鸡胚胎重组肢体实验：解析形态发生、模式形成及细胞分化早期过程

摘要

重组肢体是一种强大的实验模型，可用于研究在胚胎信号影响下细胞分化及模式形成的过程。本方案介绍了一种利用鸡肢芽中胚层细胞生成重组肢体的详细方法，该方法可适用于从不同生物体获得的其他细胞类型。

摘要

细胞分化是一种精细调控的细胞命运决定过程，在发育组织和器官形成过程中导致不同特化细胞类型的产生。该过程在成体阶段仍被主动维持。细胞分化是器官发育和稳态维持过程中持续进行的事件。理解细胞分化的早期步骤对于认识形态发生等其他复杂过程至关重要。因此，重组鸡胚肢体是一种实验模型，可在胚胎模式化信号作用下研究细胞分化和模式形成。该实验模型模拟了体内环境，将重聚集的细胞与来自早期肢芽的外胚层覆盖物组装在一起。随后，将外胚层转移并植入鸡胚受体中，以支持其进一步发育。该实验最初主要用于评估中胚层肢芽细胞，但也可应用于其他生物体的干细胞或前体细胞。

引言

脊椎动物的肢体是研究细胞分化、细胞增殖、细胞死亡、模式形成以及形态发生的一个强大模型^1,2。在发育过程中，肢体以侧板中胚层来源的细胞向外突出形成隆起的方式出现¹。肢芽由中央的中胚层细胞核心及其外层覆盖的外胚层组成。从这一早期结构出发，最终发育形成完整且结构良好的肢体。肢芽出现后，可识别出三个轴向：（1）近远轴（[PD] 从肩部到手指），（2）背腹轴（[DV] 从手背到手掌），以及（3）前后轴（[AP] 从拇指到小指）。近远轴的发育依赖于顶外胚层嵴（AER），即位于肢芽远端尖端的一类特化的外胚层结构。AER 对肢体的向外生长、细胞存活维持、增殖以及接受信号细胞的未分化状态至关重要^2,3。另一方面，极化活动区（ZPA）调控前后轴的模式形成⁴，而背部外胚层则控制背腹轴的模式建立^7,8。三维模式形成的整合意味着这三个轴之间存在复杂的信号串扰⁵。尽管目前已了解肢体发育过程中的分子通路，但关于调控模式形成和正常向外生长以构建完整肢体的机制，仍有许多问题尚未解决。

Edgar Zwilling 于1964年开发了重组肢体（recombinant limb, RL）系统，用于研究发育中肢体的间充质细胞与外胚层之间的相互作用⁶。RL 系统将解离后重聚集的肢芽中胚层组装到胚胎肢部外胚层中，并移植至供体鸡胚的背部。外胚层提供的信号以时空特异性的方式诱导分化基因和模式形成基因的表达，从而促使类肢体结构的形成，该结构可重现肢体发育过程中的细胞程序^7,8,9。

RL 模型对于理解肢体组分的特性以及中胚层与外胚层细胞之间的相互作用具有重要价值⁶。RL 可被定义为通过实验手段将肢芽中胚层细胞组装或重组于外胚层包被内所形成的类似肢体的结构⁶。RL 的形态发生依赖于中胚层细胞（或其他类型细胞）的特性，这些细胞能够响应外胚层的模式化信号。该实验系统的一个优势在于其多功能性。这一特性使得可通过改变中胚层细胞的来源，例如来自不同发育阶段的细胞、来自肢体不同位置的细胞，或完整（未解离）细胞与重聚集细胞，从而构建多种组合^7,8,9,10。另一个例子是可采用非鸡来源的胚胎外胚层，例如龟¹¹、鹌鹑或小鼠¹²的外胚层。

从进化的角度而言，RL技术有助于研究肢体发育以及肢芽间充质细胞与外胚层细胞之间的相互作用。该技术还可利用胚胎外胚层提供的信号，分析不同来源的前体细胞分化形成类似肢体结构的潜能。^12,13,14与……相反 体外 在培养条件下，RL 可通过解读发育中肢体发出的胚胎信号，评估细胞群体的分化潜能和形态发生能力^9,15.

