介绍了一种小鼠输卵管显微解剖方法，该方法可在保持RNA完整性的前提下分离并收集输卵管的各个节段。此外，还描述了一种非酶法的输卵管细胞解离步骤。这些方法适用于对功能不同的输卵管节段以及解离后的输卵管细胞进行后续的基因和蛋白质分析。
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本文内容
摘要
摘要
小鼠模型系统因其基因可操作性强且实验处理成本低，在疾病过程分析中具有无可比拟的优势。然而，由于小鼠体型较小，一些结构（如直径为200–400 μm的输卵管）除通过免疫组织化学方法外，较难进行深入研究。近年来，免疫组织化学研究揭示了输卵管各节段之间比以往认知更为复杂的差异，因此目前将输卵管划分为四个功能节段，每个节段含有七种不同类型的上皮细胞，且细胞类型比例各不相同。这些上皮细胞类型具有不同的胚胎起源和比例，可能导致四个功能区域对疾病的易感性存在差异。例如，在小鼠模型中，浆液性上皮内癌的癌前病变起源于漏斗部，而在人类输卵管中则起源于相应的伞部区域。本文所述方案详细介绍了显微解剖方法，可将输卵管进行细分，从而获得足够数量和纯度的RNA，以满足后续分析（如逆转录-定量PCR（RT-qPCR）和RNA测序（RNAseq））的需求。此外，还描述了一种主要非酶法的组织解离方法，适用于对完全分化的输卵管细胞进行流式细胞术或单细胞RNA测序（single cell RNAseq）分析。所介绍的方法将有助于进一步推动小鼠输卵管在生殖、生育力、癌症及免疫学领域的研究。
引言
小鼠的输卵管在功能和形态上与人类的输卵管相似1。两者均由假复层纤毛上皮构成，该上皮传统上被认为包含两种定居的上皮细胞：纤毛细胞和分泌细胞1,2。输卵管通常分为三个经典解剖节段：漏斗部、壶腹部和峡部。在最近的一项研究中，Harwalkar 等人.3 对输卵管的形态和基因表达进行了研究，将定居上皮细胞进一步细分为七个不同的细胞群体。此外，他们还确立了壶腹部-峡部交界处作为输卵管中一个独立的解剖节段3。本文所述方法主要聚焦于漏斗部、壶腹部和峡部，但也可轻松扩展至包含壶腹部-峡部交界处2,3。漏斗部区域包含输卵管的开口（即腹腔口），并包括伞部区域以及近端的柄部。从该区域向子宫方向延伸，依次为壶腹部，然后是峡部。纤毛细胞主要分布于靠近卵巢的远端区域，即漏斗部，而分泌细胞则主要集中于近端区域，即峡部1。与人类输卵管不同，小鼠输卵管是一种由阔韧带腹膜延伸形成的输卵管系膜（mesosalpinx）所支撑的盘绕结构1,4。此外，小鼠输卵管被包裹在一个输卵管系膜囊（bursal sac）内，这一结构增加了卵母细胞进入输卵管的可能性4。壶腹部是受精发生的部位，发育中的胚胎在此形成后，经由峡部进入子宫5。输卵管各节段的直径为 200–400 μm，其中较长的壶腹部和峡部长度约为 0.5–1.0 cm4。在动情周期中，输卵管会发生扩张，其中壶腹部和漏斗部的扩张能力较峡部更强1。
细胞（尤其是分泌细胞）的过度增殖是盆腔内浆液性肿瘤前体病变的特征6。这些前体性的浆液性上皮内病变仅发生于输卵管上皮的伞部区域；目前尚不清楚为何病变形成局限于这一区域，因为在正常情况下，该区域的主要细胞类型为纤毛细胞而非分泌细胞2,7,8。鉴于输卵管不同区段在正常生理功能上的区域性差异，以及近年来对卵巢癌输卵管起源的日益关注9,10,11,12,13，分别评估输卵管各节段显得尤为重要。
本文所述方法详细介绍了采集输卵管不同节段以进行后续分析，包括各节段特异性基因表达及解离细胞功能的研究。传统上，许多组织通常采用苯酚:氯仿法或柱上全提取法进行总RNA提取；然而，我们发现采用本文所述的联合方法可在获得足够产量的同时保持RNA质量。利用该方法，可对输卵管中非常微小的功能节段进行下游分析，而非将整个输卵管作为整体研究，后者可能掩盖不同节段各自具有的代表性结果14。
