 将受伤鱼转移至含有新鲜养殖水的鱼缸中，待其完全从麻醉中恢复后，再将鱼缸移回鱼类繁育系统。
    注意：鱼类通常在数分钟内恢复并开始自由游动。
  7. 若需在损伤后进行细胞谱系分析，应准备含有5 mM溴脱氧尿苷（BrdU）的新鲜养殖水（见材料表），并将鱼浸入该5 mM BrdU溶液中孵育一段预定时间13,19（根据实验设计确定）。随后按照步骤2的方法解剖鱼类，并相应地检测BrdU掺入情况及细胞谱系特征。
    ​注意：此步骤为细胞谱系分析的可选步骤。为检测BrdU信号，需按步骤4.3所示进行抗原修复。

2. 脑组织解剖

  1. 准备0.02%三卡因溶液、用于解剖的泡沫塑料托盘，以及装有磷酸盐缓冲液（1× PBS）的10 mL注射器，配备延长管和30 G针头（见材料表），用于心脏灌注。
  2. 在选定的时间点对受伤的鱼进行麻醉。
  3. 在泡沫塑料托盘上放置纸巾，并将麻醉后的鱼置于纸巾上。
  4. 用两枚30 G针头垂直插入肛门鳍两侧，固定鱼体（图2A）。
  5. 从肛门向心脏做腹侧切口（图2B），并通过在心脏两侧各插入两枚30 G针头使心脏保持暴露状态（图2C）。
    注意：在斑马鱼和青鳉中，心脏均被银色的皮下上皮层覆盖（图2C）。
  6. 用镊子尖端轻轻去除银色上皮层（图2D）。
  7. 将30 G针头插入心室，针尖斜面朝上，同时用镊子剪开心房（图2E）。轻压注射器，推动1× PBS，确认心房已将血液冲洗干净。
    注意：为防止针头穿透心室，应小心将针头插入至半斜面深度，然后调整插入深度。若灌注充分，鳃部会变为白色（图2F、G）。
  8. 当血液排尽且鳃部变白后，停止灌注。
  9. 移除固定鱼体的针头，将鱼腹面朝下固定（图2H）。切断脊髓，并从视顶盖和端脑处移除颅骨（图2I）。随后剪断视神经，小心解剖脑组织。
    注意：解剖过程中需注意视神经，因其与视顶盖相连。若牵拉视神经，可能导致视顶盖从脑组织上脱落。若血液未完全清除，脑组织呈淡粉色（图2J中右侧脑组织）。
  10. 将脑组织转移至含有1 mL 4%多聚甲醛（溶于1× PBS）的1.5 mL离心管中，于4 °C下固定过夜。

3. 冷冻切片的制备

  1. 用 1x PBS 将固定好的脑组织清洗三次，每次 5 分钟。
  2. 为了对脑组织进行冷冻保护，将其转移至含有 1 mL 30% (w/v) 蔗糖（溶于 1x PBS）的 1.5 mL 离心管中，于 4 °C 过夜孵育。通过将 30 mL OCT 包埋剂与 15 mL 30% 蔗糖混合，配制包埋液（OCT 包埋剂与 30% 蔗糖按 2:1 比例混合，参见 材料表），并将该混合液储存于 4 °C。
    注意：为去除混合物中的气泡，可将 50 mL 离心管在室温下以 10,000 × g 离心 2 分钟，或将离心管直立放置过夜。
  3. 将铝块于 -80 °C 过夜预冷，以便在将解剖后的脑组织用包埋液包埋于冷冻模具（参见 材料表）后立即冷却模具。
    注意：也可使用液氮冷却铝块。此时，应在包埋前将铝块放入装有足量液氮的泡沫盒中，使液氮刚好浸没铝块。确认液氮挥发完毕后，再将冷冻模具置于预冷的铝块上。建议事先确认铝块上可同时放置多少个冷冻模具。为确保有足够空间快速冷却所有样品，建议准备额外的液氮或另一块预冷的铝块。
  4. 将预冷的铝块放入泡沫盒中，并使用带盖的泡沫盒以防止铝块升温。
  5. 对于冠状切面，将脑组织包埋于冷冻模具中，并在显微镜下使用镊子调整其方向（图 3A）。
  6. 将冷冻模具放置于泡沫盒内的预冷铝块上，使 OCT 包埋剂完全冻结（图 3B）。当 OCT 包埋剂开始冻结时，会变为白色。
  7. 在样品托盘上涂抹少量 OCT 包埋剂，将冷冻组织块粘附于其上，以固定冷冻组织块。
  8. 将样品托盘放入冷冻切片机中，使 OCT 包埋剂完全冻结。
  9. 将样品托盘安装至冷冻切片机的样品头位置。
  10. 调整冷冻组织块的方向，并修切 OCT 以去除多余区域。
    注意：在切片端脑过程中，可调整切面方向。冷冻切片机配备有刀片，通过改变样品头的角度即可调节切面方向。
  11. 使用冷冻切片机对整个视顶盖连续切片，厚度为 14 µm。将载玻片储存于 -25 °C。
    ​注意：长期储存应置于 -80 °C。

