本文描述了一种用于研究成年斑马鱼高度再生能力所涉及的分子调控机制的机械性脑损伤模型。该方法阐述了如何在多种小型鱼类的视顶盖区域制造刺伤损伤，以通过荧光免疫染色评估其再生反应。
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本文内容
摘要
摘要
尽管斑马鱼具有较强的中枢神经系统（CNS）再生能力，而青鳉鱼的中枢神经系统再生能力则较弱。本研究建立了成年斑马鱼和青鳉鱼视顶盖的脑损伤模型，并通过比较组织学和分子分析，以阐明调控这两种鱼类视顶盖组织高再生能力的分子机制。本文介绍了一种使用针头在成年视顶盖中制造穿刺损伤的模型，并对神经干细胞（NSCs）的增殖与分化进行组织学分析。通过手动将针头插入视顶盖中央区域造成损伤，随后对鱼类进行心脏灌流并解剖其脑组织。这些组织经冷冻切片后，利用针对神经干细胞增殖和分化标志物的免疫染色进行评估。该视顶盖损伤模型在斑马鱼和青鳉鱼中均能获得稳定且可重复的结果，可用于比较损伤后神经干细胞的反应。该方法适用于斑马鱼、青鳉鱼及非洲鳉鱼等小型辐鳍鱼类，使我们能够比较它们的再生能力，并探究其独特的分子机制。
引言
与其它哺乳动物相比，斑马鱼（Danio rerio）具有更强的中枢神经系统（CNS）再生能力1,2,3。近年来，为了更深入地理解这种增强再生能力背后的分子机制，研究人员已利用下一代测序技术开展了组织再生的比较分析4,5,6。斑马鱼与四足动物的脑结构存在显著差异7,8,9。因此，为促进对上述增强再生能力相关分子机制的研究，已开发出多种脑结构和生物学特征相似的小型鱼类脑损伤模型。
此外，青鳉（Oryzias latipes是一种常用实验动物，其心脏和神经元再生能力较弱10,11,12,....
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方案
所有实验方案均获得产业技术综合研究所机构动物护理和使用委员会的批准。斑马鱼和青鳉鱼的饲养遵循标准操作程序28。
1. 成年视顶盖的刺伤损伤
- 制备0.4% (w/v) 的三卡因储备液用于麻醉。配制100 mL储备液时，将400 mg甲磺酸三卡因（见材料表）溶解于90 mL蒸馏水中，并用1 M Tris HCl缓冲液（pH 9.0）调节pH至7.0。pH调节完成后，加水定容至100 mL，分装成适当体积后于-20 °C保存。
- 为麻醉成年斑马鱼或青鳉鱼，用养殖水将0.4%三卡因储备液稀释，配制成0.02% (w/v) 的三卡因工作液。
- 用0.02%三卡因溶液麻醉鱼类；当鱼体不再活动且对触碰无反应时（1–2分钟），即表示已进入麻醉状态。
- 将麻醉后的鱼置于聚苯乙烯泡沫托盘上（见材料表），并用插入泡沫中的两枚30 G针头垂直固定鱼体，使其保持直立。
- 固定鱼体以防止头部移动，将一枚30 G针头垂直穿过颅骨，插入视顶盖半球中侧区域（图1A，B）。进针深度约为0.75 mm，接近30 G针头斜面长度的一半。由于斑马鱼与青鳉鱼体型相似，该进针深度可在两种....
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结果
通过将针头插入右侧半球，在视顶盖造成刺伤损伤（图1、图4A 和 图5A），可诱导多种细胞反应，包括放射状胶质细胞（RGC）的增殖以及新生神经元的产生。同样，使用了老年斑马鱼和青鳉鱼群体，以排除再生反应中可能存在的衰老效应干扰。随后对冷冻切片进行荧光免疫染色，并分析斑马鱼和青鳉鱼视顶盖损伤后RGC的增殖与分化情况（图4-5）13。
使用了针对增殖细胞标志物——增殖细胞抗原（PCNA）以及视网膜胶质细胞（RGC）标志物脑脂结合蛋白（BLBP）的抗体，这些抗体在斑马鱼和青鳉鱼中均可获得，用于评估这些组织中RGC的增殖情况13,19。如前所述，在对侧未受伤的.......
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讨论
本文描述了一组可用于在视顶盖通过针刺造成损伤的方法，以促进脑损伤后视网膜神经节细胞（RGC）增殖与分化的评估。针刺法造成的损伤是一种操作简便、效率高的方法，可利用常规工具应用于大量实验样本。已有研究建立了针对斑马鱼脑部多个区域的针刺损伤模型3,19,29。视顶盖是脑中体积最大的部分之一，易于操作。此外，在生理条件下，视顶盖中的大多数RGC处于静息状态，与端脑相比更易于观察损伤所诱导的RGC增殖与分化过程3,19。
在刺伤损伤中，一个关键步骤和限制因素是手动插入针头；要获得可重复的结果并便于进行比较分析，必须实现一致的损伤。插入的精确定位和深度至关重要，有助于在实验中产生可重复的损伤。本文提供了每次制造类似损伤的明确指南。此外，损伤后视网膜神经节细胞（RGC）的增殖对于受损视顶盖的神.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了日本JSPS科研费资助项目编号18K14824和21K15195以及日本产业技术综合研究所（AIST）内部资助的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 注射器 | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G 针头 | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液 | Wako | 163-20145 | |
| 铝块 | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) 的尺寸足以冷冻6个冷冻模具 | ||
| 抗-BLBP 抗体 | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| 抗-BrdU 抗体 | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| 抗-HuC 抗体 | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| 抗-PCNA 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| 溴脱氧尿苷 | Wako | 023-15563 | |
| 共聚焦显微镜 C1 plus | Nikon | ||
| 冷冻模具 | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT 品系 RW | |||
| 延长管 | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) 水性封片介质，适用于荧光染料染色组织 | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| 镊子 | DUMONT | 11252-20 | |
| 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 溶液 | Dojindo | 23491-52-3 | |
| 盐酸 | Wako | 080-01066 | |
| 10 片载玻片用孵育室，深橙色 | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat 载玻片 | Matsunami glass | MAS-01 | |
| 显微盖玻片 | Matsunami glass | C024451 | |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ745T | |
| 正常马血清封闭液 | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT 品系 Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂，pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| 泡沫塑料托盘 | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) 的泡沫塑料片可作为托盘使用 | ||
| 蔗糖 | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) 蔗糖 PBS 溶液 |
| 三卡因 (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| 柠檬酸三钠二水合物 | Wako | 191-01785 | |
| 吐温 X-100 | Wako | 04605-250 |
参考文献
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J.
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重印与许可