分离的小鼠输卵管细胞极少通过流式细胞术进行研究，这很可能是因为该组织所能提供的细胞数量有限。克服这一问题的一种方法是将细胞分离后进行体外培养，再诱导其重新分化。 体外 以获得适用于下游细胞分析的适当细胞数量15,16,17,18该方法的一个局限性是时间 离体 以及培养过程中微环境的改变，这两者均可能改变基因表达。此外，该方法还基于一种假设，即形态学上的再分化具有与完整动物体内相同的转录组和蛋白质组特征。当前的解离方法旨在从异质性的输卵管细胞群体中获得最高等量的上皮细胞，同时维持单个细胞的分化状态。此外，这种以非酶解为主的方法可能有助于减少细胞表面蛋白的丢失。
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方案
所有动物操作和实验程序均经加州大学河滨分校机构动物护理和使用委员会批准，并遵循美国实验动物护理协会、美国农业部以及美国国立卫生研究院的指导方针。本研究所采用的方法使用了成年雌性 C57BL/6 小鼠。所有动物在组织取材前均通过断头法实施安乐死。
注意：本方案使用蓝色染料以辅助高效分离和解旋输卵管，其概览见第一幅图（图1）。
图1：显微解剖方法概览。（A）左图显示完整结构，其中大部分卵巢脂肪垫及输卵管周围结缔组织残余已被去除。此后加入甲苯胺蓝，有助于区分输卵管的盘绕部分（中图）。右图显示去除卵巢后的结构。（B）解旋后的输卵管，内部弯折用于确定各段起止位置。（C）所用分段方式的示意图（未按比例绘制）。请点击此处查看此图的放大版本。
1. 解剖表面的准备
- 用胶水将一块牙科蜡固定在培养皿上，并使其干燥（图 2A）。用 70% 乙醇对培养皿表面消毒。该表面即可用于解剖操作。
2. 卵巢、输卵管和子宫的巨检解剖
- 准备解剖时，将含有牙科蜡的培养皿固定在选定的低温平台上（例如，使用前置于 -20 °C 的冰袋）并在解剖显微镜下固定（图 2A）。
- 用 70% 乙醇对动物腹侧表面进行消毒。用无菌解剖剪刀打开腹腔和骨盆腔，并将胃肠道移至一侧，以定位背侧双角子宫。沿每个子宫角向前追溯，找到被子宫脂肪垫包裹的每侧输卵管和卵巢，其位置位于肾脏下方（图 2B，C）。
- 用解剖剪刀切除两侧输卵管，连同卵巢以及部分远端子宫角一并取出。每个侧子宫角保留约 1–2 cm 的组织，仍与盘绕的输卵管和卵巢相连（图 2D）。立即将组织浸入 2 mL 冷解剖液中（见 材料表）。
图 2：卵巢的大体解剖及解剖装置示意图。 输卵管位于盆腔内肾脏基部的卵巢脂肪垫中（B）。在盆腔中定位子宫分叉处（C），并沿侧子宫角追踪至子宫-输卵管-卵巢连续结构（B）。通过切断一侧子宫角并进行粗略解剖，移除这些结构。将组织置于解剖台上（A），并用针头将子宫部分固定于牙用蜡上（A 和 D）。请点击此处查看该图的高清版本。
注意：保留足够长度的子宫角并使其与输卵管相连，以便固定到解剖平台（图 2D）。
- 用无菌的 25 G 针头将子宫组织固定在牙科蜡上，以固定组织便于解剖（图 2A、D 和 图 3A）。在解剖显微镜下操作，清除卵巢脂肪垫和结缔组织，以便清晰观察输卵管（图 3B）。
图3：输卵管显微解剖的逐步操作。 在去除残留的脂肪和结缔组织后（A,B），向组织中加入甲苯胺蓝（C），然后冲洗以增强可视化效果，并便于后续去除卵巢及展开输卵管（D–H）。漏斗部位于近端峡部和子宫-输卵管连接处（UTJ）旁侧。在剪开输卵管系膜的同时，轻轻牵拉输卵管远端，以展开并揭示输卵管固有的弯曲结构（H），从而为准确分段提供方向参考。图A–C 比例尺 = 500 μm，D–H 比例尺 = 400 μm（I）各管段的示意图（未按比例绘制）。请点击此处查看该图的放大版本。
- 使用1 mL注射器，将附着于子宫的输卵管置于1–2滴无菌1%甲苯胺蓝染色液中，孵育30秒至1分钟。用冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗，并吸除所有液体图3C).
