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通过经皮栓塞线圈置入建立猪心肌梗死模型

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DOI：

10.3791/63172

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2021年11月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ICREC Research Program, Germans Trias i Pujol Health Research Institute (IGTP), 2Faculty of Medicine, University of Barcelona (UB), 3Heart Institute (iCOR), Germans Trias i Pujol University Hospital, 4CIBER Cardiovascular, Instituto de Salud Carlos III

* These authors contributed equally

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摘要

模拟人类疾病自然进程的心肌梗死（MI）动物模型对于理解病理生理机制以及测试新兴疗法的安全性和有效性至关重要。本文介绍了一种通过经皮植入栓塞线圈建立的心肌梗死猪模型。

摘要

心肌梗死（MI）是全球范围内导致死亡的首要原因。尽管已采用基于证据的治疗方法，包括冠状动脉血运重建和心血管药物，仍有相当比例的患者在心肌梗死后出现病理性左心室重构及进行性心力衰竭。因此，已开发出包括细胞治疗和基因治疗在内的多种新型治疗手段，以修复和再生受损心肌。在此背景下，心肌梗死的动物模型对于探索这些实验性疗法在临床转化前的安全性和有效性至关重要。由于猪的心脏在冠状动脉解剖结构、心脏动力学以及心肌梗死后愈合过程方面与人类心脏高度相似，因此相较于小型动物，大型动物模型（如猪）更受青睐。本文旨在描述一种通过永久性弹簧圈置入建立猪心肌梗死模型的方法。该方法主要包括经股动脉逆行途径进行经皮选择性冠状动脉插管。在完成冠状动脉造影后，在透视引导下将弹簧圈释放至目标分支。最后通过重复冠状动脉造影确认完全闭塞。该技术可行性强、可重复性高，能够模拟人类未接受血运重建的心肌梗死发病过程，同时避免了传统开胸手术及其术后炎症反应。根据随访时间的不同，该技术适用于急性、亚急性或慢性心肌梗死模型。

引言

心肌梗死（MI）是全球范围内导致死亡、疾病和残疾的最常见原因1。尽管现有的治疗手段已取得进展，仍有相当比例的患者在发生心肌梗死后出现不良的心室重构和进行性心力衰竭，进而因心室功能障碍和猝死而导致预后不良2,3,4。因此，目前正在积极探索用于修复和/或再生受损心肌的新疗法，而转化型心肌梗死动物模型在评估这些疗法的安全性和有效性方面至关重要。尽管已有多种动物模型被用于心血管研究，包括大鼠5,6、小鼠7,8、犬9和绵羊10，但猪因其在心脏大小、冠状动脉解剖结构、心脏动力学、生理学、代谢以及心肌梗死后愈合过程等方面与人类高度相似，成为研究心肌缺血的最佳模型之一11,12,13,14,15。

在此背景下，有多种不同的开放手术和经皮方法可用于建立心肌梗死（MI）猪模型。开胸法需进行左侧开胸术，适用于实施冠状动脉结扎16,17、心肌冷冻损伤、电灼12以及放置液压阻断器18或缩窄性美洲环19等操作。外科冠状动脉闭塞已被广泛用于评估心脏组织工程和细胞治疗等新型疗法，因其可提供充分的手术通路并对心脏进行直观评估；然而，与人类心肌梗死相比，该方法可能导致手术粘连、邻近组织瘢痕形成以及术后炎症反应17。心肌冷冻损伤和电灼是易于重复的技术，但无法模拟人类心肌梗死的病理生理进展过程12。另一方面，已开发出多种经皮技术以实现暂时性或永久性冠状动脉阻塞，包括经冠状动脉或冠内注射乙醇消融20,21、球囊血管成形术阻塞22，以及注射血栓形成物质如琼脂糖凝胶微珠23、纤维蛋白原混合物9,或弹簧圈栓塞17,24。其中，球囊血管成形术更适用于缺血/再灌注研究，而冠状动脉内释放弹簧圈则是模拟非再血管化心肌梗死的最佳选择之一。这种经皮方法可行性强、结果稳定可重复，且避免了开胸手术。它能够精确定位梗死部位，所产生的病理生理变化与人类非再灌注性心肌梗死相似。此外，弹簧圈栓塞适用于模拟急性、亚急性或慢性心肌梗死、慢性充血性心力衰竭以及瓣膜性疾病17。

