用于评估眼内治疗辅料和药物毒性的器官培养系统

摘要

本实验方案的目的是评估晶状体在实验处理后其代谢活性和屈光功能的变化。

摘要

白内障是导致失明的主要原因，全球数以千万计的患者因此承受着巨大的负担。已知化学物质暴露等环境因素是引发白内障的明确原因。眼毒性测试可用于评估药物及其成分是否可能导致晶状体损伤，进而引发白内障，或有助于白内障的治疗。

体外 研究和 在体内 动物实验可用于在临床研究之前评估化学品的安全性。Draize试验——目前的 体内 用于眼部毒性和刺激性测试的标准因缺乏敏感性和客观的眼部毒性评估指标而受到批评。 体外 基于细胞的检测方法存在局限性，因为细胞培养无法适当地模拟完整且具有正常功能的晶状体。

此处所述方法具有高灵敏度 体外 替代动物实验的方法，旨在评估完整牛晶状体在细胞活性水平及整体屈光性能方面对处理的反应。非毒性试剂刃天青的代谢量与细胞活性水平成正比。晶状体激光扫描检测法可测量晶状体将入射光束折射至单一焦点的能力，误差最小化，直接关联其自然功能。该方法可用于确定晶状体的急性与延迟性变化，以及其在化学或环境暴露后的恢复情况。

引言

白内障是全球最普遍的致盲原因，影响超过2000万人^1,2。白内障通常由晶状体的年龄相关性改变引起，但也可能由外伤、遗传性疾病、其他疾病或毒性暴露诱发²。目前，白内障的治疗需要通过手术置换晶状体，这是一种昂贵且具有侵入性的操作，主要在发达国家可及。由于白内障造成的巨大负担，数十年来研究一直致力于白内障的预防以及非手术治疗方法的开发。在这两类研究中，眼科药物在临床前阶段的毒性、有效性和药代动力学测试至关重要。药物研发过程高度依赖动物实验所提供的信息。

当前眼毒性测试的标准方法 体内 是一种将待测化合物施加于活体动物结膜囊内的Draize试验。该试验受到广泛批评，主要涉及动物伦理问题，以及主观性强、重复性差和结果变异性大等问题。³此外，德莱兹试验没有任何组分能够直接监测受试物质对晶状体的影响。研究人员已投入大量精力开发替代方法 体外 模型⁴然而，目前尚无一种方法得到充分验证以取代德莱兹测试⁵同样，这些模型中的许多在直接应用于白内障及其他复杂病理情况时存在局限性⁶例如，将晶状体置于网格上评估其透明度的方法本质上具有主观性⁷细胞培养研究具有较高的可靠性且被广泛应用，但细胞单层的特性可能与原代组织培养存在差异⁸.

可以从动物的眼睛中完整地分离出晶状体，并进行培养以维持其原始结构和功能。在保持器官状态的同时，评估晶状体功能的一种有效方法是使用加拿大滑铁卢大学开发的激光扫描仪进行的晶状体激光扫描检测。该检测系统利用一系列激光投影来测量晶状体的光学质量或屈光性能。晶状体被置于特制的双区培养室中进行扫描，使激光束可以从下方穿过晶状体（图1A）。扫描仪内部固定的相机捕捉激光束穿过晶状体时在多个位置的成像。扫描仪软件计算出激光束在穿过晶状体后与中心轴相交的位置（后顶点距离，BVD），从而生成一系列测量数据，用以反映晶状体将光线聚焦于单一焦点的一致性程度（图1）。

晶状体的细胞特性（例如其细胞的紧密有序排列）有助于维持透明性并最小化光散射，从而使晶状体能够有效地聚焦光线⁹。该指标可用于判断某种化学物质对晶状体关键结构（如折射率梯度）的破坏程度，以及因诱导混浊而导致的功能受损程度。其他针对培养晶状体和晶状体泡反应的研究表明，光散射主要源于结构变化而非代谢变化，晶状体脂质和蛋白质的破坏可能影响折射率，从而导致散射增加^10,11。

透镜激光扫描仪可与代谢试剂联合用于检测细胞毒性的生化指标。刃天青是一种对细胞无毒的化学试剂，可被活性细胞代谢，生成具有可测荧光的还原产物（试卤灵）¹²。透镜组织几乎不含细胞器，仅在前部上皮层及浅层皮质纤维细胞中富含代谢活跃的线粒体，以满足透镜的能量需求^13,14。在细胞水平上对透镜造成的损伤可能破坏其代谢活动，且通常早于致病性结构改变和白内障的发生¹⁵。