- 轻轻将卵巢从盘绕的输卵管中拉出，剪除卵巢系膜和宽韧带，以在不损伤输卵管组织的情况下将卵巢从输卵管上分离。图3D，E).
注意：卵巢并未与输卵管直接相连，而是与输卵管一同包裹在输卵管系膜内图 2D）并连接至子宫的外侧壁 通过 阔韧带
3. 输卵管的显微解剖与分割
- 找到位于子宫-输卵管连接处（UTJ）外侧的输卵管远端伞部。输卵管呈盘绕状，因此伞部可位于近端的外侧，是解旋输卵管时合适的起始点（图3F，I）。
- 在轻柔牵拉输卵管的同时，使用弹簧式显微剪刀剪除输卵管系膜（图3I），以实现输卵管的解旋（图3G）。
- 解旋后，将输卵管切断，以获得漏斗部、壶腹部和峡部（图3H）。
- 切除漏斗部（即伞部末端及其近端柄部）后，通过在输卵管第二处明显弯曲之后进行切割（在第二与第三弯曲之间切割，长度约1 cm），分离出壶腹部。最后，将剩余部分从该处切割至子宫-输卵管连接处（UTJ），此段即为峡部（图3H）。
注意：输卵管不会完全解旋成一条直线结构，仍会保留其弯曲形态（图3H）3。根据壶腹部之后的连续弯曲情况，可进一步将剩余输卵管细分为壶腹-峡部连接段和峡部3。在切除壶腹部后，于第五与第六弯曲之间切割，即可获得壶腹-峡部连接段；剩余部分（第六弯曲至UTJ起始处）即为峡部3。
- 切除漏斗部（即伞部末端及其近端柄部）后，通过在输卵管第二处明显弯曲之后进行切割（在第二与第三弯曲之间切割，长度约1 cm），分离出壶腹部。最后，将剩余部分从该处切割至子宫-输卵管连接处（UTJ），此段即为峡部（图3H）。
- 立即将分离的组织片段在液氮中快速冷冻，用于RNA提取；或对各段组织进行固定并处理，用于定向包埋及免疫组织化学分析。
- 若进行RNA提取（参见步骤5.1），向组织中加入200 μL预冷的RNA提取试剂和1:1的匀浆珠混合液（见材料表）。
4. 输卵管解离
- 接上述步骤 3.1.1）为了最佳解离上皮组织，尽可能在输卵管的某些区域（即漏斗部和壶腹部）将其纵向切开，以暴露管腔上皮（图 4A）。
图 4：输卵管细胞解离，第 1 部分。 示意图展示如何暴露远端上皮以实现最佳的细胞解离（A），以及图像展示使用 1 mm2 网格的最简便方法（B）。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 从伞部区域开始，利用镊子作为支点，用弹簧剪沿纵向切开输卵管。
- 将切开的部分和剩余的输卵管切成小段（约1-2 mm大小），加入5 mL预热的非酶解离缓冲液（参见材料表），于37 °C孵育。
- 每3分钟用移液球吹打重悬组织块和解离的细胞一次，持续9-10分钟。用冷解剖液将解离缓冲液稀释1:1。
- 离心收集细胞（350 × g，3分钟，4 °C）。将细胞重悬于2 mL红细胞裂解缓冲液中，室温孵育2分钟，然后用冷解剖液1:1稀释。
- 离心收集细胞（350 × g，3分钟，4 °C），并重悬于5 mL冷pronase溶液中。
- 在pronase消化液中孵育，并每3-5分钟用移液球吹打重悬细胞团块，直至获得单细胞悬液（约25-30分钟）。