本实验方案旨在介绍如何通过永久性弹簧圈置入建立心肌梗死（MI）猪模型。简而言之，该方法包括经股动脉逆行途径进行经皮选择性冠状动脉插管。在完成冠状动脉造影后，在透视引导下将弹簧圈释放至目标分支动脉。最后，通过重复冠状动脉造影确认完全闭塞。

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方案

本研究经德国斯·特里亚斯·普霍尔健康研究所（IGTP）动物实验单位伦理委员会和政府主管部门（加泰罗尼亚自治区；批准编号：10558 和 11208）批准，并严格遵守《实验动物护理与使用指南》25 中规定的有关动物在科研与教学中使用的全部指南要求。

1. 动物术前准备

  1. 使用杂交长白猪 × 大白猪（30–35 kg），性别不限。
  2. 术前 12 小时将动物保持禁食状态。

2. 镇静、麻醉与镇痛

  1. 通过肌肉注射（IM）给予氯胺酮（3 mg/kg）、咪达唑仑（0.3 mg/kg）和右美托咪定（0.03 mg/kg）对动物进行镇静。等待约10-15分钟。
  2. 猪只镇静后，使用面罩通入氧气（90-100%）-异氟烷（1-2%）混合气体，以确保充分镇静。
  3. 在猪的眼睛上涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
    注意：每20分钟重复一次。
  4. 在耳缘静脉建立静脉通路（20 G导管），静脉注射丙泊酚（1-2 mg/kg）以诱导麻醉。
  5. 当猪无吞咽反射时，使用气管插管（30-35 kg猪选用6.5-7.0号）进行气管插管。
    注意：应根据猪的体型调整气管插管尺寸。插管操作应迅速完成，以避免麻醉过深及长时间呼吸暂停。
  6. 术中静脉给予布托啡诺（0.01 mg/kg）用于镇痛；术后使用芬太尼透皮贴剂（100 µg/h）进行镇痛。
    注意：芬太尼贴剂应贴于腹股沟皮肤，可持续作用72小时以减轻术后疼痛。其药理作用不会在贴敷后立即起效，因此应在手术开始前预先贴敷。
  7. 在将猪转运至血管介入放射学（VIR）室期间，使用人工呼吸气囊装置进行通气（20次/分钟，共20次通气）。
  8. 将气管插管连接至配备气道传感器和二氧化碳波形监测（capnography）的麻醉机。
  9. 开始机械正压通气，吸入氧浓度（FiO2）设为0.50，潮气量为10 mL/kg，呼吸频率为16-20次/分钟。以异氟烷（1-3%）维持麻醉。
    ​注意：为确认达到合适的外科麻醉深度，动物应无自主呼吸，且无角膜反射或瞳孔对光反射。

3. 血流动力学监测与手术区域准备

  1. 将动物仰卧位放置于手术台上，并用胶带或绷带固定四肢。
  2. 将心电图（ECG）导联探头置于动物四肢皮下，用于记录实验过程中ST段、T波及心率的变化。
  3. 将脉搏血氧仪置于动物舌部或口唇一角，并将无创血压袖带置于前肢。
  4. 使用探头测量直肠/食管温度。
  5. 在无菌条件下，先用外科皂液清洁右侧股部区域，再交替使用聚维酮碘溶液和酒精重复清洗三次。
  6. 确保术者完成外科手消毒，并穿戴无菌手术衣和无菌手套。
  7. 用无菌手术巾覆盖动物。
  8. 准备好以下器械并用肝素化生理盐水冲洗：穿刺针、6F血管鞘、0.035英寸J型头导丝、6F JR4 90厘米引导导管、0.014英寸 200厘米导丝、150厘米长/内径0.017英寸微导管，以及造影剂注射三通套件。