本方法旨在评估外源性物质和环境暴露对晶状体的影响，这些影响可能与白内障的发生有关。该方案包括两个实验，利用培养的牛晶状体来评估处理因素的作用。此方法的优势在于，它能够同时从细胞水平和功能水平评价晶状体作为原始组织对处理的反应。与其它常用方法相比，该方法对晶状体的评估更为敏感和客观^16,17,18。

该模型已成功用于评估多种暴露因素的影响，包括表面活性剂、消费品、醇类以及紫外线辐射^17,19,20。在培养的晶状体中，毒性暴露后光学质量的变化始终存在²¹。该方法能够长期维持晶状体培养，非常适合监测化合物可能产生的延迟效应，以及晶状体在损伤或白内障诱导后的恢复情况^22,23。应用本方案所得结果可用于减少眼科产品开发过程中对动物实验的依赖。

方案

所有实验方案均按照滑铁卢大学关于使用动物组织进行研究的伦理政策执行。本研究所用的牛眼来自屠宰场，取自死亡后数小时内非乳牛品种的牛，并立即进行解剖，从获取眼球到完成解剖的过程最长不超过8小时。为保持无菌状态和解剖质量，眼球应尽快解剖。培养基需配制至pH值为7.4，并在添加FBS²¹前进行无菌过滤。所有操作均在无菌条件下进行，所用材料和设备来源见材料表。

1. 牛晶状体培养

1. 通过从巩膜上剥离眼外肌和组织，移除眼球后半部分及玻璃体，连同晶状体一起移除虹膜和睫状体，然后切断悬韧带附着，最终切割的位置应使晶状体落入盛有培养基的培养室中，从而完成晶状体的解剖。
2. 将解剖后的晶状体置于定制的培养室中进行培养，培养室底部需适配激光扫描系统；每室加入21 mL经无菌过滤的培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养。使用含3%胎牛血清（FBS）的培养基，添加1%青霉素-链霉素、9.4 g/L M-199、0.1 g/L L-谷氨酰胺、5.96 g/L HEPES、2.2 g/L碳酸氢钠和7 mL/L氢氧化钠。未使用的培养基可于冰箱中保存最多7天。
3. 每1–2天更换一次培养基。使用前将培养基在37 °C预热1小时。用连接吸力装置的无菌巴斯德吸管从单个培养室中吸出旧培养基，并立即补充新鲜的含添加剂培养基。
4. 解剖后继续培养晶状体48小时，以使物理损伤充分显现。在将晶状体用于实验前，按照第4节方法检查并扫描其光学质量。
   ​注意：晶状体在激光扫描分析前需呈朝下放置。

2. 对照实验步骤

1. 配制含有适当浓度溶解助剂的溶液，该溶解助剂需与目标化学化合物及培养基相容。
2. 通过将溶解助剂加入补充培养基中制备溶剂对照溶液。实验前将对照溶液在37 °C下预热1小时。
3. 使用连接负压的巴斯德吸管，从对照组晶状体培养室中吸除培养基，并用对照溶液重新填充。如需要，以三复孔形式进行此操作。
   注意：为完全覆盖处于前部朝上位置的晶状体，每个培养室至少需要7 mL溶液。本研究中对照组的条件包括：21 mL未处理培养基对照、21 mL溶剂对照培养基，以及7 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
4. 将晶状体在对照培养基中培养2天后，根据第1节所述方法更换为新鲜对照培养基。对于短期暴露实验，需先从培养室中吸除对照溶液，并用未补充添加剂的培养基至少冲洗三次，然后继续按照第1.0节所述晶状体培养方案进行操作。
5. 在评估光学质量前，将晶状体置于37 °C、5% CO₂的培养箱中至少适应3.5小时。