注意：此步骤最好在组织培养板或培养瓶中进行，以便持续观察，避免细胞过度暴露于pronase。
- 在pronase消化液中孵育，并每3-5分钟用移液球吹打重悬细胞团块，直至获得单细胞悬液（约25-30分钟）。
- 将细胞通过无菌大孔滤网（1 mm × 1 mm网孔，用橡皮圈固定于锥形管上（图4B））过滤，以去除未完全解离的组织碎片。离心收集细胞（350 × g，3分钟，4 °C），并将其重悬于适合后续分析的冷培养基中（例如，若进行流式细胞术染色，则使用FACS缓冲液）。
5. 输卵管节段的RNA提取
- 使用不锈钢珠混合物，在珠磨式组织匀浆器中，于4 °C条件下以12级速度，分两个时段（每个3分钟）将速冻样品在200 µL RNA提取试剂中充分匀浆。
注意：为保持RNA完整性，应立即将速冻样品直接加入RNA提取试剂中，不得称重。 - 在台式离心机中，于室温下以100-200 × g 短暂离心匀浆液约5秒，使液体与珠子分离。将上清液转移至新离心管中。
- 向珠子中再加入200 µL RNA提取试剂以回收更多样品，随后进行离心（100-200 × g，5秒，室温）。合并上清液。
注意：使用小型移液器吸头（大多数p200吸头适用），以避免转移上清液时带出珠子。 - 按照制造商说明书进行相分离并沉淀RNA。代表性样品使用100%异丙醇（体积比约为2:1，异丙醇：回收的水相）在-20 °C下沉淀过夜。
- 将全部RNA沉淀连同溶液转移至RNA结合柱中，在9,500 × g 条件下离心30秒。按照制造商说明书在柱上纯化RNA，然后用20 µL无核酸酶水洗脱RNA。使用微量分光光度计和/或生物分析仪检测RNA的质量和浓度。
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结果
所述解离方案每只小鼠可获得100,000–120,000个细胞（合并双侧输卵管组织）。该方法足够温和，能够保持多纤毛细胞边界的完整性，从而可区分多纤毛细胞与分泌细胞，并验证消化方法的温和性足以防止去分化。代表性免疫荧光图像见图5，显示在完成步骤4.2.1后出现的小细胞团簇，经4%多聚甲醛（PFA）/ DPBS固定3分钟，用1%牛血清白蛋白（BSA）/ Tris缓冲盐水-Tween（BTBST）洗涤，并在悬浮状态下进行染色。简言之，细胞在0.5% TritonX-100/BTBST中室温通透15分钟，用BTBST洗涤，随后在20 mM甘氨酸/ DPBS中室温封闭背景荧光2小时，再用BTBST洗涤，然后在5% BSA/ 0.1% TritonX-100/ TBST中室温封闭1小时。接着，细胞在BTBST中加入一抗，4 °C孵育过夜（小鼠抗小鼠occludin抗体（1:2000）；兔抗小鼠乙酰化微管蛋白抗体（1:1000）），之后多次用BTBST洗涤。二抗在BTBST中室温孵育1小时（山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 555（1:1000）；山羊抗兔IgG Alexa Flu...