4. 荧光免疫染色

  1. 将载玻片置于载玻片架中，在室温（RT）下干燥 30 分钟。在 1× PBS 中清洗载玻片，室温下 30 分钟。若需使用抗 PCNA 或 BrdU 抗体进行免疫染色，请转至步骤 4.2 或步骤 4.3。
  2. 在 500 mL 烧杯中配制 500 mL 10 mM 柠檬酸钠溶液，并将柠檬酸盐缓冲液置于磁力搅拌加热板上加热至 85 °C，然后将载玻片放入染色架中，于 85 °C 柠檬酸盐缓冲液中孵育 30 分钟。为避免沸腾，保持温度在 85 °C 左右。抗原修复后，在含 0.1 % Triton 的 1× PBS（PBSTr）中洗涤载玻片三次，每次洗涤在室温下进行 5 分钟。
    注意：此步骤为增殖细胞核抗原（PCNA）抗原修复的可选步骤。
  3. 通过将 12 N HCl 用蒸馏水稀释，配制 2 N HCl 溶液。使用液体阻断剂（见材料表），在载玻片上画线形成疏水屏障，以使 2 N HCl 溶液保持在组织周围。
    1. 将载玻片置于免疫染色托盘上，每张载玻片加入 200–300 µL 2 N HCl 溶液。在 37 °C 下孵育 30 分钟。抗原修复后，在 0.1 % PBSTr 中洗涤三次，每次洗涤在室温下进行 5 分钟。
      注意：此步骤为 BrdU 抗原修复的可选步骤。
  4. 用纸巾吸干并去除残留液体。必要时，使用液体阻断剂画出疏水屏障，以使抗体溶液保持在组织周围。
  5. 将载玻片置于托盘上，每张载玻片加入 200–300 µL 封闭液（含 3%（v/v）马血清的 PBSTr），在室温下孵育 1 小时。
  6. 用 PBSTr 在室温下清洗组织 5 分钟，重复三次。
  7. 使用封闭液配制一抗溶液（见材料表，每张载玻片使用 200–300 µL 抗体溶液）。用纸巾吸除残留 PBSTr，将载玻片置于免疫染色托盘上。每张载玻片加入一抗溶液，并在 4 °C 下孵育过夜。
  8. 用 PBSTr 在室温下清洗组织 5 分钟，重复三次。
  9. 使用封闭缓冲液按 1:500 稀释荧光二抗溶液（见材料表）。用纸巾吸除残留 PBSTr，将载玻片置于免疫染色托盘上。每张载玻片加入二抗溶液，并用铝箔遮盖托盘。在室温下孵育 1–2 小时。
  10. 在室温下用 PBSTr 清洗组织 5 分钟，重复三次，避免光照。
  11. 配制 Hoechst 溶液（1:500 稀释于 1× PBS 中，见材料表），用于细胞核染色。用纸巾吸除残留 PBSTr，将载玻片置于免疫染色托盘上。每张载玻片加入 Hoechst 溶液，并用铝箔覆盖托盘。在室温下孵育 30 分钟。
  12. 在室温下用 1× PBS 清洗组织 10 分钟，避免光照。
  13. 用纸巾吸除残留的 1× PBS，使用水溶性封片介质（见材料表）将组织封片于载玻片上，用于荧光免疫染色。缓慢将 24 × 45 mm 盖玻片覆盖于组织上。于 4 °C 避光保存。
  14. 在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察并成像组织。