3. 暴露程序

1. 配制含有适当浓度助溶剂的溶液，该助溶剂需与目标化合物及培养基相容。将化合物与助溶剂混合，并在必要时给予足够的相互作用时间。
   注：本研究中使用2-羟丙基-β-环糊精（2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin）以提高羊毛甾醇（0.033 g/L）在培养基中的溶解度。苯扎氯铵（BAK 0.0075%）溶液使用PBS配制。
2. 将溶解后的化合物加入培养基中。配制总体积足够为所有晶状体样本提供21 mL培养基的溶液。实验前将实验用培养基在37 °C下预热1小时。
3. 使用连接负压的巴斯德吸管从晶状体培养室中吸除原有培养基。立即用待测溶液补充培养室。在暴露一定时间后，更换为添加了成分的培养基；若需要，可先进行冲洗。如需，该步骤应以三个重复样本进行。
   注：本研究中的测试条件为21 mL含羊毛甾醇的培养基和7 mL BAK 0.0075%溶液。至少需要7 mL的体积才能完全覆盖晶状体。此时，晶状体必须首先调整为前表面朝上。可使用巴斯德吸管利用周围部分培养基在培养室中制造液流，以重新定位晶状体。
4. 将晶状体放回培养箱中，至少静置3.5小时以适应环境，然后再评估其光学质量。
   ​注：在进行激光扫描检测前，晶状体需调整为前表面朝下。

4. 光学质量检测（镜头激光扫描仪）

1. 使用步骤 3.3 中的技术，确保晶状体在培养室中朝向正确，前表面朝下，并在视觉上保持水平；如有需要，可调整晶状体的位置。
   注意：此位置可确保入射光束经培养室底部向上反射，并从前表面到后表面穿过晶状体。
2. 将晶状体培养室放入激光扫描仪中，使培养室底座上的卡槽与载物台插销对齐。
3. 选择需要扫描的晶状体和扫描点，右键单击扫描晶状体，等待扫描仪提示寻找并校准光束。在晶状体后方选择相距较远的光束起始点和终止点。使用扫描仪软件中的粗调和微调按钮以及扫描仪上的调节旋钮，确保中心光束对准。当光束对准后，单击校准，并输入合适的径向步数和光束间距。
   注意：本研究中使用牛晶状体，径向步数和光束间距分别设置为10 步和0.5 mm。扫描仪执行的首次扫描用于校准激光扫描系统。此校准仅需一次，后续所有晶状体扫描可在对准后直接进行。
4. 扫描仪校准完成后，单击扫描。等待晶状体扫描完成后生成沿一个轴向的后顶点距离（BVD）均值、标准差和误差值，并设定光束范围。将范围从光束离开晶状体的位置设置到目标终点，在排除明显干扰的前提下，尽可能选择晶状体后方的最大距离。
5. 使用生成的图表查看每束光的后顶点距离。
   ​注意：应排除穿过晶状体缝合线的光束。若要排除某束光，请使用屏幕上的图例，右键单击特定光束并选择排除。
6. 手动将扫描仪内培养室底座旋转 90°，使沿晶状体前表面的第二次扫描方向与前一次扫描垂直。按照步骤 4.3 所述确保中心光束对准，然后对晶状体进行扫描。

5. 代谢活性检测（刃天青）

1. 准备不含FBS的培养基，在37 °C下预热1小时。用未添加补充物的培养基配制50 mL的8%刃天青试剂。
   注意：配制50 mL足以填充12孔板中的所有孔。溶液应在避光条件下于不透光容器中无菌配制，因为刃天青对光敏感。
2. 向透明底、无菌的12孔板的每个孔中加入3.8 mL的8%刃天青溶液，以完全覆盖晶状体。
3. 使用无菌金属刮勺小心地从后表面下方取出晶状体，并用巴斯德移液管以少量未添加补充物的培养基冲洗晶状体。将晶状体分别放入各孔中。
4. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育5小时。孵育结束后，用金属刮勺从孔中取出晶状体，并放入动物废弃物处理容器中。从每个孔中转移100 µL样品至无菌透明底的96孔板中。
   注意：可多次使用代谢活性检测对晶状体进行评估。若需重复检测，应将晶状体放回培养室并更换新鲜培养基继续孵育。建议在完成所有扫描后进行代谢活性检测，因为染料可能影响BVD测量结果。
5. 使用荧光酶标仪测定100 µL样品的终点荧光值，激发波长和发射波长分别设定为560 nm和590 nm。