4. 血管通路

  1. 通过超声引导的经皮穿刺方法穿刺右侧股动脉。定位股浅动脉与股深动脉之间的分叉处。
  2. 将换能器置于分叉近端2-3 cm处的股总动脉内，并使换能器中心与股总动脉对齐。
  3. 将针置于换能器中心，以约45°的角度穿刺动脉°随后，采用改良的塞丁格技术插入6F血管鞘26.
    注意：若出现明显痉挛或血肿，可转至对侧股动脉。
  4. 用肝素化生理盐水冲洗导管。（5000 IU 未分馏肝素/1000 mL 0.9% NaCl）
  5. 通过鞘管给予肝素（300 IU/kg）。

5. 冠状动脉造影

  1. 将J型导丝插入JR4导引导管中，并通过鞘管将导丝推进至升主动脉，然后将导管沿瓣膜面送入。
  2. 取出导丝，并将导管连接至注射接头系统，对整个系统进行冲洗排气。
  3. 在X线透视引导下，将导管插入左主冠状动脉，注入10 mL碘对比剂以显示左冠状动脉系统（图1A，C）。
    注意：注射对比剂前必须确认动脉压力波形未受阻尼，以避免冠状动脉夹层的风险。
  4. 在两个正交投照体位下进行血管造影：左前斜40°和右前斜30°投照。
  5. 在X线透视引导下，将预装于微导管上的0.014英寸导丝送至前降支中段（LAD）或回旋支远端（LCX）冠状动脉。

6. 栓塞线圈植入

  1. 在X线透视引导下，将微导管沿导丝推进至预定位置，以释放弹簧圈。若需闭塞前降支（LAD），应将弹簧圈置于第一对角支远端；若需闭塞左回旋支（LCX），则应将弹簧圈置于第一钝缘支远端。
    注意：近端放置（位于第一对角支或第一钝缘支之前）的存活率极低。
  2. 撤出导丝，选择合适的弹簧圈。
    注意：正确选择弹簧圈的尺寸和长度至关重要。过小或过短的弹簧圈可能无法在血管腔内稳定定位，且因造影剂注射或自发原因发生远端移位的风险很高，从而导致梗死面积较小。过大或过长的弹簧圈可能向血管近端脱垂，造成超出预期的较大梗死范围。若使用不可见弹簧圈（non-detectable coils），正确选择尤为重要，因其一旦释放便无法取出。理想的弹簧圈直径应比目标血管内径大1–2 mm，长度通常选择20–60 mm，适用于体重30–40 kg的猪。
  3. 通过微导管输送弹簧圈，并在X线透视下缓慢注入5 mL碘造影剂，以确认弹簧圈位置正确。
  4. 将微导管撤回至指引导管内，随后将指引导管置于侧支血管中，以便进行对照造影，并确保在需要植入第二枚弹簧圈时仍可顺利进入目标动脉。
  5. 等待弹簧圈诱发血栓形成并完全闭塞血管。
    ​注意：当血管闭塞时，心电图可出现相应改变。另一种判断动脉是否完全闭塞的方法是每隔10分钟缓慢注射碘造影剂进行造影观察（图1B，D）。若在20–30分钟内血管仍未闭塞，则可能需要植入第二枚弹簧圈。

7. 手术结束

  1. 动脉阻塞后，持续静脉输注利多卡因（50–100 µg/kg/min），至少维持1小时，以预防心律失常发作。
  2. 进行血管造影，确认阻塞远端无血流通过。
  3. 撤出导丝、微导管和引导导管。
  4. 拔除鞘管，并手动压迫20分钟。

8. 术后操作与动物恢复

  1. 通过心电图、直肠温度、脉搏血氧饱和度和二氧化碳监测，持续监测动物直至其完全恢复。
    注意：若出现室性心律失常，给予利多卡因静脉推注（1.5–3.5 mg/kg）。
  2. 给予泰拉霉素肌肉注射（2.5 mg/kg），作为预防性术后抗生素治疗。术后镇痛在手术前（步骤 2.6）贴用透皮芬太尼贴剂。
  3. 关闭异氟烷，继续维持机械通气，直至动物开始自主呼吸。
  4. 当猪恢复吞咽反射后，拔除气管插管。注意：拔管前后应确认动物血氧饱和度（SpO2）良好（高于 95%）。
  5. 将动物转移至单独笼舍。将其置于热水毯上，并用保温布覆盖，以防止术后低体温。
    注意：在动物完全恢复前，不得将其与其他动物合笼饲养。
  6. 持续监测动物，直至其意识充分恢复，能够维持胸卧位。