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结果

通过将针头插入右侧半球，在视顶盖造成刺伤损伤（图1、图4A 和 图5A），可诱导多种细胞反应，包括放射状胶质细胞（RGC）的增殖以及新生神经元的产生。同样，使用了老年斑马鱼和青鳉鱼群体，以排除再生反应中可能存在的衰老效应干扰。随后对冷冻切片进行荧光免疫染色，并分析斑马鱼和青鳉鱼视顶盖损伤后RGC的增殖与分化情况（图4-5）13。

使用了针对增殖细胞标志物——增殖细胞抗原（PCNA）以及视网膜胶质细胞（RGC）标志物脑脂结合蛋白（BLBP）的抗体，这些抗体在斑马鱼和青鳉鱼中均可获得，用于评估这些组织中RGC的增殖情况13,19。如前所述，在对侧未受伤的...

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讨论

本文描述了一组可用于在视顶盖通过针刺造成损伤的方法，以促进脑损伤后视网膜神经节细胞（RGC）增殖与分化的评估。针刺法造成的损伤是一种操作简便、效率高的方法，可利用常规工具应用于大量实验样本。已有研究建立了针对斑马鱼脑部多个区域的针刺损伤模型3,19,29。视顶盖是脑中体积最大的部分之一，易于操作。此外，在生理条件下，视顶盖中的大多数RGC处于静息状态，与端脑相比更易于观察损伤所诱导的RGC增殖与分化过程3,19。

在刺伤损伤中，一个关键步骤和限制因素是手动插入针头；要获得可重复的结果并便于进行比较分析，必须实现一致的损伤。插入的精确定位和深度至关重要，有助于在实验中产生可重复的损伤。本文提供了每次制造类似损伤的明确指南。此外，损伤后视网膜神经节细胞（RGC）的增殖对于受损视顶盖的神...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了日本JSPS科研费资助项目编号18K14824和21K15195以及日本产业技术综合研究所（AIST）内部资助的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 注射器TERUMOSS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)NIPPON GENE314-90381
30 G 针头DentronicsHS-2739A
4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液Wako163-20145
铝块115 x 80 x 37 mm (W x D x H) 的尺寸足以冷冻6个冷冻模具
抗-BLBP 抗体MilliporeABN141:500
抗-BrdU 抗体Abcamab18931:500
抗-HuC 抗体InvitrogenA212711:100
抗-PCNA 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-561:200
溴脱氧尿苷Wako023-15563
共聚焦显微镜 C1 plusNikon
冷冻模具Sakura Finetek Japan456510 x 10 x 5 mm (W x D x H)
冷冻切片机LeicaCM1960
Danio rerio WT 品系 RW
延长管TERUMOSF-ET3520
Fluoromount (TM) 水性封片介质，适用于荧光染料染色组织SIGMA-ALDRICHF4680-25ML
镊子DUMONT11252-20
山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723
山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546InvitrogenA11035
Hoechst 33342 溶液Dojindo23491-52-3
盐酸Wako080-01066
10 片载玻片用孵育室，深橙色COSMO BIO CO., LTD.10DO
MAS coat 载玻片Matsunami glassMAS-01
显微盖玻片Matsunami glassC024451
体视显微镜NikonSMZ745T
正常马血清封闭液VECTOR LABRATORIESS-2000-20
O.C.T. 包埋剂Sakura Finetek Japan83-1824
Oryzias latipes WT 品系 Cab
PAP Pen Super-Liquid BlockerDAIDO SANGYOPAP-S
磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂，pH 7.4TaKaRaT9181
泡沫塑料托盘100 x 100 x 10 mm (W x D x H) 的泡沫塑料片可作为托盘使用
蔗糖Wako196-0001530 % (w/v) 蔗糖 PBS 溶液
三卡因 (MS-222)nacarai tesque14805-24
柠檬酸三钠二水合物Wako191-01785
吐温 X-100Wako04605-250

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视顶盖损伤斑马鱼再生青鳉鱼再生神经干细胞脑损伤模型冰冻切片免疫染色RGC增殖比较再生
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