本方案提供了利用重新聚集的中胚层肢芽细胞成功进行肢体再生实验的逐步操作指南，从而为采用不同来源的重新聚集细胞或不同外胚层来源进行该方案的优化提供了可能。

方案

本研究已通过墨西哥国立自治大学（UNAM，墨西哥城，墨西哥）生物医学研究研究所实验动物护理与使用机构审查委员会的审查和批准。本方案总体步骤的示意图流程图见图1A。

1. 胚胎孵育与活力测定

1. 将受精的鸡卵在38 °C、相对湿度60%的条件下孵育约三天半，直至达到22 HH期（根据Hamilton和Hamburger，1951年）¹⁶。
   注意：新鲜受精的鸡卵可在15 °C下保存最多一周。
   1. 孵育受精卵时，将卵垂直放置于加湿的孵育箱中，尖端朝下。孵育期间需定期旋转卵，以防止发育中的胚胎粘附于壳膜上。
      注意：受精的母鸡蛋可从本地农场获取。通常使用受精的白来航鸡卵，以避免晚期胚胎羽毛出现色素沉着。建议分别孵育足够数量的卵，以获取三种结构：（1）肢芽中胚层细胞，（2）肢芽外胚层，以及（3）用于移植RL的供体胚胎。
2. 孵育三天半后，将卵从孵育箱中取出，用70%乙醇擦拭，并静置晾干。
3. 通过透射光照法（candling）识别发育中的胚胎，观察血管并定位胚胎位置。剔除无胚胎的卵。
   ​注意：此时应分配卵用于获取中胚层细胞、外胚层以及作为RL移植的宿主。

2. 获取肢芽中胚层细胞以填充外胚层

注意：在开始操作之前，强烈建议使用70%乙醇溶液擦拭工作区域、显微镜及所有器械，进行消毒。

1. 用钝头镊子的末端轻敲蛋壳的钝端，打开一个窗口，并用镊子移除约 1 cm × 1 cm 的蛋壳。
2. 将鸡蛋转移至塑料或纸板支架中，并逐一放置于体视显微镜下。识别气室膜，然后在无血管分布的区域戳一个小孔，借助精细外科镊子拉起并去除该区域的膜。
   注意：打开蛋壳窗口后，气室膜表现为白色不透明的膜，可据此进行识别。
   1. 移除任何可能接触胚胎的小块蛋壳。
      注意：在启动实验方案前，请确认胚胎处于 Hamburger-Hamilton 22 期。若胚胎处于更早阶段，可在用胶带封闭蛋壳窗口后将其放回培养箱继续培养。
3. 使用精细外科镊子撕开羊膜，完全打开羊膜腔（参见材料表）。
   注意：羊膜为透明薄膜，紧贴胚胎表面，内部充满羊水，可通过此特征进行识别。
4. 用一对钝头镊子小心地将胚胎从蛋中取出，转移至含有冰上预冷的磷酸盐缓冲液（1× PBS）的无菌培养皿中。对剩余鸡蛋重复此步骤。通常仅需约 8–10 个胚胎即可获得足够的中胚层细胞。
5. 用冰上预冷的 1× PBS 清洗胚胎一次，在体视显微镜下（参见材料表）去除残留的膜组织，定位后肢芽。
   注意：肢芽是沿胚胎前后轴分布的圆形突起结构，位于体侧。后肢芽的位置比前肢芽更靠后。
6. 将胚胎保留在洁净的 1× PBS 中，使用一对精细外科镊子纵向剪开每个后肢芽。切割位置应尽可能靠近胚胎体侧，以完整分离整个后肢芽。对剩余胚胎重复此操作。
7. 使用塑料移液管将肢芽转移至一个空的 1.5 mL 微量离心管中。
8. 用移液器吸头吸除多余的 1× PBS，并替换为 500 µL 的 0.5% 胰蛋白酶溶液（参见材料表）。将肢芽置于恒温金属浴中，37 °C 孵育 7 分钟。
9. 吸除胰蛋白酶溶液，替换为 500 µL 含 2 mg/mL IV 型胶原酶的汉克平衡盐溶液（参见材料表），然后在恒温金属浴中 37 °C 孵育 8 分钟。
   注意：胰蛋白酶孵育可使外胚层轻微脱离，而胶原酶则用于解离中胚层细胞。
10. 孵育结束后，尽可能吸除胶原酶溶液，并加入 1 mL 冷的含高糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-HG），并补充 10% 胎牛血清（FBS），以终止酶反应。轻轻吹打混合液约 10 次。
11. 使用 70 µm 细胞滤网过滤细胞悬液，以去除外胚层组织。
    注意：过滤过程同时可去除未完全消化的肢芽，最终获得单细胞悬液。
12. 过滤后，再次吹打悬液 5–10 次，于室温下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
13. 加入 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM-HG 培养基以洗涤残留的胶原酶。于室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
14. 小心吸弃上清液，再加入 1 mL 新鲜的含 10% FBS 的 DMEM-HG 培养基，注意不要扰动管底的细胞。
15. 将细胞在恒温金属浴中 37 °C 孵育 1–1.5 小时，使其形成致密的细胞团（重聚集）。
    ​注意：在中胚层细胞形成细胞团的同时，可同步获取肢芽外胚层组织。