9. 术后疼痛评估与监测

  1. 术后随访期间，监测动物的一般状况，包括呼吸频率、食物和水的摄入量、活动情况及与其他个体的互动、皮肤的外观和色泽，以及手术伤口的恢复情况。
  2. 根据以下评分标准执行每日监管方案： - 体重：
    0：正常
    1：体重减轻 <10%
    2：体重减轻 10–20%
    3：体重减轻 >20%

    - 体况：
    0：良好：脊椎、骨盆或脊柱骨骼不明显
    2：一般：可见脊柱分节，可触及骨盆骨骼
    3：消瘦：骨骼极为突出，肌肉极少或缺失

    - 行为：
    0：正常：在环境中活跃且具有互动性
    1：活动轻微减少，互动性降低
    2：异常：活动明显减少，独处
    3：异常：不动或过度活跃，可能自残

    - 外观：
    0：正常：皮肤/毛发有光泽，眼睛明亮
    1：毛发干枯，皮肤/毛发无光泽
    2：皮肤状况差/鼻部分泌物
    3：皮肤状况差，姿势异常或弓背

    - 行为障碍：
    0：无
    1：无法正常移动
    2：无法接近食物/饮水，与其他动物隔离
    3：企图躲藏/蜷缩角落，对刺激无反应（濒死）

    - 临床症状：
    0：无
    1：低体温、发热、轻度呼吸功能障碍
    2：手术伤口感染，伴有黏液-血性分泌物的中度呼吸功能障碍
    3：心力衰竭，严重呼吸功能障碍（发绀、张口呼吸）

    评分：
    - 1–5分：每日监管一次动物。
    - 6–12分：必要时给予支持治疗。
    - 任一参数评分为3分或总评分 >12分的动物将实施安乐死。

    注：动物应由动物护理人员每日监测，研究团队和兽医团队每周监测两次。
  3. 尽管该操作预期不会引起疼痛和痛苦，但若任何动物出现疼痛迹象，应给予镇痛治疗（曲马多，口服，2–4 mg/kg，每日一次）。若动物对镇痛药物无反应并表现出慢性疼痛迹象（极低概率），则以麻醉过量实施安乐死（硫喷妥钠，静脉注射，200 mg/kg）。
  4. 尽管已给予抗生素治疗，若手术伤口仍出现感染迹象（低概率），应每日处理伤口，并启动新的抗生素治疗方案（硫酸头孢喹诺，肌内注射，2 mg/kg，每日一次）。

10. 安乐死方法

  1. 在先前所述的镇静和麻醉条件下，给予静脉注射过量硫喷妥钠（200 mg/kg）。
  2. 通过监测生命体征（心电图、血压、二氧化碳监测）确认心肺停止及死亡。

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结果

心肌梗死的存活率与位置
共有57头猪接受了冠状动脉分支的弹簧圈植入，其中25头（12头雌性，13头雄性）在左回旋支（LCX）的边缘支植入，32头（16头雌性，16头雄性）在前降支（LAD）的第一与第二对角支之间植入，并在术后随访30天。在LCX边缘支诱发心肌梗死（MI）的动物中，存活率为80%（n = 20）。3头猪在弹簧圈释放前因房室（AV）传导阻滞和停搏等致命性并发症死亡，2头猪在弹簧圈植入后因透壁性心肌梗死引发的室颤（VF）死亡。在LAD支诱发心肌梗死的动物中，存活率为72%（n = 23）：1头猪在弹簧圈释放后因AV传导阻滞和停搏死亡，8头动物因室颤死亡（5头在弹簧圈释放后立即死亡，2头在心肌梗死后12–48小时死亡，1头在心肌梗死后26天死亡）。LCX边缘支（直径2–2.5 mm）与中段LAD（直径2.5–3 mm）心肌梗死模型的存活率存在差异，这可能归因于LAD模型中心肌梗死范围更大。

所有动物在心肌梗死（MI）后30天进行磁共振成像（MRI）分析。图2展示了左回旋支（...

