鸡胚胎重组肢体实验：解析形态发生、模式形成及细胞分化早期过程

摘要

重组肢体是一种强大的实验模型，可用于研究在胚胎信号影响下细胞分化及模式形成的过程。本方案介绍了一种利用鸡肢芽中胚层细胞生成重组肢体的详细方法，该方法可适用于从不同生物体获得的其他细胞类型。

摘要

细胞分化是一种精细调控的细胞命运决定过程，在发育组织和器官形成过程中导致不同特化细胞类型的产生。该过程在成体阶段仍被主动维持。细胞分化是器官发育和稳态维持过程中持续进行的事件。理解细胞分化的早期步骤对于认识形态发生等其他复杂过程至关重要。因此，重组鸡胚肢体是一种实验模型，可在胚胎模式化信号作用下研究细胞分化和模式形成。该实验模型模拟了体内环境，将重聚集的细胞与来自早期肢芽的外胚层覆盖物组装在一起。随后，将外胚层转移并植入鸡胚受体中，以支持其进一步发育。该实验最初主要用于评估中胚层肢芽细胞，但也可应用于其他生物体的干细胞或前体细胞。

引言

脊椎动物的肢体是研究细胞分化、细胞增殖、细胞死亡、模式形成以及形态发生的一个强大模型^1,2。在发育过程中，肢体以侧板中胚层来源的细胞向外突出形成隆起的方式出现¹。肢芽由中央的中胚层细胞核心及其外层覆盖的外胚层组成。从这一早期结构出发，最终发育形成完整且结构良好的肢体。肢芽出现后，可识别出三个轴向：（1）近远轴（[PD] 从肩部到手指），（2）背腹轴（[DV] 从手背到手掌），以及（3）前后轴（[AP] 从拇指到小指）。近远轴的发育依赖于顶外胚层嵴（AER），即位于肢芽远端尖端的一类特化的外胚层结构。AER 对肢体的向外生长、细胞存活维持、增殖以及接受信号细胞的未分化状态至关重要^2,3。另一方面，极化活动区（ZPA）调控前后轴的模式形成⁴，而背部外胚层则控制背腹轴的模式建立^7,8。三维模式形成的整合意味着这三个轴之间存在复杂的信号串扰⁵。尽管目前已了解肢体发育过程中的分子通路，但关于调控模式形成和正常向外生长以构建完整肢体的机制，仍有许多问题尚....

方案

本研究已通过墨西哥国立自治大学（UNAM，墨西哥城，墨西哥）生物医学研究研究所实验动物护理与使用机构审查委员会的审查和批准。本方案总体步骤的示意图流程图见图1A。

1. 胚胎孵育与活力测定

1. 将受精的鸡卵在38 °C、相对湿度60%的条件下孵育约三天半，直至达到22 HH期（根据Hamilton和Hamburger，1951年）¹⁶。
   注意：新鲜受精的鸡卵可在15 °C下保存最多一周。
   1. 孵育受精卵时，将卵垂直放置于加湿的孵育箱中，尖端朝下。孵育期间需定期旋转卵，以防止发育中的胚胎粘附于壳膜上。
      注意：受精的母鸡蛋可从本地农场获取。通常使用受精的白来航鸡卵，以避免晚期胚胎羽毛出现色素沉着。建议分别孵育足够数量的卵，以获取三种结构：（1）肢芽中胚层细胞，（2）肢芽外胚层，以及（3）用于移植RL的供体胚胎。
2. 孵育三天半后，将卵从孵育箱中取出，用70%乙醇擦拭，并静置晾干。
3. 通过透射光照法（candling）识别发育中的胚胎，观察血管并定位胚胎位置。剔除无胚胎的卵。
   ​注意：此时应分配卵用于获取中胚层细胞、外胚层以及作为RL移植的宿主。

结果

识别成功构建的重组肢体
移植后，将经过操作的胚胎放回培养箱中，以使重组肢体（RL）发育。培养时间根据实验需求而定。然而，在移植后12小时，重组肢体即可被清晰识别。为判断移植是否成功，可通过观察重组肢体是否作为牢固附着于供体胚胎中胚层壁上的突起结构来确认（图2A）。相反，若细胞活力不足或移植失败，则重组肢体将从中胚层壁脱离，或呈现粗糙的形态（图2B）。

重组肢体的形态学与模式形成分析
进行形态学分析时，采用阿尔新蓝（Alcian blue）对重组肢体（RL）进行染色¹⁷，以观察骨骼结构的形成及其模式分布。建议对供体胚胎的整个躯干进行染色，以避免在操作过程中遗漏重组肢体（图3A）。此外，在透明化处理重组肢体之前，可在乙醇溶液中获取图像，用于观察重组肢体的形态或进行定量测量（

讨论

通常，RL 技术可分为五个步骤：（1）胚胎孵育，（2）获取肢芽中胚层细胞以填充外胚层，（3）获取外胚层，（4）将中胚层细胞组装至外胚层囊内，（5）将填充后的外胚层移植至宿主胚胎中。RL 技术的主要局限在于其耗时长且步骤繁琐，过程中存在多个关键环节，需要耐心操作才能顺利完成。为成功实施该方案，必须明确识别关键操作节点。在获取中胚层细胞的过程中，细胞的完整性和活性至关重要，细胞死亡将阻碍 RL 的正常发育。同理，正确操作外胚层是确保中胚层与外胚层细胞之间相互作用的前提。在填充外胚层时，中胚层细胞必须尽可能贴近顶外胚层嵴（AER）下方的远端外胚层。无论是获取中胚层还是外胚层，供体胚胎的发育阶段均极为关键。需注意，中胚层细胞会因其发育阶段不同而表现出差异性反应。然而，发育阶段可根据实验需求自由选择，但为便于获取外胚层并维持细胞完整性及信号传导，通常建议维持在 Hamburger-Hamilton 22 期（HH 22 期）。最后，良好的移植物植入与固定对于确保 RL 与胚胎体壁的正确整合及其后续发育至关重要。

Edgar Zwilling 于1964年首次报道了RL系统

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿尔新蓝 8GX	Sigma	A5268
斜缝刀片	Alcon	2.75mm DB
钝头镊子	Fine Science Tools	11052-10
IV 型胶原酶	Gibco	1704-019
高糖 DMEM	Sigma	D5796
孵蛋器	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
胎牛血清	Gibco	16000069
精细手术镊	Fine Science Tools	9115-10
汉克斯平衡盐溶液	Sigma	H6648
微量离心机	Eppendorf	5417R
微量移液器	NA	NA
钯丝	GoodFellow	7440 05-3
培养皿	Nest	705001
移液管	crmglobe	PF1016
体视显微镜	Zeiss	Stemi DV4
胶带	NA	NA
猪胰蛋白酶	Merck	9002 07-7
钨针	GoodFellow	E74-15096/01