3. 获取肢芽外胚层

1. 分别对另外22个选定用于获取外胚层的HH鸡胚重复第2节中的步骤1-6。
   注意：用于此目的的胚胎数量与最终所需的再聚集肢芽（RL）数量成正比。外胚层与RL的比例为2:1较为合适。
2. 获取后肢芽后，使用塑料移液管将其转移至一个空的微量离心管中。去除多余的1×PBS，并加入500 µL含0.5%胰蛋白酶的无菌1×PBS溶液。将混合物置于恒温金属块中，在37 °C下孵育30分钟。
3. 酶消化完成后，将含有肢芽的胰蛋白酶溶液转移至无菌培养皿中。
4. 尽可能使用微量移液器去除多余的胰蛋白酶；用冰上预冷的含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS冲洗培养皿，直至完全覆盖所有肢芽。
   注意：FBS可用马血清替代。
5. 在体视显微镜下识别肢芽；将外胚层识别为从肢芽中胚层细胞轻微分离的透明膜状结构（图1B）。
6. 用精细手术镊夹住肢芽最靠近近端的部分，同时用另一把镊子小心剥离并分离外胚层。
   注意：由于中胚层细胞容易聚集并附着于外胚层，导致外胚层变得粘连，因此获取外胚层可能较为困难。建议持续丢弃中胚层细胞，以确保培养皿中仅保留外胚层。
7. 将外胚层保存在冰上预冷的含10% FBS的1×PBS溶液中。
   ​注意：如果再聚集的中胚层尚未准备好，外胚层可在4 °C下短期保存。但建议尽量协调好细胞团块的孵育时间与外胚层获取的时间。

4. 在外胚层覆盖层内组装中胚层细胞

注意：为此，需要在含有成团的中胚层细胞的无菌 1× PBS-10% FBS 溶液中，将空的外胚层置于培养皿中。

1. 形成沉淀后（参见第2节），用移液器从离心管中弃去约600 µL培养基。
2. 使用移液器吸头小心地将沉淀从管底剥离，避免压碎或破坏沉淀。
3. 当沉淀完全从管底脱离后，将离心管倒置，将沉淀转移至含有空的外胚层的培养皿中（图1C）。
4. 借助一对精细的外科镊子切割一小块沉淀，并将其尽可能靠近外胚层放置。
5. 用外科镊子像打开一个袋子一样打开外胚层，将沉淀小块尽可能紧密地放入外胚层覆盖物内。根据需要重复此步骤处理多个RL（图1D）。
   注意：应逐个切割沉淀小块，并及时填充外胚层，以保持1x PBS-10% FBS溶液的清洁。沉淀的大小需与每个外胚层相匹配。
6. 在室温下让外胚层和中胚层共同愈合约30分钟，然后将其移植到胚胎宿主中。丢弃未使用的外胚层和中胚层。