6. 数据分析

1. 对于光学质量检测，计算每个时间点两次扫描所获得的软件测定BVD误差值²⁴的平均值。对所有镜片及所有扫描点均执行此计算。
2. 对于代谢活性检测，收集酶标仪生成的终点相对荧光值。通过将每个扫描点所有对照组数值的平均值设为100%，对数据进行归一化处理。将每片镜片的活性计算为该扫描点对照组平均值的百分比。
3. 对所有实验组进行正态性检验。若数据符合正态分布，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）分析对照组与实验组镜片之间的BVD误差差异，并进行Tukey事后多重比较检验。对于代谢活性数据，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Dunnett事后检验。

结果

图2 和 图3（n = 6）展示了化学处理（羊毛甾醇）对牛晶状体作用的研究结果。羊毛甾醇是晶状体中天然存在的一种甾醇，曾作为白内障潜在药物干预手段显示出一定前景²⁵，但该效果尚未得到证实²⁶。该研究设计包含培养基对照组和溶剂对照组。溶剂对照组（2-羟丙基-β-环糊精）与培养基对照组之间无显著差异（p > 0.05），表明实验组中任何潜在效应均不太可能由溶剂引起。处理组与对照组之间的BVD变异性亦无显著差异（p > 0.05）。这些结果与代谢活性检测结果一致（图3）。因此，该处理未对细胞引入显著毒性，也未显著影响晶状体的屈光性能（p > 0.05）。

图4 和 图5（n = 3）显示了BAK对晶...

讨论

本实验方案的目的是在原代组织培养中直接评估化学物质或环境暴露对晶状体的影响。首先，分离晶状体并扫描其光学质量。防止污染和确保解剖质量至关重要。在培养期间定期对晶状体进行扫描，以持续监测其屈光功能相对于对照组或暴露前状态的变化。代谢活性检测用于评估暴露处理是否影响了细胞代谢，属于终点检测指标。这些是判断外源性物质或环境因素是否引起显著毒性（可能引发白内障）以及晶状体是否能够从该处理中恢复的关键步骤。

在各自培养室中对晶状体进行光学质量扫描。尽管晶状体可在其培养室中暴露于待测物质，但该方案的一个局限性在于晶状体对渗透压变化敏感，必须持续供给血清并维持在适当的培养基中。这为需要长时间暴露或在培养基中溶解度较差的处理方式带来了挑战²⁸。由于该检测采用视频成像技术，含有大量不溶性颗粒的悬液可能引起光散射，而这并不反映晶状体的实际性能。使用羊毛甾醇悬液获得代表性数据的实验条件表明，本方案可耐受某些低浓度水平的悬液。尽管先前有研究提示体外培养的牛晶状体反应可能与人晶状体反应相关²¹，但包括但不限于紫外...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(2-羟丙基)-β-环糊精	Sigma-Aldrich	H107	粉末
1 L 瓶顶过滤系统	VWR	97066-204	完整组件，瓶顶式，0.2 μm
100 mm 培养皿	VWR	89022-320	可滑动，节省培养基型，无菌
12 孔板	Corning	353043	无菌，透明底
35 mm 培养皿	VWR	25373-041	Falcon 一次性培养皿，无菌，Corning
96 孔板	VWR	29442-072	无菌，透明底
阿玛蓝（刃天青）	Fischer Scientific	DAL1100	分子探针细胞活力检测试剂
苯扎氯铵溶液	Sigma-Aldrich	63249	50% 水溶液（H20）
生物安全柜
Cytation 5 酶标仪	BioTek	CYT5MPV	细胞成像多功能酶标仪
胎牛血清	ThermoFischer Scientific	12484028	经鉴定，热灭活，加拿大来源
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	用于细胞培养，粉末
培养箱
羊毛甾醇	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%，粉末
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich		用于细胞培养，粉末
培养基（M-199）	Sigma-Aldrich	M3769	改良型，含 Earle′s 盐，不含 L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和酚红，粉末，适用于细胞培养
巴斯德吸管			5 3/4''，带棉和不带棉
青霉素-链霉素	ThermoFischer Scientific	15140122	液体（10,000 U/mL）
磷酸盐缓冲液（PBS）			液体，无菌，适用于细胞培养
移液器吸头（100 µL，1,000 µL，5,000 µL）	VWR		无菌
ScanTox（晶状体激光扫描仪）	实验室自主研发	N/A	使用激光扫描晶状体以评估其光学质量
ScanTox 培养室	实验室自主研发	N/A	在检测和培养过程中固定牛晶状体
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761	用于细胞培养，粉末
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N，BioReagent，适用于细胞培养