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讨论
输卵管的三个节段在组织学、形态学和功能上均具有明显差异1,2,3。从输卵管的一端到另一端，上皮结构存在显著差异。在伞部/漏斗部末端以纤毛细胞为主，而在峡部区域则以分泌细胞为主1。尽管这种整体梯度分布已被认识多年，但近期研究揭示了输卵管各节段之间更多的区别。例如，虽然纤毛细胞在向输卵管近端延伸过程中逐渐减少，但在从壶腹部过渡到壶腹部-峡部连接处时，其数量出现急剧下降（纤毛细胞比例从约60%降至10%）3。此外，近端和远端节段的上皮细胞群体来源于发育上不同的细胞谱系1,2,3。谱系追踪上皮标志物的研究表明，漏斗部和壶腹部的远端上皮细胞并不参与构成峡部的近端上皮细胞群体。在胚胎发...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国防部突破奖（DoD Breakthrough Award）资助，授予 AMW（BCRP W81XWH-14-1-0425）。KCR 部分受以下机构内资助项目支持：Pease 癌症博士前奖学金、生物医学科学 Mary Galvin Burden 博士前奖学金，以及加州大学河滨分校校内奖项：研究生委员会论文研究资助和研究生院论文年度项目奖。作者感谢 Gillian M. Wright 和 Alyssa M. Kumari 在本方法早期故障排查过程中提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mm 不锈钢珠混合物 | Next Advance | SSB05 | 与 1.4 mm SSB14B 按 1:1 混合，已灭菌 |
| 1.4 mm 不锈钢珠混合物 | Next Advance | SSB14B | 与 0.5 mm SSB05 按 1:1 混合，已灭菌 |
| 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 A，pH 7.4（DPBS） | Gibco | 21600-010 | 冷藏，无菌 |
| 25G 针头 | BD | 305122 | |
| 60 mm 无菌培养皿 | Corning | 430166 | |
| 70 μm 细胞筛网 | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent 真核生物总 RNA 6000 Pico 芯片试剂盒 | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender 组织匀浆仪 | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A7906 | |
| 所选冷板/冰袋/冷表面 | N/A | N/A | 保持在 -20 °C 用于解剖 |
| 牙科蜡 | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM）/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | 配制解剖培养基：DMEM / Ham’s F12，10% FBS，25 mM Hepes，1% 青霉素-链霉素 |
| 胎牛血清 | Corning | 35-015CV | |
| 所选精细尖头镊子 | N/A | N/A | |
| 甘氨酸 | Sigma Aldrich | G712b | 免疫细胞化学验证图像 |
| 山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | 免疫细胞化学验证图像 |
| 山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 免疫细胞化学验证图像 |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | 免疫细胞化学验证图像 |
| 倒置复合显微镜 | Keyence BZ-X700 | ||
| 小鼠抗小鼠 Occludin 抗体 | Invitrogen | 33-1500 | 免疫细胞化学验证图像 |
| 非酶解离缓冲液 | N/A | 5 mM EDTA，1 g/L 葡萄糖，0.4% BSA，1× DPBS | |
| 尼龙大孔筛网 1 mm × 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P-6148 | 免疫细胞化学验证图像 |
| 青霉素-链霉素（Pen-Strep） | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Cell Signaling Technologies | 9071S | 免疫细胞化学验证图像：抗荧光淬灭封片介质 |
| 蛋白酶 K（Pronase） | Sigma Aldrich | 10165921001 | 配制蛋白酶消化液：0.15% Pronase 溶于 DMEM/Ham's F12，无菌 |
| 碘化丙啶 | Roche | 11 348 639 001 | 活力验证图像 |
| 兔抗小鼠乙酰化微管蛋白抗体 | Abcam | ab179484 | 免疫细胞化学验证图像 |
| 红细胞裂解缓冲液 | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74134 | 文中用于柱上纯化 |
| 弹簧式显微解剖剪 | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| 无菌 3 mL 吸头移液器 | Globe Scientific | 137135 | |
| 甲苯胺蓝 | Alfa Aesar | J66015 | 配制甲苯胺蓝溶液：1% 溶于 1× DPBS，无菌 |
| Tris 缓冲盐水-Tween（TBST） | N/A | N/A | 免疫细胞化学验证图像；0.1 N NaCl，10 mM Tris-Cl pH 7.5，1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | 免疫细胞化学验证图像 |
| Trizol RNA 提取试剂 | Invitrogen | 15596026 | 文中称为 RNA 提取试剂。进行 Trizol 提取时需补充无核酸酶水、氯仿和异丙醇，按制造商指南操作 |
参考文献
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