5. 将填充的外胚层移植到宿主胚胎中
 

注意：在移植外胚层之前，将两台体视显微镜并排放置在实验台上，一台用于胚胎操作和RL移植；另一台用于保持已填充的外胚层处于可转移至胚胎的准备状态。

1. 选择所需数量的受精卵用于移植填充的外胚层。
2. 使用钝头镊子的末端轻敲22 HH期宿主胚胎的蛋壳，打开一个窗口。识别气室膜，并用精细手术镊将其完全去除。
3. 在前肢附近切开羊膜囊，暴露胚胎右侧体壁。仅切开完成操作所需的最小范围。
4. 根据前肢位置，用钨针（见材料表）在体节区域划伤，伤口长度为2-3个体节，轻微损伤中胚层至出现出血。
5. 将一个填充的外胚层（RL）单独移植入鸡胚，并将重组肢体的基部置于体节伤口处。
   注意：RL的移植可使用塑料移液器或带斜口的刀片完成。
6. 用两根直径为0.025 mm、长度为0.5–1 mm的钯丝（见材料表）将RL固定到位。将RL的基部与伤口对齐，确保其附着于宿主胚胎的体壁并实现血管化（图1E）。
7. 用胶带密封窗口，将鸡蛋放回孵育箱。在预定的时间点收集胚胎进行分析。

结果

识别成功构建的重组肢体
移植后，将经过操作的胚胎放回培养箱中，以使重组肢体（RL）发育。培养时间根据实验需求而定。然而，在移植12小时后，重组肢体即可被清晰识别。为判断移植是否成功，可通过观察重组肢体是否形成一个牢固附着于供体胚胎中胚层壁上的突起结构来确认（图2A）。相反，若细胞活力不足或移植失败，则重组肢体将从中胚层壁脱落，或呈现粗糙的形态（图2B）。

重组肢体的形态学与图式形成分析
进行形态学分析时，采用阿新蓝（Alcian blue）对重组肢体（RL）进行染色¹⁷，以观察骨骼结构的形成及其图式分布。建议对供体胚胎的整个躯干进行染色，以避免在操作过程中遗漏重组肢体（图3A）。此外，在透明化处理重组肢体之前，可在乙醇溶液中拍摄图像，用于观察重组肢体的形态或进行定量测量（

讨论

通常，RL 技术可分为五个步骤：（1）胚胎孵育，（2）获取肢芽中胚层细胞以填充外胚层，（3）获取外胚层，（4）将中胚层细胞组装至外胚层囊内，（5）将填充后的外胚层移植至宿主胚胎中。RL 技术的主要局限在于其耗时长且步骤繁琐，过程中存在多个关键环节，需要耐心操作才能顺利完成。为成功实施该方案，必须明确识别关键操作节点。在获取中胚层细胞的过程中，细胞的完整性和活性至关重要，细胞死亡将阻碍 RL 的正常发育。同理，正确操作外胚层是确保中胚层与外胚层细胞之间相互作用的前提。在填充外胚层时，中胚层细胞必须尽可能贴近顶外胚层嵴（AER）下方的远端外胚层。无论是获取中胚层还是外胚层，供体胚胎的发育阶段均极为关键。需注意，中胚层细胞会因其发育阶段不同而表现出差异性反应。然而，发育阶段可根据实验需求自由选择，但为便于获取外胚层并维持细胞完整性及信号传导，通常建议维持在 Hamburger-Hamilton 22 期（HH 22 期）。最后，良好的移植物植入与固定对于确保 RL 与胚胎体壁的正确整合及其后续发育至关重要。

Edgar Zwilling 于1964年首次报道了RL系统

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿尔新蓝 8GX	Sigma	A5268
斜缝刀片	Alcon	2.75mm DB
钝头镊子	Fine Science Tools	11052-10
IV 型胶原酶	Gibco	1704-019
高糖 DMEM	Sigma	D5796
孵蛋器	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
胎牛血清	Gibco	16000069
精细手术镊	Fine Science Tools	9115-10
汉克斯平衡盐溶液	Sigma	H6648
微量离心机	Eppendorf	5417R
微量移液器	NA	NA
钯丝	GoodFellow	7440 05-3
培养皿	Nest	705001
移液管	crmglobe	PF1016
体视显微镜	Zeiss	Stemi DV4
胶带	NA	NA
猪胰蛋白酶	Merck	9002 07-7
钨针	GoodFellow	E74-15096/01