用于评估眼内治疗辅料和药物毒性的器官培养系统

摘要

本实验方案的目的是评估晶状体在实验处理后其代谢活性和屈光功能的变化。

摘要

白内障是导致失明的主要原因，全球数以千万计的患者因此承受着巨大的负担。已知化学物质暴露等环境因素是引发白内障的明确原因。眼毒性测试可用于评估药物及其成分是否可能导致晶状体损伤，进而引发白内障，或有助于白内障的治疗。

体外 研究和 在体内 动物实验可用于在临床研究之前评估化学品的安全性。Draize试验——目前的 体内 用于眼部毒性和刺激性测试的标准因缺乏敏感性和客观的眼部毒性评估指标而受到批评。 体外 基于细胞的检测方法存在局限性，因为细胞培养无法适当地模拟完整且具有正常功能的晶状体。

此处所述方法具有高灵敏度 体外 替代动物实验的方法，旨在评估完整牛晶状体在细胞活性水平及整体屈光性能方面对处理的反应。非毒性试剂刃天青的代谢量与细胞活性水平成正比。晶状体激光扫描检测法可测量晶状体将入射光束折射至单一焦点的能力，误差最小化，直接关联其自然功能。该方法可用于确定晶状体的急性与延迟性变化，以及其在化学或环境暴露后的恢复情况。

引言

白内障是全球最普遍的致盲原因，影响超过2000万人^1,2。白内障通常由晶状体的年龄相关性改变引起，但也可能由外伤、遗传性疾病、其他疾病或毒性暴露诱发²。目前，白内障的治疗需要通过手术置换晶状体，这是一种昂贵且具有侵入性的操作，主要在发达国家可及。由于白内障造成的巨大负担，数十年来研究一直致力于白内障的预防以及非手术治疗方法的开发。在这两类研究中，眼科药物在临床前阶段的毒性、有效性和药代动力学测试至关重要。药物研发过程高度依赖动物实验所提供的信息。

当前眼毒性测试的标准方法 体内 是一种将待测化合物施加于活体动物结膜囊内的Draize试验。该试验受到广泛批评，主要涉及动物伦理问题，以及主观性强、重复性差和结果变异性大等问题。³此外，德莱兹试验没有任何组分能够直接监测受试物质对晶状体的影响。研究人员已投入大量精力开发替代方法 体外 模型⁴然而，目前尚无一种方法得到充分验证以取代德莱兹测试⁵同样，这些模型中的许多在直接应用于白内障及其他复杂病理情况时存在局限性⁶例如，将晶状体置于网格上评估其透明....

方案

所有实验方案均按照滑铁卢大学关于使用动物组织进行研究的伦理政策执行。本研究所用的牛眼来自屠宰场，取自死亡后数小时内非乳牛品种的牛，并立即进行解剖，从获取眼球到完成解剖的过程最长不超过8小时。为保持无菌状态和解剖质量，眼球应尽快解剖。培养基需配制至pH值为7.4，并在添加FBS²¹前进行无菌过滤。所有操作均在无菌条件下进行，所用材料和设备来源见材料表。

1. 牛晶状体培养

1. 通过从巩膜上剥离眼外肌和组织，移除眼球后半部分及玻璃体，连同晶状体一起移除虹膜和睫状体，然后切断悬韧带附着，最终切割的位置应使晶状体落入盛有培养基的培养室中，从而完成晶状体的解剖。
2. 将解剖后的晶状体置于定制的培养室中进行培养，培养室底部需适配激光扫描系统；每室加入21 mL经无菌过滤的培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养。使用含3%胎牛血清（FBS）的培养基，添加1%青霉素-链霉素、9.4 g/L M-199、0.1 g/L L-谷氨酰胺、5.96 g/L HEPES、2.2 g/L碳酸氢钠和7 mL/L氢氧化钠。未使用的培养基可于冰箱中保存最多7天。
3. 每1–2天更换一次培养基。使用前将培养基在37 °C预热1小时。用连接吸力装置的无菌巴斯德吸管从单个培养室中吸出旧培养基，并立即补充新鲜的含添加剂培养基....