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讨论

在冠状动脉中放置的线圈可提供一种可重复且稳定的猪非再灌注心肌梗死（MI）临床前模型，可用于开发和测试新的心血管治疗策略。

在我们的操作中，随访期间的死亡率为19%，主要与心肌梗死（MI）的并发症相关，且大多发生在手术后的最初24小时内。所有这些死亡事件均与未再灌注心肌梗死的自然病程相关，是本研究的主要结局指标。本方案中最关键的步骤之一是微导管进入冠状动脉的操作。在某些情况下，推进微导管可引发迷走神经反应，导致严重低血压、房室传导阻滞，最终出现心脏停搏。然而，可通过在推进微导管前静脉推注肾上腺素（0.001 mg/kg）来避免此类情况。另一类并发症为恶性心律失常，可能引发心室颤动（VF）。此类事件通常发生在心肌梗死建立后约30分钟。我们建议 持续输注利多卡因（50–100 µg/kg/min），至少维持1小时，以降低室性心律失常的风险。作为替代方案，也可持续输注胺碘酮（50–80 µg/kg/min）。然而，若发生室性心律失常事件，建议给予利多卡因冲击剂量（1.5–3.5 mg/kg）。若出现严重心动过缓，建议给予阿托品冲击剂量（0.01 mg/kg）；对于轻度或中度低血压...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

我们感谢加泰罗尼亚比较医学与生物成像中心（CMCiB）及其工作人员在动物模型实施过程中所做出的贡献。本研究得到了卡洛斯三世健康研究所（PI18/01227、PI18/00256、INT20/00052）、西班牙心脏病学会以及加泰罗尼亚自治区政府[2017-SGR-483]的资助。本研究还获得了细胞治疗网络—TerCel[RD16/0011/0006]和心血管CIBER[CB16/11/00403]项目的支持，属于国家研发计划的一部分，并由ISCIII-评估总局和欧洲区域发展基金（FEDER）共同资助。Fadeuilhe博士获得了西班牙心脏病学会（西班牙马德里）提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6-F JR4 0-71"引导导管MedtronicLA6JR406F JR4 90 cm 引导导管
肾上腺素 1 mg/mLB.Braun国家编码 (NC). 602486肾上腺素
阿托品 1 mg/mLB.BraunNC. 635649阿托品
贝塔碘MylanNC. 694109-1聚维酮碘溶液
Bupaq 0.3 mg/mLRichter Pharma AGNC. 578816.6丁丙诺啡
Dexdomitor 0.5 mg/mLOrion PharmaNC. 576303.3右美托咪定
DraxxinZoetisNC. 576313.2泰拉菌素
EMERALD 导丝Cordis502-5850.035英寸J型头导丝
体外除颤器DigiCareCS81XVET手动体外除颤器
Fendivia 100 µg/hTakedaNC. 658524.5芬太尼透皮贴剂
导丝导入针 18 G x 7 cmArgonGWI1802导入针
肝素 1%ROVINC. 641647.1肝素
Hi-Torque VersaTurn FAbbott1013317J0.014英寸 200 cm 导丝
IsoFloZoetis50019100异氟烷
KetamidorRichter Pharma AG,NC. 580393.7氯胺酮
利多卡因 50 mg/mLB.BraunNC. 645572.2利多卡因
MD8000vetMeditech EquipmentMD8000vet多参数监护仪
咪达唑仑Laboratorios NormonNC. 624437.1咪达唑仑
Prelude.6F.11 cm (4.3").0.035" (0.89 mm).50 cm (19.7").双端.不锈钢.6F.16MeritPSI-6F-11-0356F 血管鞘
Propovet Multidosis 10 mg/mLZoetisNC. 579742.7丙泊酚
RENEGADE STC-18 150/20/STRAIGHT/1ROBoston ScientificM001181370长度150 cm，内径0.017英寸的微导管
RuschelitTeleflex112482带球囊的气管插管 (#6.5)
SPUR IIAmbu325 012 000气道面罩袋通气装置 (AMBU)
Vasofix 20 GB.Braun426909820 G 套管针
Visipaque 320 mg/mL USB 10 x 200 mLGeneral Electrics1177612含碘造影剂
VortX-18 Diamond 3 mm/3.3 mmBoston ScientificM0013822030栓塞微圈
WATO EX-35MindrayWATO EX-35Vet麻醉机