结果

图2 和 图3（n = 6）展示了化学处理（羊毛甾醇）对牛晶状体作用的研究结果。羊毛甾醇是晶状体中天然存在的一种甾醇，曾作为白内障潜在药物干预手段显示出一定前景²⁵，但该效果尚未得到证实²⁶。该研究设计包含培养基对照组和溶剂对照组。溶剂对照组（2-羟丙基-β-环糊精）与培养基对照组之间无显著差异（p > 0.05），表明实验组中任何潜在效应均不太可能由溶剂引起。处理组与对照组之间的BVD变异性亦无显著差异（p > 0.05）。这些结果与代谢活性检测结果一致（图3）。因此，该处理未对细胞引入显著毒性，也未显著影响晶状体的屈光性能（p > 0.05）。

图4 和 图5（n = 3）显示了BAK对晶.......

讨论

本实验方案的目的是在原代组织培养中直接评估化学物质或环境暴露对晶状体的影响。首先，分离晶状体并扫描其光学质量。防止污染和确保解剖质量至关重要。在培养期间定期对晶状体进行扫描，以持续监测其屈光功能相对于对照组或暴露前状态的变化。代谢活性检测用于评估暴露处理是否影响了细胞代谢，属于终点检测指标。这些是判断外源性物质或环境因素是否引起显著毒性（可能引发白内障）以及晶状体是否能够从该处理中恢复的关键步骤。

在各自培养室中对晶状体进行光学质量扫描。尽管晶状体可在其培养室中暴露于待测物质，但该方案的一个局限性在于晶状体对渗透压变化敏感，必须持续供给血清并维持在适当的培养基中。这为需要长时间暴露或在培养基中溶解度较差的处理方式带来了挑战²⁸。由于该检测采用视频成像技术，含有大量不溶性颗粒的悬液可能引起光散射，而这并不反映晶状体的实际性能。使用羊毛甾醇悬液获得代表性数据的实验条件表明，本方案可耐受某些低浓度水平的悬液。尽管先前有研究提示体外培养的牛晶状体反应可能与人晶状体反应相关²¹，但包括但不限于紫外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(2-羟丙基)-β-环糊精	Sigma-Aldrich	H107	粉末
1 L 瓶顶过滤系统	VWR	97066-204	完整组件，瓶顶式，0.2 μm
100 mm 培养皿	VWR	89022-320	可滑动，节省培养基型，无菌
12 孔板	Corning	353043	无菌，透明底
35 mm 培养皿	VWR	25373-041	Falcon 一次性培养皿，无菌，Corning
96 孔板	VWR	29442-072	无菌，透明底
阿玛蓝（刃天青）	Fischer Scientific	DAL1100	分子探针细胞活力检测试剂
苯扎氯铵溶液	Sigma-Aldrich	63249	50% 水溶液（H20）
生物安全柜
Cytation 5 酶标仪	BioTek	CYT5MPV	细胞成像多功能酶标仪
胎牛血清	ThermoFischer Scientific	12484028	经鉴定，热灭活，加拿大来源
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	用于细胞培养，粉末
培养箱
羊毛甾醇	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%，粉末
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich		用于细胞培养，粉末
培养基（M-199）	Sigma-Aldrich	M3769	改良型，含 Earle′s 盐，不含 L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和酚红，粉末，适用于细胞培养
巴斯德吸管			5 3/4''，带棉和不带棉
青霉素-链霉素	ThermoFischer Scientific	15140122	液体（10,000 U/mL）
磷酸盐缓冲液（PBS）			液体，无菌，适用于细胞培养
移液器吸头（100 µL，1,000 µL，5,000 µL）	VWR		无菌
ScanTox（晶状体激光扫描仪）	实验室自主研发	N/A	使用激光扫描晶状体以评估其光学质量
ScanTox 培养室	实验室自主研发	N/A	在检测和培养过程中固定牛晶状体
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761	用于细胞培养，粉末
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N，BioReagent，适用于细胞培养