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Formal Correction: Erratum: Myocardial Infarction by Percutaneous Embolization Coil Deployment in a Swine Model
Posted by JoVE Editors on 5/26/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Myocardial Infarction by Percutaneous Embolization Coil Deployment in a Swine Model. The Protocol and Discussion sections were updated.

Step 3.5 was updated from:

Clean the right femoral area with surgical soap and antiseptic povidone-iodine solution under sterile conditions

to:

Clean the right femoral area with surgical soap followed by alternating antiseptic povidone-iodine solution and alcohol 3 times under sterile conditions.

Section 9 was updated from:

9. Euthanasia method

  1. Under previous sedation and anesthesia, as previously described, administer an IV sodium thiopental overdose (200 mg/kg).
  2. Confirm cardiorespiratory arrest and death by monitoring vital signs (electrocardiogram, blood pressure, capnography).

to:

9. Postoperative pain assessment and monitoring

  1. During the post-surgical follow-up, monitor the general condition of the animals, including the respiratory rate, food and water intake, activity and interaction with the other individuals, appearance and coloration of the skin, and the evolution of the surgical wound.
  2. Apply a daily supervision protocol according to the following scoring criteria:
    - Weight:
    0: Normal
    1: <10% weight loss
    2: 10-20% weight loss
    3:> 20% weight loss

    - Body condition:
    0: Good: non-prominent vertebrae, pelvic or spinal bones
    2: Regular: evidence of spinal segmentation, palpable pelvic bones
    3: Emaciation: extremely marked skeleton, little or no meat to cover

    - Behavior:
    0: Normal: Active and interactive in your environment
    1: Slight decline in activity and less interactive
    2: Abnormal: pronounced decline in activity, isolated
    3: Abnormal: Immobile or hyperactivity, possible self-harm

    - Physical appearance:
    0: Normal: skin/hair shiny and eyes bright
    1: Disappears embalming, skin/hair without shine
    2: Poor skin/nasal secretions
    3: Poor skin, abnormal or hunched posture

    - Behavioral disorders:
    0: None
    1: Inability to move normally
    2: Unable to reach food/drink, isolated from other animals
    3: Intention to hide/corner, does not respond to stimuli (dying)

    - Clinical signs:
    0: None
    1: Hypothermia, fever, mild respiratory failure
    2: Infection of the surgical wound, moderate respiratory failure with muco-bloody secretions
    3: Heart failure, severe respiratory failure (cyanosis, open mouth)

    Score:
    - 1-5: Supervise the animals once a day.
    - 6-12: Provide supportive therapy if necessary.
    - Any animal with a score of 3 in any of the above parameters or with a total score >12 will be euthanized.
    NOTE: The animals should be monitored daily by the animal care staff and twice a week by the research and veterinary team.
  3. Although no pain and distress are expected from the procedure, if any animal shows signs of pain, give analgesic therapy (tramadol, oral, 2-4 mg/kg, daily). If any animal does not respond to analgesic medication and shows signs of chronic pain (very low probability), euthanize the animal with an anesthetic overdose (sodium thiopental, IV, 200 mg/kg).
  4. If the surgical wound shows signs of infection (low probability) despite the antibiotic therapy administered, treat the wound daily and initiate a new antibiotic regimen (cefquinome sulphate, IM, 2 mg/kg, daily).

10. Euthanasia method

  1. Under previous sedation and anesthesia, as previously described, administer an IV sodium thiopental overdose (200 mg/kg).
  2. Confirm cardiorespiratory arrest and death by monitoring vital signs (electrocardiogram, blood pressure, capnography).

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